Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Массовое выращивание и молекулярные исследования насекомых-вредителей Tortricidae

2.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63737

⸱

25 марта 2022 г.

 ,  ,  , 
1Department of Applied Biological Science, Tokyo University of Agriculture and Technology

В этой статье

Краткое содержание

Настоящий протокол описывает метод выращивания насекомых-вредителей в лабораториях. Процедуры различения пола насекомых и извлечения нуклеиновых кислот для высокопроизводительного секвенирования установлены с использованием двух вредителей тортрицидов.

Аннотация

Tortricidae (Lepidoptera), широко известные как tortrix или листовертки, включают в себя множество сельскохозяйственных и лесных вредителей, которые вызывают серьезные сельскохозяйственные потери. Чтобы понять биологию таких мотыльков-вредителей, фундаментальные методы были очень востребованы. Здесь методы массового выращивания, наблюдений и молекулярных исследований разрабатываются с использованием двух чайных тортриксов, Homona magnanima и Adoxophyes honmai (Чешуекрылые: Tortricidae). Насекомые массово выращивались с помощью нарезанной искусственной диеты и поддерживались путем инбридинга в течение более 100 поколений, учитывая их биологические особенности. Насекомые имеют различные половые диморфизмы; следовательно, трудно различить пол на развивающихся стадиях, что помешало последующим анализам. В настоящей работе подчеркивается, что пол личинок тортрицидов может быть определен путем наблюдения за яичками или молочно-уксусным окрашиванием орцеина для визуализации женско-специфической W-хромосомы. Кроме того, используя методы определения пола, настоящее исследование позволило экстрагировать нуклеиновые кислоты из эмбрионов, определенных полом, и применять их для секвенирования с высокой пропускной способностью. Эти советы применимы для других насекомых-вредителей и облегчат дальнейшие морфологические и генетические исследования.

Введение

Чешуекрылые насекомые составляют более 10% всех описанных живых видов1, а некоторые виды таксонов наносят серьезный ущерб растениям и серьезные сельскохозяйственные потери 2,3. Хотя молекулярные и генетические исследования были разработаны с использованием модельных насекомых, таких как шелкопряд Bombyx mori 4,5, насекомые-вредители остаются неисследованными, отчасти из-за трудностей с выращиванием и обработкой 6,7. Поэтому необходимы фундаментальные исследования и методы, чтобы понять биологию таких немодельных насекомых-вредителей.

Tortricidae (Lepidoptera), широко известные как tortrix или листовертки, включают в себя множество сельскохозяйственных и лесных вредителей8. Из таксонов насекомых восточный чайный тортрикс Homona magnanima Diakonoff и летний фруктовый тортрикс Adoxophyes honmai Yasuda являются серьезными полифаговыми вредителями, которые, как известно, повреждают чайные деревья в Восточной Азии7. Два вида откладывают плоские и овальные чешуйчатые скопления яиц (или яичные массы), состоящие из тонких, мягких и хрупких яиц, покрытых материнскими выделениями. Хотя стадии эмбриогенеза имеют решающее значение для развития насекомых и определения пола9, структуры яиц препятствуют дальнейшему анализу понимания биологии насекомых. Важно преодолеть трудности для дальнейшего изучения вредителей, яйцекладущих такую сложную яичную массу.

Здесь, чтобы понять биологию тортрицидов, методы массового выращивания, наблюдения и молекулярные исследования были разработаны с использованием A. honmai и H. magnanima. Во-первых, методы массового выращивания поддерживают обоих рубцов более 100 поколений инбредными. Отделение яиц от сцепленной чешуйчатой яичной массы облегчило наблюдение за эмбриогенезом рубцов с использованием щелочных и органических растворителей, ранее разработанных на основе методов, используемых у мух10. Кроме того, в настоящем исследовании установлена дискриминация по признаку пола мелких эмбрионов путем разработки методов окрашивания полового хроматина самок чешуекрылых с использованием молочно-уксусного орцеина11. Комбинируя эти методы, высокое качество и количество нуклеиновых кислот извлекали из эмбрионов, определяемых полом, что в противном случае было трудно установить6. Извлеченная РНК использовалась для секвенирования следующего поколения. В совокупности методы, представленные здесь, применимы к другим чешуекрылым насекомым и другим таксонам насекомых.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Сбор насекомых и массовое выращивание

