Производство высокотитерного рекомбинантного вируса болезни Ньюкасла из аллантойной жидкости

Вирус болезни Ньюкасла, также известный как Птичий ортоавулавирус-1, представляет собой окутанный птичий парамиксовирус с потенциалом использования как в качестве онколитического вируса, так и в качестве вирусной векторной вакцины 1,2,3,4,5,6,7. Совсем недавно NDV, разработанный для экспрессии спайкового белка SARS-CoV-2, был охарактеризован как эффективная интраназальная вакцина в моделях ^7,8,9 мышей и хомяков. При использовании в качестве иммунотерапии рака он приводит к набору врожденных иммунных клеток, в частности естественных клеток-киллеров, производству интерферона I типа и генерации противоопухолевых Т-клеток 10,11,12,13. В дополнение к этим мощным иммуностимулирующим свойствам, NDV имеет сильный профиль безопасности и хорошо зарекомендовавшую себя систему обратной генетики^14,15. Эти желательные характеристики побудили к оценке NDV в многочисленных доклинических и клинических испытаниях на людях (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)^16,17. Для дальнейшего продвижения этого многообещающего, иммуностимулирующего вирусного вектора необходимы подробные методы производства и очистки высокотитерного, ультрачистого NDV, который можно безопасно вводить in vivo.

Поскольку NDV является птичьим парамиксовирусом, он чаще всего усиливается в эмбриональных куриных яйцах. Хотя существуют клеточные системы, доступные для распространения NDV, большинство из них не смогли получить титры, аналогичные тем, которые были достигнуты в эмбриональных куриных яйцах¹⁸. Тем не менее, есть некоторые недостатки в производстве NDV в яйцах, в том числе тот факт, что производство на основе яиц является длительным и нелегко масштабируемым, получение большого количества куриных яиц SPF может быть проблематичным, и существует потенциал для загрязнения яичными аллергенами 13,18,19,20 . Недавно одна группа показала, что клетки Vero, выращенные в суспензии в среде, свободной от сыворотки, могут поддерживать репликацию NDV к титрам, сопоставимым с теми, которые достигаются в яйцеклетках, до очистки²¹. Однако для этого требовалось последовательное прохождение вируса для адаптации вируса к клеткам Vero, а оптимизация метода очистки NDV от суспензионных клеток Vero по-прежнему требуется²¹.

Как подчеркивалось ранее, методы, используемые для очистки вируса с высоким титром in vivo, варьируются в зависимости от вируса, рассматриваемого в^{вопросе 22}. Существует хорошо зарекомендовавшая себя система обратной генетики, доступная для генерации рекомбинантного NDV. Этот процесс, включающий использование клона кДНК, вспомогательных плазмид и вируса-помощника, экспрессирующего Т7-РНК-полимеразу, был ранее подробно описан^15,23. Этот протокол может быть применен как к лентогенному, так и к мезогенному NDV. Вирус, описанный в этом протоколе, представляет собой рекомбинантный мезогенный NDV, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP) из медузы Aequorea victoria, вставленный между вирусными генами P и M в качестве индивидуальной единицы транскрипции, поскольку это ранее было описано как оптимальное место для введения чужеродных трансгенов²⁴.

Закрытые методы очерчивают очистку NDV исходя из его размера, варьирующегося от 100 до 500 нм, и его плотности¹⁵. Это позволило генерировать in vivo-grade, высокотитерные запасы NDV примерно за 3 недели, начиная с момента получения яиц до окончательного титра. Описаны методы, часто используемые в крупномасштабном производстве вирусов на основе яиц, такие как тангенциальная фильтрация потока, глубинная фильтрация и ультрацентрифугирование градиента плотности, что позволяет перевести эти методы в более крупномасштабное производство. Ранее описанные методы очистки NDV были улучшены путем включения стабилизирующего вирус буфера, использования йодиксанола во время ультрацентрифугирования градиента плотности и описания различных мер контроля качества для обеспечения качества in vivo-grade ¹⁵. Это позволило очистить NDV in vivo-класса, достигая титров до 3 × 10¹⁰ PFU/mL от 0,8 до 1,0 л аллантойной жидкости.

Все работы, связанные с использованием животных, были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Гвельфа в соответствии с Канадским советом по уходу за животными. Вся работа выполняется в лаборатории BioSafety Level 2 (BSL2) в Канаде, где мезогенный NDV является патогеном группы риска 2. Все этапы, связанные с усилением и очисткой NDV, должны выполняться в шкафу биологической безопасности типа IIA в целях безопасности и стерильности.

1. Амплификация NDV с использованием определенных эмбриональных куриных яиц без патогенов

