Ансамблевая силовая спектроскопия по силам сдвига

В одномолекулярной силовой спектроскопии¹ (SMFS) механические свойства отдельных молекулярных структур были изучены сложными инструментами, такими как атомно-силовой микроскоп, оптический пинцет и магнитный пинцет ^2,3,4. Ограниченные одним и тем же требованием направленности молекул в силообразующих/детектирующих установках или малым полем зрения в магнитных пинцетах и миниатюрном центрифужном силовом микроскопе (MCF)^5,6,7,8, только ограниченное количество молекул может быть исследовано одновременно с использованием SMFS. Низкая пропускная способность SMFS препятствует ее широкому применению в области молекулярного распознавания, что требует привлечения большого набора молекул.

Сдвиговой поток обеспечивает потенциальное решение для приложения сил к массивному набору молекул⁹. В потоке жидкости внутри канала, чем ближе к поверхности канала, тем медленнее скорость потока¹⁰. Такой градиент скорости потока вызывает напряжение сдвига, параллельное граничной поверхности. Когда молекула помещается в этот поток сдвига, молекула переориентируется так, что ее длинная ось выравнивается с направлением потока, поскольку сила сдвига прикладывается к длинной оси¹¹. В результате этой переориентации ожидается, что все молекулы одного типа (размер и длина ручек) выровняются в одном направлении, испытывая при этом одинаковую силу сдвига.

Эта работа описывает протокол использования такого сдвигового потока для оказания силы сдвига на массивный набор молекулярных структур, примером чего является i-мотив ДНК. В этом протоколе между ротором и статором в наконечнике гомогенизатора генерируется сдвиговой поток. Настоящее исследование показало, что сложенная структура i-мотива ДНК может быть развернута со скоростью сдвига 9724-97245 s⁻¹. Кроме того, между лигандом L2H2-4OTD и i-мотивом была обнаружена константа диссоциации 36 мкМ. Это значение согласуется с значением 31 мкМ, измеренным анализом сдвига^{геля 12}. Кроме того, современная техника используется для развертывания i-мотива, который может обнажить хелатную медь (I) для катализации реакции щелчка. Таким образом, этот протокол позволяет развернуть большой набор структур i-motif с недорогими инструментами за разумное время (менее 30 минут). Учитывая, что метод силы сдвига резко увеличивает пропускную способность силовой спектроскопии, мы называем эту технику ансамблевой силовой спектроскопией (EFS). Этот протокол направлен на предоставление экспериментальных руководящих принципов для облегчения применения этой EFS на основе сдвиговой силы.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все буферы и химические реагенты, используемые в этом протоколе, перечислены в таблице материалов.

1. Подготовка силового микроскопа сдвига

ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскоп с силой сдвига состоит из двух частей: реакционного блока (гомогенизатора) и блока детектирования (флуоресцентного микроскопа). Увеличение окуляра составляет 10x, а увеличение объектива (воздуха) - 4x.

1. Соберите гомогенизатор и микроскоп на монтажном столе. Наденьте очки и включите флуоресцентный микроскоп, а затем отрегулируйте гомогенизатор, чтобы убедиться, что луч света возбуждения соответствующей длины волны (здесь использовался 488 нм) проходит через центр диспергирующего наконечника гомогенизатора.
2. Подготовьте реакционную камеру с плоским дном высотой 5 см и поперечным сечением 1,5 см2 х 1,5^см2. Чтобы уменьшить фон, убедитесь, что выбранный материал камеры не флуоресцирует, например, стекла (некоторые пластмассы имеют флуоресценцию).
3. Выберите подходящий диспергирующий наконечник гомогенизатора, который может обеспечить требуемую силу сдвига.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость сдвига зависит от расстояния между ротором и статором при фиксированной скорости вращения¹¹ в соответствии со следующим уравнением:
   
   где μ - динамическая вязкость воды при 20°С; D - внутренний диаметр статора; d - наружный диаметр ротора, а V - скорость сдвига (об/мин/с).
4. Зажмите реакционную камеру на стадии образца флуоресцентного микроскопа, а затем отрегулируйте камеру, чтобы удерживать диспергирующий наконечник гомогенизатора (рисунок 1). Убедитесь, что диспергирующий наконечник находится немного выше (~1 мм) нижней поверхности реакционной камеры.
5. Отрегулируйте вертикальное положение гомогенизатора и камеры вместе, чтобы фокус микроскопа находился на поверхности диспергирующего наконечника. Затем отрегулируйте горизонтальное положение диспергирующего наконечника, чтобы убедиться, что область обнаружения (поле зрения) установлена между ротором и статором (рисунок 1).
6. Включите флуоресцентные каналы в соответствии с флуоресцентным красителем, используемым в эксперименте.
7. Перед экспериментом по высокоскоростному сдвигу используйте деионизированную (DI) воду для проверки сдвига с низкой скоростью сдвига (например, 2000 оборотов в минуту), чтобы убедиться, что диспергирующий наконечник может работать надлежащим образом, не касаясь реакционной камеры.