  1. Собирайте тортрицидных насекомых с полей в соответствии с ранее опубликованными ссылками 8,12.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки H. magnanima и A. honmai собирают из поврежденных чайных листьев (рисунок 1А); взрослых привлекают с помощью портативного ультрафиолетового света мощностью 4 Вт (длина волны 365 нм, см. Таблицу материалов, рисунок 1B).
  2. Выращивайте собранных личинок (рисунок 1C, D) индивидуально на искусственной диете в чашке 1/2 унции в течение 2-3 недель до эклозии взрослого человека (рисунок 1E,F). Подтверждают пол куколок и взрослых особей по морфологическим признакам (рисунок 1G,I).
  3. Соедините самцов и самок в пластиковой коробке (30 см х 20 см х 5 см) для яйцекладки яйцевидных масс на парафиновой бумаге (рисунок 1J-L). Поместите самку и двух самцов в пластиковый стаканчик объемом 120 мл с кусочком парафиновой бумаги, чтобы установить матрилин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно сделать складки на парафиновой бумаге. Для H. magnanima парафиновая бумага должна быть на дне корпуса. Между тем, для A. honmai, положите бумагу на потолок корпуса для сбора яиц (рисунок 1L), так как H. magnanima яйцекладет яичную массу на верхней стороне чайных листьев, но A. honmai откладывает яйца на нижней стороне листьев8. Процедуры были также проверены на других видах тотеррикидов, и лучше размещать документы с обеих сторон, если экология и поведение целевых видов не прояснены.
  4. Вырежьте яичные массы (примерно 100-200 яиц на яичную массу12, рисунок 1М) на парафиновой бумаге ножницами. Поместите яйца в стаканчик по 1/2 унции с сброшенной бумагой на 5-7 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зрелый эмбрион демонстрирует угревую капсулу (рисунок 1N). Периоды эмбриогенеза по-разному относятся к тортрицидным видам, но обычно 5 дней после яйцекладки (dpo) для H. magnanima и 4 dpo для A. honmai при 25 °C при 60% относительной влажности, 16 ч света / 8 ч темных циклов7.
  5. Хранить яичные массы с черной головкой капсул при 4-8 °C в течение 7 дней.
  6. Нарежьте ~60 г искусственных диет с помощью терки для массового выращивания. Поместите яичную массу, наполненную созревшими эмбрионами, на нарезанную искусственную диету в пластиковый контейнер (23 см х 16 см х 8 см). Поместите парафиновую бумагу на яичную массу с нарезанными диетами (рисунок 10).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Относительная влажность ниже 30% считается более сухой, в то время как более 70% слишком влажной. Создание отверстий на крышке пластикового контейнера лучше для обеспечения лучшей вентиляции. Заполните отверстия хлопком, чтобы предотвратить побег мелких личинок.
  7. Для устранения поверхностных загрязнений из яиц замочите яичную массу в 3% формалине и 0,2% растворе бензалкония хлорида в течение 5 мин, соответственно12. Чтобы искоренить кишечные или внутриклеточные бактерии, используйте искусственную диету, дополненную 0,05% (мас./мас.) тетрациклина гидрохлоридом или 0,06% (мас./мас.) рифампицином вместо обычной искусственной диеты (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным. Важно замешивать Silk Mate 2S и 0,05% (мас./мас.) тетрациклина гидрохлорида или 0,06% (мас./мас.) рифампицина, равнозначно консистенции.
  8. Соберите куколок из пластикового контейнера и различайте пол на основе морфологических12 характеристик (рисунок 1G-I).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, тортрициды имеют 5-6 звезд до окукливания12. Личинкам H. magnanima и A. honmai требуется 3 недели и 2 недели соответственно после вылупления до окукливания.
  9. Поместите 15 самцов и 10 самок в пластиковый ящик (30 см х 20 см х 5 см, рисунок 1К) для спаривания с 25 °C, 16 л/8 D. Соберите яйца за 5-7 дней и повторите шаги 1,4-1,9. для каждого поколения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется сбор вновь яйцекладущих яйцекладущих яичных масс для последующего анализа, установите начало и конец темного периода, например, с 9 утра до 5 вечера. В этом состоянии H. magnanima и A. honami обычно яйцекладут яйца через 5 ч (2 часа дня).