1. Инокуляция куриных яиц, зародышей SPF
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, восемь десятков куриных яиц, эмбрионированных SPF, используются для получения одной партии NDV in vivo. Закажите один или два десятка дополнительных яиц, чтобы учесть ущерб во время доставки, а также изменчивость в жизнеспособности. Эмбриональные куриные яйца являются биологическим материалом и должны обрабатываться в соответствии с институциональными руководящими принципами. Однако, поскольку эмбрионы не вылупляются, институциональное одобрение Комитета по уходу за животными не требуется.
   1. После получения SPF эмбриональные куриные яйца инкубируют в яичном инкубаторе при 37 °C, влажности 60% в течение 9 дней. Убедитесь, что инкубатор настроен на автоматическое вращение яиц каждый час.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца можно хранить при комнатной температуре до 24 ч или 4 °C до 72 ч; однако это может снизить жизнеспособность эмбриона.
   2. После 8-11 дней инкубации (в идеале на 9 день) подсвечивайте яйца, чтобы определить жизнеспособность эмбриона. Ищите паутиновидные сосуды (рисунок 1A) и движение эмбрионов в качестве индикаторов жизнеспособных эмбрионов. Утилизируйте яйца, лишенные этих особенностей (рисунок 1B).
   3. На жизнеспособных яйцах отметьте интерфейс между воздушным мешком и эмбрионом карандашом буквой «X» (рисунок 1A). Убедитесь, что это место инъекции не вызовет перфорацию сосудистой системы. Верните отмеченные яйца в инкубатор во время приготовления инокулята.
   4. Рассчитайте количество вируса, необходимое для инъекции всех эмбриональных куриных яиц SPF. Убедитесь, что каждая яйцеклетка получает 100 ПФЕ вируса в объеме 100 мкл; разбавляют вирус в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) до концентрации 1 × 10³ PFU/мл. Подготовьте дополнительные 20% инокулята, чтобы учесть неточности в введении вируса.
   5. С помощью антистатической салфетки очистите верхушки помеченных яиц 10% раствором йода, разведенным в 70% этаноле. Подождите примерно 1-2 мин, пока раствор высохнет.
   6. Осторожно проткните раковину с помощью пары стерильных острых пинцетов. Продезинфицируйте пинцет в 70% этаноле между яйцами.
   7. Используя шприц объемом 1 мл и иглу 25 г, вводят 100 мкл инокуляции, приготовленной на стадии 1.1.4, в хориоаллантоидальную полость (рисунок 1С). Подойдите иглой под углом почти 90° к яйцу. Вставьте иглу только в верхнюю часть хориоаллантоической мембраны.
   8. После прививки используйте лак для ногтей, чтобы покрыть место прокола и вернуть яйца в инкубатор. Убедитесь, что настройка раскачивания включена до 24 часов после прививки.
   9. Проверьте жизнеспособность яйцеклетки через 24 ч после прививки. Отбросьте мертвые яйцеклетки, у которых отсутствует сосудистая система в хориоаллантойской оболочке и движении эмбрионов (рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти яйцеклетки погибли из-за процесса прививки, а не от NDV.
   10. Верните яйца в инкубатор, при этом качелька выключится, чтобы предотвратить загрязнение аллантойной жидкости яичными белками.
   11. Проверяйте яйца каждые 12-24 ч, как описано в шаге 1.1.9, чтобы идентифицировать мертвые яйца. Переместите яйцеклетки, которые умирают через 24 часа после посева, до 4 °C, чтобы свести к минимуму аутолиз. Заготавливают аллантоидную жидкость в течение 2-12 ч после охлаждения.
   12. Инкубировать яйца не менее 72 ч.
       ПРИМЕЧАНИЕ: При распространении мезогенного штамма NDV оптимальное время инкубации составляет 60-72 ч, так как длительное время инкубации может ухудшить процесс очистки из-за снижения прозрачности аллантойной жидкости. Этот вопрос не так важен при размножении лентогенных штаммов NDV, поскольку им требуется гораздо больше времени, чтобы убить эмбрион.
   13. После соответствующего инкубационного периода переместите оставшиеся яйца до 4 °C в течение 2-12 ч перед сбором аллантовой жидкости.
2. Сбор аллантойной жидкости, содержащей NDV
   1. Переместите охлажденные яйца в шкаф биобезопасности. Ботву яиц очистить 70% этанолом.
   2. Используйте стерильный пинцет и хирургические ножницы, чтобы вскрыть апикальную сторону яйца, где расположен воздушный мешок.
   3. Снимите оболочку, чтобы выявить хориоаллантоическую мембрану (рисунок 1D).
   4. Осторожно проколите мембрану и отклейте ее обратно, чтобы обнажить аллантовую полость (рисунок 1Е). Следите за тем, чтобы желточный мешок случайно не прокололся, так как это испортит яйцо.
   5. Используйте тупые щипцы, чтобы схватить эмбрион и открыть эмбриональный мешок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкость внутри эмбрионального мешка также содержит NDV.
   6. Поджмите эмбрион щипцами и соберите аллантовую жидкость с помощью серологической пипетки объемом 10 мл.
   7. Хранить аллантовую жидкость на льду в конических трубках по 15 мл до осветления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если аллантовая жидкость желтая, желточный мешок был скомпрометирован, и аллантовая жидкость должна быть выброшена.
   8. Центрифугирование конических трубок, содержащих аллантовую жидкость, при 1,500 × г в течение 10 мин при 4 °C.
   9. Точка паузы: аликвотировать осветленную аллантоидную жидкость в конические трубки объемом 50 мл и хранить их при -80 °C для длительного хранения (например, от недель до месяцев), дополняя жидкость сахарозой до конечной концентрации 5% для защиты вируса от суровых последствий замораживания-оттаивания. Альтернативно, для краткосрочного хранения (например, 1-3 дня) дополнить аллантоидную жидкость сахарозой (конечные 5%) или 3x буфером маннитол-лизин (ML) (15% маннитола, 3% лизина; см. Дополнительную таблицу S1 для буферных рецептов) для получения конечной концентрации 1x (5% маннитола, 1% лизина) до хранения при 4 °C.