2. Разворачивание i-мотивов с лигандами и без них

1. Получают человеческую теломерную i-мотивную ДНК (Таблицу материалов), помеченную красителем и гасителем на двух концах, соответственно, в воде DI, как описано в Hu et ^al.11.
   ПРИМЕЧАНИЕ: i-мотив, содержащий последовательность: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC CCC TAA.
2. Разбавьте ДНК до 5 мкМ в буфере MES 30 мМ при рН 5,5 или рН 7,4. К раствору ДНК добавляют лиганд L2H2-4OTD, который был синтезирован по данным Abraham Punnoose et ^al.13, в диапазоне концентраций 0-60 мкМ. Смешивайте раствор осторожно в течение 10 мин, чтобы сложить структуры i-мотива без света.
3. Проверьте и минимизируйте интенсивность фоновой флуоресценции реакционной камеры, заполненной деионизированной водой DI, с помощью флуоресцентного микроскопа без сдвига. Простым способом минимизации фоновой флуоресценции является промывка реакционной камеры водой DI. Значение фоновой флуоресценции должно быть вычтено в анализе данных позже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С этого шага следует избегать рассеянного света.
4. Установите параметры ПЗС-камеры с помощью программного обеспечения. Рекомендуемые параметры следующие: время экспозиции = 0,5 с, чувствительность ПЗС = 1600 и время записи = 20 мин.
5. Используя длинную пипетку, добавьте раствор ДНК в пустую и чистую реакционную камеру. Накройте реакционную камеру черным ящиком. Затем запустите гомогенизатор для выполнения сдвига с выбранной скоростью сдвига в диапазоне от 9 724 с⁻¹ до 97 245 с⁻¹ (выбранного с помощью программного обеспечения, связанного с гомогенизатором) в течение 20 минут с включенной ПЗС-камерой для записи данных.
6. После эксперимента снимите камеру и промыть ее водой DI.

3. Реакция щелчка с силой сдвига

1. Подготовьте ДНК i-мотива в воде DI. Инкубировать 10 мкМ i-мотивной ДНК в 300 мкл 30 мМ буфера Tris (рН 7,4), дополненного 150 мкМ CuCl и 300 мкМ аскорбиновой кислоты в течение 10 мин для сворачивания структур i-мотива (все концентрации являются конечными концентрациями в растворе).
   ПРИМЕЧАНИЕ: CuCl является катализатором реакции щелчка. Аскорбиновая кислота предотвратит окисление меди (I).
2. Ультрафильтрация раствора с помощью ультрафильтрационного устройства при центробежной силе 14 300 х г. Пополняйте раствор до ~500 мкл с буфером Tris 30 мМ (рН 7,4), дополненным 300 мкМ аскорбиновой кислотой после каждой фильтрации.
3. Повторите фильтрацию 3x.
4. Соберите остаточный раствор и сделайте конечный объем 300 мкл, добавив 30 мМ Tris (pH 7,4), дополненный 300 мкМ аскорбиновой кислотой вместе с 20 мкМ Calfluor 488 азида, 20 мкМ HPG и 10 мкМ TBTA. После того, как реагенты добавлены, переместите раствор в темную комнату.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага следует избегать освещения.
5. Проверьте и минимизируйте интенсивность фоновой флуоресценции реакционной камеры, заполненной водой DI, с помощью микроскопа перед экспериментами по сдвигу. Простым способом минимизации фоновой флуоресценции является промывка реакционной камеры водой DI.
6. Добавьте раствор ДНК в пустую реакционную камеру с длинной пипеткой, а затем начните сдвиг гомогенизатора со скоростью сдвига 63 209 с⁻¹ в течение 20 мин с включенной ПЗС-камерой.
7. После эксперимента снимите камеру и промыть ее водой DI.