2. Отделение яиц и личинок фарата от яичных масс для фиксации, пермеабилизации и окрашивания

  1. Замочите яичную массу в 1000 мкл 1,2% водного раствора гипохлорита натрия в течение 10 мин или в 1000 мкл водного раствора 5 М гидроксида калия в течение 30 мин для отделения яиц.
  2. Вымойте отделенные яйца в 1000 мкл PBSt (137 мМ NaCl, 8,1 мМ Na2HPO4, 2,68 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 0,05% полиоксиэтилена (20) сорбитана монолаурата [Tween-20] pH 7,4, см. Таблицу материалов) после ранее опубликованного отчета7.
  3. Замочите яйца в смеси 500 мкл 100% гептана и 500 мкл 4% раствора параформальдегида-ПБСт (мас./об.). Перемешивать в течение 10 мин при 1 500 об/мин с помощью вихревого смесителя.
  4. Замочите яйца в смеси 500 мкл 100% гептана и 500 мкл 100% метанола. Перемешивать в течение 10 мин при 1 500 об/мин.
  5. Дважды промыть яйца 1000 мкл 100% метанола и хранить при 4 °C в 100% метаноле до дальнейших экспериментов (рисунок 2A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца могут храниться не менее 1 года при температуре 4 °C.
  6. Замачивайте яйца последовательно в 99%, 70%, 50% этаноле и PBSt в течение 5 мин каждый для гидрофилизации после ранее опубликованного отчета7.
  7. Вымойте яйца с PBSt, погрузите яйца в 1 мкг/мл раствора DAPI на 5 мин, а затем дважды вымойте яйца 1x PBS. Замочите яйца в 20 мкл 1,25% (мас./мас.) молочно-уксусном орцеиновом растворе (см. Таблицу материалов)11 для визуализации гетерохроматина до тех пор, пока ядра не проявят ярко-красный цвет (это варьируется от 5 до 60 мин) (рисунок 2B,C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Периоды окрашивания молочно-уксусного орцеина зависят от температуры и влажности. Лучше проверить правильность окрашивания с помощью микроскопа с увеличением 4х-10х.
  8. Переложите витражи с помощью пипетки на стеклянную горку. Заключите витражные яйца в антизатухающий реагент (см. Таблицу материалов) и покровное стекло7.
  9. Извлеките фарат H. magnanima и личинки A. honmai (через 4-5 дней после яйцекладки (dpo)) из яичных масс с помощью щипцов (рисунок 2D). Разделите личинок пополам на стеклянной горке (рисунок 2Е).
  10. Фиксируют любые ткани (например, субэзофагеальные ганглии, грудные ганглии, мальпигиевы канальцы и др.) смесью 1:3 (v/v) 99,7% уксусной кислоты/100% метанола в течение 5 мин. Окрашивают их 1,25% (мас./мас.) молочно-уксусным орцеиномраствором 11 до окрашивания ядер (это может занять 5-60 мин, в зависимости от температуры и влажности).
  11. Определите пол каждого образца, наблюдая за наличием (женским) или отсутствием (мужской) гетерохроматина (W-хромосома, рисунок 2F, G) под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пол определяется путем визуализации полового хроматина. Каждая клетка представляет собой половой хроматин в виде точки у самок 11,12, в то время как оставшаяся часть фаратных личиночных тканей (не фиксированная) должна быть немедленно погружена в буфер лизиса клеток12 (10 мМ Tris-HCl, 100 мМ ЭДТА и 1% SDS, рН 8,0) или фенолсодержащие реагенты экстракции РНК для экстракции ДНК или РНК. Перед рассечением дозируйте 20 мкл реагентов в 0,2 мл ПЦР-пробирок заранее (рисунок 3А). Погружайте и храните образцы при температуре -80 °C до дальнейшей экстракции. Образцы могут храниться не менее 3 месяцев, но лучше приступить к последующим экспериментам, чтобы предотвратить деградацию нуклеиновых кислот.