2. Очистка NDV от аллантоевой жидкости

1. Глубинная фильтрация аллантоевой жидкости
   1. Храните огуленную аллантовую жидкость при -80 °C и размораживайте ее при 4 °C в ночь перед очисткой.
   2. В шкафу биологической безопасности установите трубку и перистальтический насос, как показано на рисунке 2.
   3. Если это еще не выполнено, объедините аллантоидную жидкость с буфером 3x ML до конечной концентрации 1x.
   4. Перед подключением глубинного фильтра стерилизуйте трубку, пропуская 50 мл 0,5 М NaOH через систему в сосуд для отходов.
   5. Промыть трубку, пропуская 100 мл стерильной молекулярной воды через систему и в сосуд для отходов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку NaOH инактивирует NDV, важно, чтобы линии были адекватно промыты перед введением вируссодержащей аллантойной жидкости.
   6. Загрунтуйте систему, запустив через нее 50 мл PBS, остановив насос, когда в трубе осталось примерно 5 мл PBS.
   7. Прикрепите к трубе фильтр глубины с коэффициентом удержания 1-3 мкМ и снимите второй колпачок на апикальной стороне фильтра глубины, чтобы выпустить фильтр. Начните запускать дополнительные 50 мл PBS через систему.
   8. Как только PBS начнет проходить через вентиляционное отверстие в верхней части фильтра, закройте порт и продолжайте протекать PBS через линии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Незначительные пузырьки воздуха являются приемлемыми, однако наличие большого количества воздуха потребует повторного выпуска фильтра, как это описано на этапах 2.1.7 и 2.1.8.
   9. Остановите насос, когда в трубке останется примерно 5 мл PBS.
   10. Замените сосуд для отходов новым стерильным резервуаром для сбора и начните пропускать аллантовую жидкость через глубинный фильтр.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Давление не должно превышать 10 фунтов на квадратный дюйм, так как это приводит к сдвигу вируса. Давлением можно манипулировать, уменьшая или увеличивая расход насоса. Если давление начинает превышать 10 фунтов на квадратный дюйм и расход не может быть уменьшен дальше, следует использовать новый фильтр глубины. В этом случае этапы 2.1.6-2.1.8 должны быть выполнены до возобновления потока аллантоевой жидкости.
   11. После того, как вся аллантоидная жидкость пройдет через фильтр, запустите 50 мл 1x ML буфера через линии, чтобы максимизировать восстановление вируса.
   12. Соберите жидкость до тех пор, пока линии не высохнут. Хранить вирус в течение ночи или до 36 ч при температуре 4 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как вирус был подвергнут глубинной фильтрации, продолжайте процесс очистки в течение 36 часов после завершения глубинной фильтрации.
   13. Отсоедините фильтр глубины и продезинфицируйте трубку, запустив 100 мл 0,5 М NaOH, отбеливатель 400 PPM предварительно расплавленный до 42 °C через систему перед хранением в 0,5 М NaOH.
2. Тангенциальная фильтрация потока для концентрации NDV
   1. Соберите компоненты кассеты, как показано на фиг.3А (и как показано ранее²⁵), в шкаф биологической безопасности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коллектор и концевая пластина должны быть вымыты в моющем средстве и высушены перед использованием. Силиконовые прокладки являются многоразовыми и должны храниться в 0,5 М NaOH вместе с кассетой.
   2. Настройте систему тангенциальной фильтрации потока (TFF) (также известную как фильтрация поперечного потока) в «открытой» конформации (рисунок 3B).
      1. Если кассета используется впервые, соберите кассету TFF в конформацию Elution и промывайте 100 мл стерильной молекулярной воды (рисунок 3C).
      2. Как только в резервуаре резервуара останется всего 5 мл воды, приостановите насос и измените настройку системы TFF на закрытую конформацию (рисунок 3D).
      3. Добавьте в резервуар 100 мл 0,5 М NaOH, отбеливатель 400 PPM предварительно расплавленный до 42 °C и прокрутите через систему в течение 30-60 мин.
      4. Приостановите поток и верните систему TFF в установку элюирования, возобновив поток, чтобы элюировать чистящий раствор.
      5. Когда в резервуаре останется примерно 5 мл, приостановите насос и добавьте 100 мл стерильной воды молекулярного класса для промывки системы.
      6. Когда в резервуаре останется примерно 5 мл, приостановите насос и поместите систему TFF в открытую конформацию (рисунок 3B). Перейдите к шагу 2.2.3.
   3. Стерилизуйте кассету и трубку, пропуская 100 мл 0,5 М NaOH через систему с помощью перистальтического насоса. Убедитесь, что давление не превышает 30 фунтов на квадратный дюйм для поддержания целостности кассеты.
   4. Приостановите насос, когда в резервуаре останется примерно 5 мл 0,5 М NaOH.
   5. Добавьте 100 мл стерильной молекулярной воды в резервуар и возобновите прохождение жидкости через кассету. Закрутите резервуар, чтобы промыть весь NaOH со сторон резервуара, чтобы предотвратить инактивацию вируса. Повторите этап промывки резервуара.
   6. Когда в резервуаре останется примерно 5 мл стерильной молекулярной воды, приостановите насос.
   7. Добавьте 100 мл PBS в резервуар, закручиваясь, чтобы обеспечить стерильную молекулярную воду с боков. Возобновите поток жидкости через кассету.
   8. Когда в резервуаре останется около 5 мл, приостановите насос, добавьте в резервуар аллантоидную жидкость с фильтрацией на глубину и возобновите поток насоса.