На рисунке 1 показано механическое развертывание и зондирование в реальном времени ансамблевых молекул в EFS. На рисунке 1B интенсивность флуоресценции ДНК i-мотива увеличивалась со скоростью сдвига в диапазоне от 9 724 с−1 до 97 245 с−1 в буфере рН 5,5 MES. В качестве контроля интенсивность флуоресценции не увеличивалась, когда ту же i-мотивную ДНК сдвигали со скоростью 63 209 с−1 в буфере рН 7,4 MES. Это связано с тем, что i-мотив не складывается при рН 7,414. В предыдущей работе мы обнаружили, что чем выше скорость сдвига, тем больше разворачивается i-мотив11. Основываясь на развертывании i-мотива в оптическом пинцете11, мы откалибровали силу сдвига против скорости сдвига, как показано на рисунке 1C, на котором показано, что до 41 пН может быть применено к FRET-паре, меченой i-мотивом, со скоростью сдвига 77 796 с−1. На рисунке 2B оценивали связывание лиганда (L2H2-4OTD) с молекулами i-мотива ДНК, подвергшимися сдвиговому потоку, что показало, что приращение интенсивности флуоресценции стало менее очевидным с увеличением концентрации L2H2-4OTD (0-60 мкМ). Из кривой связывания (т.е. графика связанных фракций лиганда против концентрации свободного лиганда) на фиг.2С была определена константа диссоциации (Kd) 36 мкМ для взаимодействия между лигандом L2H2-4OTD и i-мотивом11. В качестве практического применения силы сдвига для химических реакций на рисунке 3 показана механо-щелкающая реакция, которая может быть вызвана потоком сдвига. На рисунке 3B хелатный i-мотив Cu(I) разворачивали со скоростью сдвига 63 209 с−1 , и высвобождаемая медь (I) вызывала флуорогенную реакцию щелчка, показанную на рисунке 3A, что приводило к увеличению интенсивности флуоресценции с течением времени (рисунок 3C).

Рисунок 1: Раскрытие структуры ДНК i-мотива сдвиговым потоком в EFS. (A) Схема развертывания структуры ДНК i-мотива, помеченной парой FRET (Cy5 и quencher) потоком сдвига, генерируемым в настольном гомогенизаторе. Левая вставка: светло-коричневый указывает на статор, а темно-коричневый указывает на ротор. Правая вставка: пунктирная голубая окружность между ротором и статором указывает на буферный поток в условиях сдвига. Темно-коричневая круглая стрелка указывает направление ротора. Голубые стрелки в увеличенном представлении правой вставки указывают на буферный поток при сдвиге. Длина каждой стрелки отображает скорость конкретного потока потока (более длинные стрелки указывают на более высокие скорости). (B) Процентное изменение интенсивности флуоресценции при зондировании в реальном времени обусловлено развертыванием i-мотива при различных скоростях сдвига от 9 724 с−1 до 97 245 с−1. Сплошные кривые указывают на экспоненциальную подгонку. Интенсивность флуоресценции нормализуется относительно максимального значения, наблюдаемого в эксперименте. (C) Диаграмма скорости сдвига по сравнению с силой сдвига для i-мотива, показанная в (A). Красной линией изображена линейная подгонка (R2 = 1,00). Эта цифра была изменена по сравнению с Hu et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Разворачивание i-мотивов, связанных лигандами. (A) Схема i-мотива, помеченного парой FRET (Cy5 и quencher), связанной с лигандом L2H2-4OTD13. (B) Снижение интенсивности флуоресценции i-мотива с увеличением концентрации лиганда L2H2-4OTD (розовый: 0 мкМ, зеленый: 6 мкМ, голубой: 30 мкМ, серый: 36 мкМ, черный: 45 мкМ и светло-коричневый: 60 мкМ). Интенсивность флуоресценции нормализуется относительно максимального значения, наблюдаемого в эксперименте. (C) Кривая связывания i-мотива при различных концентрациях свободного L2H2-4OTD. Эта цифра была изменена по сравнению с Hu et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Реакции механо-щелчка. (А) Фторогенная реакция щелчка между Calfluor 488 и HPG. Соединение, показанное зеленым цветом, является продуктом флуоресцентной реакции. (B) Структуру ДНК i-мотива, хелатированную медью (I) при рН 7,4, фильтровали для удаления несвязанной меди (I) в растворе. Хелатный i-мотив меди (I) был развернут сдвиговым потоком в EFS. Высвобождаемая медь (I) катализировала фторогенную реакцию щелчка, которая была показана в капиллярных трубках (внизу справа). (C) Процентное увеличение интенсивности флуоресценции реакции щелчка при скорости сдвига 63 209 с−1 в течение 20 мин. Темная кривая указывает на соответствие интенсивности флуоресценции от контрольной щелчковой реакции без ДНК. Зеленая кривая представляет экспоненциальную подгонку. Интенсивность флуоресценции нормализуется относительно максимального значения, наблюдаемого в эксперименте. Эта цифра была изменена по сравнению с Hu et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

У авторов нет конфликта интересов.