Здесь мы предоставляем подробную процедуру производства, очистки и количественной оценки высокотитерного рекомбинантного вируса болезни Ньюкасла. Этот протокол последовательно дает > 6 × 109 бляшекобразующих единиц / мл, обеспечивая количество вируса, подходящее для исследований in vivo на животных. Описаны дополнительные анализы контроля качества для обеспечения безопасности in vivo .
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Производство высокотитерного рекомбинантного вируса болезни Ньюкасла из аллантойной жидкости
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Вирус болезни Ньюкасла (NDV), также известный как птичий ортоавулавирус серотип-1, является отрицательным чувством, одноцепочечным РНК-вирусом, который был разработан как онколитический вирус, так и вирусная векторная вакцина. NDV является привлекательным лечебно-профилактическим средством благодаря своей хорошо зарекомендовавшей себя системе обратной генетики, мощным иммуностимулирующим свойствам и отличному профилю безопасности. При введении в виде онколитического вируса или вирусно-векторной вакцины NDV вызывает надежный противоопухолевый или антиген-специфический иммунный ответ, активируя как врожденные, так и адаптивные ветви иммунной системы.
Учитывая эти желательные характеристики, NDV был оценен в многочисленных клинических испытаниях и является одним из наиболее хорошо изученных онколитических вирусов. В настоящее время зарегистрировано два клинических испытания с участием NDV: одно оценивает рекомбинантную NDV-векторную вакцину для SARS-CoV-2 (NCT04871737), а второе оценивает рекомбинантный NDV, кодирующий интерлейкин-12 в сочетании с Durvalumab, антителом против PD-L1 (NCT04613492). Для содействия дальнейшему продвижению этого весьма перспективного вирусного вектора необходимы упрощенные методы генерации высокотитерных, in vivo-grade, рекомбинантных NDV (rNDV).
В этой статье описывается подробная процедура амплификации rNDV в определенных эмбриональных куриных яйцах без патогенов (SPF) и очистки rNDV от аллантойной жидкости с улучшениями для уменьшения потерь во время очистки. Также включены описания рекомендуемых анализов контроля качества, которые должны быть выполнены для подтверждения отсутствия загрязняющих веществ и целостности вируса. В целом, эта детальная процедура позволяет синтезировать, очищать и хранить высокотитерный, in vivo-grade, рекомбинантный, лентогенный и мезогенный NDV для использования в доклинических исследованиях.
Введение
Вирус болезни Ньюкасла, также известный как Птичий ортоавулавирус-1, представляет собой окутанный птичий парамиксовирус с потенциалом использования как в качестве онколитического вируса, так и в качестве вирусной векторной вакцины 1,2,3,4,5,6,7. Совсем недавно NDV, разработанный для экспрессии спайкового белка SARS-CoV-2, был охарактеризован как эффективная интраназальная вакцина в моделях 7,8,9
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все работы, связанные с использованием животных, были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Гвельфа в соответствии с Канадским советом по уходу за животными. Вся работа выполняется в лаборатории BioSafety Level 2 (BSL2) в Канаде, где мезогенный NDV является патогеном группы риска 2. Все этапы, связанные с усилением и очисткой NDV, должны выполняться в шкафу биологической безопасности типа IIA в целях безопасности и стерильности.
1. Амплификация NDV с использованием определенных эмбриональных куриных яиц без патогенов
- Инокуляция куриных яиц, зародышей SPF
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, восемь десятков ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Сбор алнантоевой жидкости
Поскольку аллантоидная жидкость собирается из эмбриональных куриных яиц, она должна казаться прозрачной и прозрачной. Если жидкость выглядит непрозрачной и желтой, это свидетельствует о наличии загрязнений. Включение этой аллантойной жидкости во время очистки будет препятствовать процессу очистки, так как давление будет быстро повышаться и превышать 10 фунтов на квадратный дюйм, что приведет к сдвигу вируса и потере инфекционного вируса. Аллантоевая жидкость, которая кажется .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Вирусы, используемые в качестве терапевтических средств в доклинических исследованиях, должны быть высоко очищены, чтобы избежать токсичности при введении in vivo15. Если случайные агенты или загрязняющие вещества не удаляются, это может привести к тяжелым побочным реакциям, сводящим на нет терапевтический эффект вирусного агента28. Поскольку NDV продуцируется в эмбриональных куриных яйцах, существует несколько загрязняющих яичных белков, таких как овальбумин, кото.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.