   9. Контролируйте манометр 1 (рисунок 3B), чтобы убедиться, что он не превышает 10 фунтов на квадратный дюйм, чтобы предотвратить сдвиг вируса. Используйте комбинацию скорости перистальтического насоса и использование С-зажимов для увеличения элюирования отходов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сочетание скорости перистальтического насоса и С-зажимов приведет к повышению давления.
   10. Когда в резервуаре остается 50-100 мл аллантоической жидкости, приостановите насос для выполнения буферного обмена, добавив 150-200 мл 1x буфера ML.
   11. Возобновите расход насоса, снова контролируя манометр 1 (рисунок 3B), чтобы убедиться, что он не превышает 10 фунтов на квадратный дюйм.
   12. Когда в резервуаре останется 5-10 мл, приостановите насос.
   13. Используя два C-зажима, закройте две линии отходов, как показано на рисунке 3C.
   14. Отсоедините ретентатную линию, подающую резервуар, и вставьте ее в коническую трубку объемом 50 мл (рисунок 3C).
   15. Возобновляют поток насоса, останавливаясь, когда в резервуаре резервуара остается несколько капель жидкости.
   16. Снимите C-зажимы с линий отходов и снова прикрепите линию подачи ретентата к резервуару резервуара (рисунок 3B).
   17. Добавьте 20-25 мл буфера 1x ML и возобновите поток насоса до тех пор, пока в резервуаре резервуара не останется примерно 5 мл.
   18. Повторите шаги 2.2.13-2.2.16.
       ПРИМЕЧАНИЕ:^3-е элюирование может быть выполнено путем повторения шагов 2.2.17 и 2.2.13-2.2.16 для увеличения выхода вируса. Однако большая часть вируса присутствует в первых двух элюциях.
   19. После окончания элюирования поместите вирус на лед или при температуре 4 °C.
   20. Чтобы очистить линии, настройте систему таким образом, чтобы она представляла собой формат замкнутого цикла (рисунок 3D) с линиями отходов, подаваемыми обратно в резервуар, как показано на рисунке 3D.
   21. Приступайте к очистке системы, добавляя 250 мл 0,5 М NaOH, отбеливатель 400 PPM предварительно расплавленный до 42 °C.
   22. Пропустите чистящий раствор через систему в течение ночи.
       ПРИМЕЧАНИЕ: При рециркуляции чистящего раствора, если насос работает со скоростью 50 мл/мин, следует соблюдать давление около 5 фунтов на квадратный дюйм. Если давление превышает это, кассета загрязняется, и чистящий раствор следует заменить, а процесс повторить.
   23. Элюируйте чистящий раствор, направляя как линии отходов, так и линию ретентата в контейнер для отходов.
   24. Добавьте 400-500 мл стерильной воды в резервуар и пропустите ее через систему и в емкости для отходов.
   25. Когда в резервуаре останется примерно 5 мл, приостановите насос и добавьте 100-200 мл 0,5 М NaOH в резервуар резервуара, закручивая раствор для промывки резервуарного контейнера.
   26. Как только резервуар почти опустеет, повторите шаг 2.2.23 еще два раза.
   27. Разберите установку TFF, храня кассету и прокладки TFF в небольшом объеме 0,5 М NaOH в многоразовом пластиковом пакете при 4 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Трубки могут храниться при комнатной температуре под водой в 0,5 М NaOH.
3. Ультрацентрифугирование градиента плотности йодиксанола
   1. Включите ультрацентрифугу и установите ее на предварительное охлаждение до 4 °C. Предварительно охладите желаемый ротор при 4 °C (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Роторы должны храниться при температуре 4 °C.
   2. Используйте запасной 60% раствор йодиксанола (концентрация на момент покупки) для получения 40%, 20% и 10% растворов йодиксанола путем разбавления PBS и 3x ML Buffer до 1x конечной концентрации буфера ML.
   3. В тонкостенной ультрацентрифужной трубке объемом 13,2 мл с открытым верхом накладывают 0,5 мл, 2,5 мл и 2,5 мл из 40%, 20% и 10% растворов йодиксанола соответственно (рисунок 4А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наклон ультрацентрифужной трубки на бок и медленное вытеснение раствора значительно снизит риск смешивания двух градиентных слоев. Разделение каждого слоя должно быть очевидным, с «ореолом», видимым между каждым слоем градиента.
   4. Используйте маркерное перо, чтобы отметить интерфейсы различных градиентных слоев.
   5. Слой 6-6,5 мл элюированного вируса от процедуры TFF над градиентом плотности. Добавьте вирус осторожно, как описано в шаге 2.3.3, чтобы не нарушить градиент плотности.
   6. Загрузите трубки ультрацентрифуги во вставки для качающегося ротора ковша (см. Таблицу материалов) с помощью шкалы с открытым верхом, чтобы сбалансировать вставки в пределах 0,01 г друг от друга. Используйте PBS или дополнительный вирус eluent для учета разницы в весе.
   7. Как только трубы будут сбалансированы, закройте трубки крышкой и загрузите их в ротор.
   8. Центрифуга в течение 1,5 ч при 125 000 × г при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть выполнено в течение ночи, если доступна ультрацентрифуга с возможностью задержки запуска.
   9. После ультрацентрифугирования удалите трубки с помощью пары стерильных щипцов. Найдите целевую полосу — большую полосу — между 10% и 20% градиентами (рисунок 4B).
   10. Подвешивайте трубку над верхней частью стакана с помощью подставки для реторты.
   11. Прикрепите иглу размером 18 Г х 1,5 дюйма к шприцу объемом 5 мл и проколите боковую часть трубки ультрацентрифуги.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Трубка должна быть проколота немного ниже целевой полосы, с иглой под углом вверх и скосом вверх таким образом, чтобы она попала в целевую полосу.
   12. Медленно вытяните плунжер, чтобы удалить целевую полосу.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Перемещайте иглу в пределах целевой полосы, чтобы максимизировать извлеченный вирус. Будьте осторожны, чтобы другие полосы или мусор не смешивались с целевой полосой, и избегайте приема избыточного раствора, так как это приведет к использованию большего количества диализных кассет.