3. Извлечение ДНК и РНК из половых детерминированных личинок фарата

  1. Объедините 12 определяемых полом мужских или женских личинок фарата (эмбрион 5 дпо) и добавьте либо буфер лизиса клеток, либо реагенты экстракции РНК (см. этап 2.11 и Таблицу материалов) в одну трубку объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 3.2-3.7 для экстракции ДНК и шаги 3.8-3.11 для экстракции РНК.
  2. Гомогенизировать ткани в 600 мкл буфера лизиса клеток (10 мМ Tris-HCl, 100 мМ ЭДТА и 1% SDS, рН 8,0) и центрифугировать образцы при 10 000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  3. Собирают супернатант (500 мкл) с помощью пипетки и инкубируют при 50 °C с 1,5 мкл протеиназы K (20 мг/мл, см. Таблицу материалов) в течение 5 ч на тепловом блоке.
  4. Обрабатывайте образцы 1,0 мкл 10 мг/мл раствора РНКазы (см. Таблицу материалов) при 37 °C в течение 30 мин.
  5. Добавляют 200 мкл раствора осаждения белка (см. Таблицу материалов) в пробирки7, а затем центрифугу при 17 000 х г в течение 10 мин при 4°С.
  6. Смешайте супернатант (500 мкл) с 500 мкл 100% изопропанола, а затем центрифугу при 20 400 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  7. Дважды промыть гранулированную ДНК 1000 мкл 70% этанола. Затем, высушив на воздухе (5-10 мин при комнатной температуре), растворяют ДНК в 30 мкл 10 мМ буфера Tris-Cl (рН 8,5).
  8. Гомогенизировать ткани в 600 мкл реагентов для экстракции РНК и добавить в пробирку 240 мкл сверхчистой дистиллированной воды. Центрифугируйте пробирки при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C.
  9. Смешайте супернатант (600 мкл) с 600 мкл 100% изопропанола и перенесите смесь в спиновую колонну кремнезема (см. Таблицу материалов). Центрифугируйте пробирки при 17 900 х г в течение 1 мин при 4 °C.
  10. Промыть колонну 750 мкл 70% этанола и дважды центрифугировать колонну по 17 900 х г в течение 1 мин при 4 °C.
  11. Загрузите в колонну 15 мкл сверхчистой дистиллированной воды. Центрифугируйте трубки при 17 900 х г в течение 1 мин при 4 °C для элюляции РНК.
  12. Рассчитайте и проверьте качество и количество ДНК и РНК с помощью спектрофотометра на основе ультрафиолета. Оцените чистоту нуклеиновых кислот, используя соотношения A260/A280 (нуклеиновые кислоты/белок) и A260/A230 (нуклеиновые кислоты/соли и другие загрязняющие вещества)13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для экстракции РНК соблюдалась ранее опубликованная процедура12 , в результате чего приводило к фенольному загрязнению (таблица 1). Извлеченная ДНК и РНК из одного эмбриона или личинок фарата дает образцы низкого количества и низкого качества. Как правило, экстракция ДНК из 12 личинок фарата дает 100-600 нг, в то время как экстракция РНК с использованием текущего метода генерирует 900-1 500 нг, как показано в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.13-3.15 являются необязательными для дальнейших анализов последовательности высокой пропускной способности.
  13. Рассчитайте количество ДНК и РНК с помощью флуоресцентного спектрофотометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки качества для дальнейшего экспериментального применения было рассчитано соотношение количеств РНК (концентрация на основе УФ-излучения (нг/мкл)/концентрация на основе флуоресценции (нг/мкл)). Например, когда концентрации на основе УФ и флуоресценции составляют 80 нг/ул и 60 нг/ул соответственно, соотношение будет составлять 1,5 (80/60). Обычно коэффициенты ниже 1,5 указывают на достаточную чистоту для последующих применений с использованием высокопроизводительного секвенирования13.
  14. Анализ качества РНК с помощью микрочипового электрофореза14.
  15. Используйте квалифицированные РНК для подготовки библиотеки РНК с помощью комплекта для подготовки библиотеки РНК (см. Таблицу материалов). Упорядочивайте библиотеки с помощью платформы, подходящей для подготовленных библиотек.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Создание хост-линий и их обслуживание
Жизнеспособность собранных в полевых условиях личинок по-разному объясняется расположением поля, сезонами и условиями выращивания (например, 90% жизнеспособности на Тайване, Таоюань, как показано в Arai et al.12). Примерно 30%-50% пар будут генерировать следующее поколение, как обычно. Для H. magnanima и A. honmai матрилины поддерживались путем инбридинга на протяжении более 100 поколений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Tortricid включает в себя несколько сельскохозяйственных и лесных вредителей; в настоящем исследовании представлены методы выращивания черепахи на протяжении поколений, наблюдения за эмбриогенезом и полом насекомых и проведения молекулярного анализа с использованием зрелых эмбрионов.