   13. После того, как целевая полоса была извлечена, удалите иглу и дайте оставшемуся раствору стекать в стакан для отходов. Распределите целевую полосу в коническую трубку объемом 50 мл до тех пор, пока не будут извлечены все полосы из всех других ультрацентрифужных трубок.
   14. Повторяйте шаги 2.3.10-2.3.13 до тех пор, пока все целевые полосы не будут извлечены из всех трубок ультрацентрифуги.
   15. Альтернативный подход к извлечению целевых полос, описанный на этапах 2.3.10-2.3.13
       1. Медленно удалите жидкость, накладывающуюся на целевую полосу, с помощью пипетки. Оказавшись на целевой полосе, извлеките с помощью пипетки и храните вирус в конической трубке объемом 50 мл.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет повторно использовать ультрацентрифужные трубки.
4. Удаление йодиксанола из раствора вируса
   ПРИМЕЧАНИЕ: NDV-содержащая полоса появляется с плотностью йодиксанола от 15% до 16%. Концентрацию йодиксанола в растворе можно определить путем измерения абсорбции при 340 нм по отношению к стандартной кривой (дополнительный рисунок S1). Этот этап может быть опущен, поскольку не наблюдалось никаких побочных эффектов или острой токсичности при введении растворов йодиксанола этой концентрации мышам C57BL/6.
   1. Предварительно внесите 0,5-3 мл 10 кДа молекулярно-весовой диализной кассеты, погружая ее в PBS на 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мембрана диализа должна измениться от гладкой до взъерошенной или бугристой. Если объем экстрагированного вируса превышает 10 мл, следует использовать две диализные кассеты 0,5-3 мл или диализную кассету 5-12 мл.
   2. Если применимо, используйте шприц объемом 5 или 10 мл и иглу с тупым заполнением 18 Г х 1,5 дюйма для сбора вируса из конической трубки объемом 50 мл.
   3. Используйте шприц для входа в диализную кассету, соблюдая осторожность, чтобы не проткнуть мембрану, и ввести вирус.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диализную кассету можно поворачивать, чтобы манипулировать позиционированием воздушного кармана в кассете. Воздушный карман следует снять перед извлечением иглы из кассеты.
   4. Наполните стакан объемом 1 л стерильным 1x PBS, поместите внутрь перемешиватель и диализную кассету и накройте крышкой. Инкубировать при 4 °C при мягком перемешивании.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте экструдированный пенополистирол и эластичную ленту для прикрепления диализной кассеты, чтобы она плавала в PBS. Кассета может слегка набухать из-за буфера ML.
   5. Через 1-2 ч заменить на свежий 1x PBS и продолжать инкубировать при 4 °C еще 8-10 ч с легким перемешиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это также можно сделать за ночь.
   6. Замените на свежий 1x PBS еще раз, инкубируя при комнатной температуре в течение 1-2 ч.
5. Концентрация раствора вируса
   1. Извлеките диализную кассету из диализного буфера (рисунок 4C) и поместите ее в небольшой запечатываемый пластиковый пакет. Добавьте 15-25 мл 40% полиэтиленгликоля 20 000 МВт, чтобы диализная кассета была полностью погружена.
   2. Инкубировать при комнатной температуре с раскачиванием. Периодически проверяйте объем вируса в кассете, используя шприц объемом 5 или 10 мл и иглу с тупым заполнением 18 Г х 1,5 дюйма.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество времени, необходимое для концентрации вируса, будет варьироваться в зависимости от начального объема и желаемого конечного объема. Как правило, конечный желаемый объем составляет от 1 до 1,5 мл независимо от начального объема аллантойной жидкости. При проверке объема будьте осторожны, чтобы не использовать один и тот же порт, так как это поставит под угрозу целостность порта и может привести к смешиванию раствора полиэтиленгликоля и вируса.
   3. Перед удалением концентрированного вируса из диализной кассеты кратковременно промойте кассету в 1x PBS и заполните воздухом иглу с тупым заполнением размером 18 G x 1,5 дюйма.
   4. Вставьте наполненный воздухом шприц в диализную кассету и нажмите на поршень. Поверните аппарат так, чтобы концентрированный вирус можно было удалить, не удаляя ни одного из введенных воздухов.
   5. Дозируйте концентрированный вирус в коническую трубку объемом 50 мл, отмечая объем дозирования.
   6. Используя тот же шприц и иглу, вводят соответствующее количество 60% сахарозы в диализную кассету, чтобы в сочетании с ранее удаленным вирусом она находилась в конечной концентрации 5% сахарозы.
   7. Используйте пальцы в перчатках для массажа мембраны, чтобы вытеснить остаточный вирус, который, возможно, прилип к мембране, стараясь не повредить ее. Удалите часть избыточного воздуха в диализной кассете, чтобы облегчить процесс смещения.
   8. Смешайте эту промывку с вирусом уже в конической пробирке объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус в настоящее время содержится в 5% сахарозы и готов к дозированию в 20 мкл, 50 мкл, 100 мкл или 200 мкл аликвот и хранится при -80 °C. Альтернативно, для длительного хранения NDV может быть лиофилизирован и сохранен при 4°C, как описано в разделе 2.6.
6. Лиофилизация НДВ
   1. Лиофилизируют вирус, аликвотированный в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл или конических пробирках по 15 мл при 44 × ^10-3 МБАР и -52 °C в течение 16 ч.
   2. Хранить лиофилизированные образцы при 4 °C без значительного снижения титра вируса.

3. Анализы контроля качества

1. Выделение вирусной РНК и ПЦР с обратной транскрипцией для подтверждения генома
   1. Разморозьте аликвоту вируса 20 мкл. Следуйте протоколу выделения вирусной РНК, поставляемому с комплектом.
   2. Немедленно используйте изолированную РНК в качестве шаблона для ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) или храните ее при -80 °C.
   3. Подготовьте реакции обратной транскрипции, как описано в протоколе, предоставленном производителем.
   4. Используйте полученную кДНК в качестве шаблона для различных реакций ПЦР контроля качества для подтверждения патотипа NDV (таблица 1, набор праймеров белка F) и наличия необходимых элементов контроля генов (таблица 1, набор праймеров transgene).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Грунтовки должны быть спроектированы на основе распространяемой деформации NDV.
      1. Для секвенирования участка расщепления белка F, основного детерминанта патотипа, используют набор праймеров белка F (таблица 1). Ищите продукт ПЦР длиной 435 пар оснований.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь грунтовки были разработаны на основе штамма LaSota NDV (genbank accession AF077761.1). Хорошо известно, что оптимальная экспрессия трансгена происходит, когда чужеродный трансген вставлен между генами P и M²⁴.
      2. Используйте набор праймеров трансгена для подтверждения целостности начальных и конечных элементов гена трансгена. Секвенировать продукт ПЦР для подтверждения целостности последовательности начала и конца гена.
   5. Отправьте продукты ПЦР для секвенирования ДНК и сравните их с шаблоном для гомологии.
2. Окрашивание SDS PAGE и Coomassie для обнаружения загрязняющих белков
   1. Отлить гель С градиентом плотности SDS PAGE путем предварительного приготовления 6% и 15% растворов полиакриламида (Дополнительная таблица S1). Используйте пипетку 10 мл для извлечения 5 мл 15% раствора, а затем 5 мл 6% раствора.
   2. Извлеките пипетку из раствора и создайте пузырь воздуха, ненадолго подтягивая воздух.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда воздушный пузырь движется вверх, это смешивает решение для создания градиента SDS PAGE.
   3. Дозируйте раствор в литейный аппарат и дайте ему затвердеть в течение 30 мин.
   4. В конечном объеме 20 мкл соедините аликвоту вируса с 4-кратным восстановительным буфером (дополнительная таблица S1) так, чтобы конечная концентрация составляла 1x, и кипятите в течение 10 мин при 95 °C в термоциклере. Загрузите не менее 1 × 10⁷ ПФЕ вируса.
   5. Погрузите страницу SDS в работающий буфер (дополнительная таблица S1) и загрузите образцы.
   6. Запускают гель при 120 В в течение 1-1,5 ч.
   7. Извлеките гель из работающего буфера и переложите его в контейнер меньшего размера.
   8. Добавьте раствор для окрашивания Coomassie (дополнительная таблица S1) для покрытия геля. Инкубировать при комнатной температуре в течение 4-5 ч.
   9. Удалить окрашивающий раствор и добавить раствор для дестина (Дополнительная таблица S1), инкубируя в течение 4-8 ч при комнатной температуре с перемешиванием. Измените решение destain три-четыре раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гель должен быть прозрачным, а его цвет должен быть таким, каким он был до окрашивания.
   10. Нанесите изображение геля на колориметрическую настройку. См. рисунок 5 для репрезентативного изображения окрашенного Coomassie геля SDS PAGE, содержащего образцы из аллантойной жидкости и очищенного вируса.
3. Количественная оценка инфекционного вирусного титра по средней инфекционной дозе культуры ткани (TCID₅₀) и иммунофлуоресцентному анализу
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки Vero могут использоваться в качестве альтернативы ячейкам DF1; однако цитопатический эффект (CPE) менее выражен в клетках Vero. NDV, содержащий мутацию L289A, которая усиливает фузогенность, и экспрессирующий GFP между генами P и M , используется в этом анализе.
   1. Засейте 96-луночную пластину клеток DF1 на 20 000 клеток / лунку в объеме 80 мкл за день до использования DMEM, дополненного 2% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 125 мкг / мл трипсина. Инкубируют клетки при 37 °C и 5% CO₂.
   2. На следующий день разморозьте 20 мкл аликвоты вируса на льду.
   3. Используйте пробирки по 1,5 мл для приготовления последовательных разведений. Начинают с разбавления 10 мкл вируса 990 мкл PBS для приготовления ^10-2 разведения. Приготовьте все остальные разведения, минимум до ^10-10 , приготовленные с 900 мкл PBS и добавлением 100 мкл предыдущего разведения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте новый наконечник пипетки при перемещении между разведениями.
   4. Используйте 20 мкл каждого разведения для заражения каждой скважины 96-луночной пластины, как показано на рисунке 6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем в каждой скважине составит 100 мкл.
   5. Инкубируют пластину в течение, по меньшей мере, 48 ч при 37 °C и 5% CO₂, прежде чем исследовать на наличие CPE/GFP или выполнять непрямой иммунофлуоресцентный анализ (IFA).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этих условиях культивирования CPE проявляется через 10 ч (рисунок 7A-D), увеличиваясь в течение следующих 24 ч (рисунок 7E-H). Пластина может быть инкубирована дольше, чтобы улучшить интенсивность CPE при оценке GFP или CPE.
      1. Если оценка по CPE или GFP и НЕ выполняетСЯ IFA, перейдите к шагу 3.3.18.1.
   6. При выполнении ИФА промывайте ячейки дважды 100 мкл 1x PBS.
   7. Добавьте в каждую лунку 100 мкл 4% параформальдегида, разведенного в PBS, и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре.
   8. Промывайте клетки 3x 5 мин каждая 100 мкл 1x PBS, 0,1% Tween 20 (0,1% PBS-T).
   9. Пермеабилизируют клетки путем добавления 100 мкл 0,1% NP-40 в PBS и инкубации их при комнатной температуре в течение 10 мин.
   10. Промывайте клетки 3x 5 мин со 100 мкл 0,1% PBS-T.
   11. Добавьте 100 мкл блокирующего буфера, состоящего из 5% (V/V) нормальной козьей сыворотки, разведенной в 0,1% PBS-T в течение 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 °C.
   12. Добавляют 100 мкл на лунку первичного мышиного анти-NDV рибонуклеопротеинового антитела, разведенного в 0,1% PBS-T до 1 мкг/мл, инкубируя в течение 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 °C.
   13. Промывайте клетки 3x в течение 5 мин в 100 мкл 0,1% PBS-T.
   14. Добавьте 100 мкл вторичного антитела AlexaFluor 488 Goat против мыши, разведенного в 0,1% PBS-T до 2 мкг/мл. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
   15. Промывайте клетки 3x в течение 5 мин в 100 мкл 0,1% PBS-T.
   16. После окончательной промывки оставьте клетки в 100 мкл 0,1% PBS-T.
   17. Изобразите скважины с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа.
   18. При выполнении IFA ищите флуоресценцию, большую, чем в отрицательных контрольных скважинах, что указывает на то, что скважина положительна для NDV, как показано на рисунке 8.
       1. Обратите внимание на наличие синцитии и больших, округлых клеток, которые характеризуют NDV CPE. Если скоринговые колодцы заражены вирусом, экспрессирующим GFP, ищите наличие GFP.
   19. Введите соответствующую информацию в калькулятор титров Spearman-Karber²⁶ для определения ПФУ/мл вируса (таблица 2). См. рисунок 6 для примера титрной пластины TCID₅₀ .
4. Количественная оценка титра вируса с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать одношаговый комплект qRT-PCR для экономии времени и уменьшения манипуляций с образцами. Зондовый анализ используется для повышения специфичности обнаружения последовательностей вирусов.
   1. Создайте стандартную кривую известного количества последовательностей вирусов (дополнительный рисунок S2A,B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать, купив синтетический 500 bp двухцепочечный фрагмент ДНК гена NDV L. Последовательность для фрагмента 500 bp гена NDV L можно увидеть на дополнительном рисунке S2C.
   2. Преобразуйте количество фрагмента ДНК вируса (обычно предоставляемого производителями в виде нанограммов или фемтомол) в количество молекул или копий фрагмента ДНК, используя число Авогадро и формулу молей в молекулы (Eq (1)).
      (1)
   3. Подготовьте стандартные образцы кривой, подготовив десятикратную серию разбавления известных копий фрагментов ДНК вируса, начиная от 1,00 ×^{10 10} копий до 1,00 × 10⁰ копий.
   4. Чтобы определить количество РНК NDV в неизвестных образцах, извлеките РНК NDV с помощью набора для экстракции РНК. Следуйте протоколу, прилагаемому к комплекту. Как только РНК будет извлечена, перейдите к рекомендуемому протоколу, представленному в одношаговом наборе qRT-PCR.
   5. Запускайте реакции в приборе ПЦР в режиме реального времени со следующими температурными и циклическими условиями: 1) один цикл обратной транскрипции при 55 °C в течение 10 мин; 2) один цикл начальной денатурации при 95 °С в течение 1 мин; и 3) 40 циклов денатурации (95 °C в течение 10 с), удлинения (60 °C в течение 30 с) и получения флуоресцентного сигнала.
   6. После завершения анализа qRT-PCR сгенерируйте стандартную кривую на основе образцов стандартной кривой с помощью программного обеспечения прибора ПЦР в режиме реального времени (дополнительный рисунок S2A, B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение также рассчитает количество РНК NDV в неизвестных образцах на основе стандартной кривой.
5. Тестирование безопасности на острую токсичность у мышей
   1. Вводят 1 × 10⁸ ПФЕ вируса внутривенно через хвостовую вену трем 8-недельным мышам BALB/C для оценки острой токсичности.
   2. Следите за мышами на предмет неблагоприятных событий, таких как потеря веса (>20%), сгорбленная осанка, взъерошенная шерсть, летаргия и изменения дыхания. Оценивайте три-четыре раза в день в течение первых 48 ч. Поскольку мыши должны начать восстанавливаться через 48 ч, контролируйте их один-два раза в день до полного выздоровления.
      1. Вводите физиологический раствор подкожно и поддерживающий уход по мере необходимости. Например, дополнить восстанавливающим диетическим гелем, арахисовым маслом или использовать тепловые шайбы. Усыпляйте мышей, которые достигли критериев конечной точки, как указано в руководящих принципах учреждения по уходу за животными, путем передозировки изофлурана с последующим вывихом шейки матки.