Одним из препятствий для изучения насекомых-вредителей является установление методов выращивания. Тем более, что инбридинг иногда негативно влияет на приспособленность вида. Снижение приспособленности инбредным те...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны Исследовательских стипендий японского общества содействия развитию науки (JSPS) для молодых ученых [номер гранта 19J13123 и 21J00895].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
FP CHUPAна1/2 унциивыращивания насекомых; крышка
чашки на https://www.askul.co.jp/p/6010417/ унцииFP CHUPACP070011выращивания насекомых; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether
99,7% уксусной кислотыFUJIFILM Wako Chemicals Co., Осака, Япония36289фиксация; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html
Agilent 2100 БиоанализаторAgilent Technologiesне показалКоличественное определение нуклеиновых кислот; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Agilent RNA6000 нанонаборAgilent Technologies5067-1511Количественное определение нуклеиновых кислот; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG
.pdf
раствор бензалкония хлоридаNihon Pharmaceutical Co., LtdNo.4987123116046Стерилизация; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html
ХлопокAOUME8-1611-02выращивание насекомых; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1
раствор DAPIDojindo, Токио, Япония340-07971окрашивание; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/
Динатрия гидрогенфосфатFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html
набор для количественного определения dsDNA HSInvitrogenQ33231Quantification acids; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230
колонка Econospin RNA II EpochLife Science Inc.EP-11201Экстракция РНК; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx
Фиксация этанолаFUJIFILM Wako Chemicals Co., Осака, Япония4.98748E+12; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html
Этилендиамин N,N,N',N'-тетрауксусная кислота тетранатриевая соль тетрагидрат (4NA)FUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Буфер для лизиса клеток (ЭДТА); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html
Пергаминовая бумагаHEIKO2100010выращивания насекомых; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla&
utm_medium=cpc& utm_source=
Adw
тепловой блок WSC-2620 PowerBLOCKATTO, Токио, Япония4002620инкубации; https://www.attoeng.site/
фиксация гептанаFUJIFILM Wako Chemicals Co., Осака, Япония4.98748E+12; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html
INSECTA LFNosan Co., Ltdне показаноискусственное питание; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
Экстракция РНКгена ISOGENIINipponGene 311-07361
изопропанолFUJIFILM Wako Chemicals Co.4,98748E+12экстракция нуклеиновых кислот; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html
молочной кислотеFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Окрашивание; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html
метанолFUJIFILM Wako Chemicals Co., Осака, Япония4.98748E+12фиксация; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html
MSV-3500 вихревойсмеситель BiosanBS-010210-TAKVoltex; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/
Нанофотометр NP 80Implenне показалколичественное определение нуклеиновых кислот; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/
Натуральная упаковкаInomata chemical1859выращивания насекомых; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3%
83%A9%E3%83%AB%E3%83%91%
E3%83%83%E3%82%AF%E3%83%
AF%E3% 82%A4%E3%83%89
NEBNext Ultra II Набор для подготовки библиотеки РНК для IlluminaNew England BioLabsE7770SPreparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039
orceinFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Красители; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html
параформальдегидFUJIFILM Wako Chemicals Co.160-16061фиксация; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html
монолаурата полиоксиэтилен(20) сорбитанаFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html
Портативный УФ-черный свет (4 Вт, длина волны 365 нм)Southwalker Co., Ltd., Канагава, Японияне показанаКоллекция насекомых; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328
Хлорид калияFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html
Дигидрофосфат калияFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html
ProLong Diamond Antifade MountantInvitrogen, MA, СШАP36965antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965
раствор протеиназы KMerck71049-4CNдля экстракции ДНК; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049
раствор для осаждения белкаQiagen158912экстракцией ДНК; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_
BIOCOMPARE_ProductListing_
0121_RD_MarketPlace_ProductC
Qubit V4InvitrogenQ33238Количественное определение нуклеиновых кислот; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
рифампицинFUJIFILM Wako Chemicals Co., Осака, Япония4.98748E+12Стерилизация; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html
набор для количественного определения РНК HSInvitrogenQ32855Количественное определение нуклеиновых кислот; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852
раствор РНКазыNippon Gene313-01461Экстракция РНК; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html
Silk Mate 2SNosan Co., Ltdне показаноИскусственная диета; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
Хлорид натрияFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html
додецилсульфат натрияFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Буфер для лизиса клеток (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html
водный раствор гипохлорита натрияFUJIFILM Wako Chemicals Co., Осака, Япония4.98748E+12сепарация яиц; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html
Тетрациклина гидрохлоридFUJIFILM Wako Chemicals Co., Осака, Япония4.98748E+12Стерилизация; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html
Tris-HClFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Буфер для лизиса клеток; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html
экстракции ультрачистой дистиллированной водыInvitrogen10977023РНК; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015
Чашка CP070009 ; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html для