Сбор алнантоевой жидкости
Поскольку аллантоидная жидкость собирается из эмбриональных куриных яиц, она должна казаться прозрачной и прозрачной. Если жидкость выглядит непрозрачной и желтой, это свидетельствует о наличии загрязнений. Включение этой аллантойной жидкости во время очистки будет препятствовать процессу очистки, так как давление будет быстро повышаться и превышать 10 фунтов на квадратный дюйм, что приведет к сдвигу вируса и потере инфекционного вируса. Аллантоевая жидкость, которая кажется кровавой, предполагает, что яйца были инокулированы слишком большим количеством ПФУ вируса. Выход из этой партии яиц будет значительно ниже ожидаемого и вряд ли этот вирус удастся использовать in vivo. Яйцеклетки, привитые лентогенным NDV, должны по-прежнему иметь сосудистую систему, проявляющуюся через 72 ч, и эмбрионы не должны были умереть, как показано на рисунке 1. Если они это сделали, это говорит о том, что эмбрион был поврежден или загрязнен каким-то образом.

Ультрацентрифугирование градиента плотности йодиксанола
После ультрацентрифугирования между 10% и 20% градиентами должна быть расположена белая, содержащая NDV полоса с высоким титром (рисунок 4B).

Coomassie пятно гелей SDS-PAGE
На рисунке 5 показана разница между неочищенным (полоса 2) и очищенным вирусным запасом (полоса 3). Сравнение этих двух показателей показывает значительное снижение интенсивности загрязняющих белковых полос и появление доминирующих полос NDV в очищенном вирусном запасе.

Количественная оценка вирусного титра по TCID50
При использовании рекомендуемых условий при титровании концентрированного запаса NDV, CPE должен проявляться через 24 ч (рисунок 6). По сравнению с лентогенным штаммом NDV аналогичного титра, CPE более выражен в мезогенном штамме в тот же момент времени.

Анализ острой токсичности у 8-недельных мышей BALB/C
Когда 1 × 108 ФФУ вводились внутривенно, мышей следует контролировать на предмет побочных эффектов, таких как потеря веса >20%, взъерошенная шерсть, сгорбленная осанка и аномальное дыхание. В течение первых 24-36 часов мыши начнут терять вес и, вероятно, разовьют взъерошенную шерсть и сгорбленную позу. Однако, если вирус достаточно чистый, мыши начинают выздоравливать, что наблюдается при наборе веса и улучшении осанки и состояния шерсти через 36 ч. Мыши, которые не показывают этих признаков восстановления к 36 ч, должны продолжать тщательно контролироваться по критериям конечных точек. Как правило, это происходит из-за неточного титрования, потенциально из-за агрегации вирусных частиц.

Рисунок 1: Заражение и сбор NDV из определенных эмбриональных куриных яиц, не содержащих патогенов. (A) Паутиноподобная сосудистая система (стрелки), которая должна проявляться после 9 дней инкубации в дополнение к движению эмбриона. «X» обозначает границу раздела между хориоаллантоической мембраной и воздушной полостью, и где должно быть создано отверстие для инокуляции яйцеклетки. (B) Изображение мертвого эмбриона. Обратите внимание на отсутствие паутинообразной сосудистой системы. Также будет наблюдаться отсутствие движения эмбриона. (C) Диаграмма компонентов эмбрионального куриного яйца с указанием расположения воздушной полости, желточного мешка, амниотического мешка, хориоаллантоической мембраны и аллантойной жидкости. D) Удаление оболочки для обнажения хориаллантоидальной оболочки. (E) Иллюстрирует, как должна выглядеть аллантоическая жидкость и эмбрион после открытия хориоаллантоической мембраны. Аббревиатура: NDV = вирус болезни Ньюкасла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Схема, описывающая общую сборку аппарата, используемого для глубинной фильтрации. Убедитесь, что манометр установлен перед фильтром глубины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Настройка тангенциальной фильтрации потока в различных конфигурациях. Стрелки показывают направление потока жидкости. (A) Иллюстрация того, как собирается кассета TFF. (B) Схема системы TFF в ее "открытой" конфигурации, используемой при очистке и концентрации жидкости. (C) Схема установки TFF при элюировании жидкости из системы, используемой во время элюирования вируса и чистящего раствора. (D) Схема системы TFF в ее «закрытой» конфигурации, которая используется при очистке системы TFF. Аббревиатура: TFF = Тангенциальная фильтрация потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Ультрацентрифугирование градиента плотности и диализ концентрированного вируса из TFF. (A) Схема, показывающая состав градиента плотности йодиксанола. (B) Схема полосирования вируса после ультрацентрифугирования вируса, полученного с использованием буфера ML в процессе очистки. Основная вируссодержащая полоса обозначена черным овалом. (C) Типичный размер диализной кассеты, загруженной 10 мл вируса, полученного через градиент йодиксанола в конце процедуры диализа. Аббревиатура: TFF = Тангенциальная фильтрация потока; ML = Маннитол-лизин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Окрашенный Coomassie гель SDS-PAGE. Гель сравнивает наличие загрязняющих белков между неочищенными (полоса 2) и очищенными (полоса 3) мезогенными запасами NDV при загрузке 1 × 105 PFU. Полосы 1 и 4 = молекулярно-весовая лестница (МВт). NDV HN, F0 и его субъединицы после расщепления F1 и F2 вместе с их соответствующими молекулярными массами27 показаны белым шрифтом. Сокращения: SDS-PAGE = электрофорез додецилсульфат-полиакриламидного геля натрия; NDV = вирус болезни Ньюкасла; ПФУ = бляшеобразующие единицы; HN = гемагглютинин; F0 = Слияние. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Пример макета пластины с 96 скважинами, используемой для определения титра вируса по TCID50. Пластина разделена на 12 столбцов, каждая из которых представляет собой различное последовательное разбавление. Положительные скважины (определяемые либо CPE, трансгенной экспрессией, либо IFA) обозначены серым цветом. Учитывая количество положительных скважин в этом примере, ожидаемый титр после использования калькулятора титра Спирмена-Карбера (таблица 2) указан как в TCID50/мл, так и в PFU/мл. Сокращения: TCID50 = медиана инфекционной дозы культуры тканей; CPE = цитопатический эффект; IFA = иммунофлуоресцентный анализ; PFU = бляшеобразующие единицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Сравнение CPE после инфицирования клеток DF1 лентогенным или мезогенным NDV. MOI 0,5 использовали после 10 ч инкубации (A-D) или 24 ч инкубации (E-H) в различных условиях культивирования DMEM + 15% FBS, DMEM + 15% FBS + 5% аллантойной жидкости или DMEM + 2% FBS + 125 мкг/мл трипсина. Шкала стержней = 200 мкм. Сокращения: CPE = цитопатический эффект; NDV = вирус болезни Ньюкасла; МВД = множественность инфекции; FBS = фетальная бычья сыворотка; DMEM = среда модифицированного орла Дульбекко. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Пример ситуации, когда IFA необходим для титрования лентогенного NDV, не имеющего трансгена GFP. Клетки Vero культивировали в DMEM, содержащем 2% FBS и 125 мкг/мл трипсина. Снимки были сделаны из 10-7 серийных разведений. (A) Яркое изображение инфицированных клеток. (B) Иллюстрирует типичный внешний вид окрашенных клеток, когда IFA используется для обнаружения вируса. (C) Объединенное изображение (A) и (B). Шкала стержней = 100 мкм. Сокращения: IFA = иммунофлуоресцентный анализ; NDV = вирус болезни Ньюкасла; GFP = зеленый флуоресцентный белок; FBS = фетальная бычья сыворотка; DMEM = среда модифицированного орла Дульбекко. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Праймеры ПЦР и ОТ-qPCR для выявления сегментов генов вируса болезни Ньюкасла. Наборы праймеров используются для специфической амплификации двух областей генома NDV. Набор праймеров белка F приводит к амплификации области белка F, которая охватывает участок расщепления белка F. Набор трансгенных праймеров усиливает межгенную область между генами фосфопротеина и матрицы, оптимальный сайт вставки трансгена. Эта таблица также содержит последовательности праймеров, которые нацелены на вирусный ген L21 и зонд гена L, используемый в анализе qRT-PCR. Сокращения: ПЦР = полимеразная цепная реакция; ОТ-qPCR = количественная ПЦР с обратной транскрипцией; NDV = вирус болезни Ньюкасла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Калькулятор титра Спирмана-Карбера. Эта интерактивная электронная таблица содержит соответствующий рабочий процесс и уравнения для определения концентрации вируса с использованием результатов TCID50 на основе скважинного инокулята в мл, схемы разбавления и количества реплик на разбавление. Концентрация сообщается как объем в мл, необходимый для инфицирования 50% культуры тканей (TCID50) и бляшек, образующих единицы на мл суспензии вируса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительный рисунок S1: Определение концентраций йодиксанола. (A) Стандартная кривая, полученная из абсорбции растворов известной концентрации йодиксанола при 340 нм. (B) Стандартная кривая и уравнение из (A) использовались для определения концентрации йодиксанола в растворе после ультрацентрифугирования градиента плотности, диализа и концентрации полиэтиленгликоля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Амплификация и стандартная кривая, полученная из анализа qRT-PCR синтетического двухцепочечного фрагмента ДНК 500 bp гена NDV L. Амплификация (А) и стандартная кривая (В) были созданы из образцов, содержащих десятикратное последовательное разбавление (1,0 × 109 копий до 1,0 ×10 0 копий) фрагмента ДНК. Для усиления и стандартной кривой образцы, содержащие 1,0 × 101 копий и 1,0 × 100 копий, были ниже порогового значения и не давали значения точки пересечения ниже 35 Cp. Окончательная стандартная кривая была сгенерирована на основе образцов, содержащих 1,0 × 109 копий до 1,0 × 102 копий фрагмента ДНК. (C) Последовательность ДНК 500 нуклеотидного фрагмента гена NDV L, используемого для генерации стандартной кривой в протоколе qRT-PCR. Сокращения: ПЦР = полимеразная цепная реакция; ОТ-qPCR = количественная ПЦР с обратной транскрипцией; NDV = вирус болезни Ньюкасла; Cp = точка пересечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S3: Загрузка и извлечение NDV из диализной кассеты. (A) Типичный размер диализной кассеты после загрузки приблизительно 10 мл вируссодержащего раствора, выделенного из градиента плотности сахарозы и изображенного в конце стадии диализа. (B) Пример результатов, полученных при использовании ультрацентрифугирования градиента плотности йодиксанола без буферных добавок ML. Encircled является целевой вирусной полосой для удаления. Стрелками обозначена дополнительная полоса, которая может содержать поврежденные вирионы. Обратите внимание, что после включения буфера ML в процесс очистки эта полоса больше не проявляется. Сокращения: NDV = вирус болезни Ньюкасла; ML = маннитол-лизин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S1: Приведены этапы, необходимые для генерации растворов вестерн-блоттинга и буфера ML, используемых в процессе очистки. Сокращения: SDS-PAGE = электрофорез додецилсульфат-полиакриламидного геля натрия; TEMED = тетраметилэтилендиамин; ML = Маннитол-лизин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.