Ссылки

  1. Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
  2. Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1(2002).
  3. Matsuura, H., Naito, A. Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).
  4. Mita, K., et al. The construction of an EST database for Bombyx mori and its application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).
  5. Kawamoto, M., et al. High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).
  6. Fukui, T., et al. In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).
  7. Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis. Entomological Science. 25 (1), 12497(2022).
  8. vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. , Elsevier Science Publishers. Amsterdam. (1991).
  9. Kiuchi, T., et al. A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).
  10. Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
  11. Kageyama, D., Traut, W. Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis. Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).
  12. Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima. Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).
  13. Schalamun, M., et al. Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora. Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).
  14. Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10 (1), 159(2010).
  15. Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments. Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).
  16. Saccheri, I., et al. Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation. Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).
  17. Crnokrak, P., Roff, D. A. Inbreeding depression in the wild. Heredity. 83 (3), 260-270 (1999).
  18. Keller, L. F., Waller, D. M. Inbreeding effects in wild populations. Trends in Ecology & Evolution. 17 (5), 230-241 (2002).
  19. Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).
  20. Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host. Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Определение полаискусственный рационокрашивание лакто-уксусной орсеиномэкстракция ДНКэкстракция РНКсеквенирование следующего поколенияокрашивание эмбрионов
Массовое выращивание и молекулярные исследования насекомых-вредителей Tortricidae
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.