Благодарности
J.G.E.Y был получателем стипендии Ветеринарного колледжа Онтарио PhD и стипендии для выпускников Онтарио. Эта работа финансировалась Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады Discovery Grants to SKW (грант No 304737) и LS (грант No 401127).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,25% трипсин | HyClone | SH30042,02 | |
| 1 мл шприц со скользящим наконечником | BD | 309659 | |
| 10 мл шприц Luer-Lok | BD | 302995 | |
| 10% раствор повидон-йода | LORIS | 109-08 | |
| 15 мл конические пробирки | Thermo-Fisher | 14955240 | |
| 18G x 1 1/2 in игла для тупого заполнения | BD | 305180 | |
| 18G x 1 1/2 in Прецизионная скользящая игла | BD | 305196 | |
| 25 G x 5/8 in Needle | BD | 305122 | |
| 2-меркаптоэтанол | Thermo-Fisher | 03446I-100 | |
| 30% Акриламид/Бис раствор 37,5:1 | BioRad | 1610158 | |
| 4% параформальдегид-PBS | Thermo-Fisher | J19943-K2 | |
| 5 мл Luer-Lok Syringe | BD | 309646 | |
| 96 Well Tissue Culture Plate- Flat Bottom | Greiner Bio One | 655180 | |
| Уксусная кислота, ледниковый | термофишер | A38-212 | |
| Агарозный | лягушка | A87-500G | |
| Alexa-Fluor 488 Коза-антимышиный | инвитроген | A11001 | |
| Allegra X-14 Центрифуга | Beckman Coulter | B08861 | |
| Персульфат аммония | BioRad | 161-0700 | |
| Отбеливатель (5%) | Thermo-Fisher | 36-102-0599 | |
| Щипцы широкие, без зубцов | Thermo-Fisher | 09-753-50 | |
| Бромфенол Синий | Sigma-Aldrich | 114405-25G | |
| Держатель кассеты Centramate | PALL | CM018V | |
| ChemiDoc XRS+ | BioRad | 1708265 | |
| CO2 Инкубатор | Thermo-Fisher | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-259 | Thermo-Fisher | BP101-50 | |
| DF1 Cells | ATCC | CRL-12203 | |
| Diet Gel Recovery | ClearH2O, INC | 72-01-1062 | |
| Digital 1502 Инкубатор для яиц Sportsman | Berry Hill | 1502W | |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-500G | |
| Egg Candler | Berry Hill | A46 | |
| Этанол (70%) | Thermo-Fisher | BP82031GAL | |
| раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), pH 8,0, 0,5 м in H2O | Thermo-Fisher | BP2482-500 | |
| Фитинги тройника с внутренней резьбой, нейлон, 1/8 in NPT(F) | Cole-Parmer | 06349-50 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 12483-020 | |
| Тонкие щипцы высокой точности | Thermo-Fisher | 22-327379 | |
| Флуоресцентный микроскоп | ZEISS AXIO | Не требуется, если не выполняется ИФА или если NDV не кодирует флуоресцентный белок | |
| Система сублимационной сушки Freezone 4.5 | LABCONCO | ||
| GiBOX Gel Imager | Syngene | Imaging of Agarose Gels | |
| Glycerin | Thermo-Fisher | G33-1 | |
| Глицин | Thermo-Fisher | BP381-5 | |
| Высокоемкость кДНК Набор обратной транскриптазы | Thermo-Fisher | 4368814 | |
| высоким содержанием глюкозы Модифицированная эфирная среда Dulbecco | Cytiva | SH30022.01 | |
| Набор для измерения влажности | Berry Hill | 3030 | |
| Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) раствор йодиксанола в воде (стерильный) |
| L-лизин моногидрохлорид | Sigma-Aldrich | 62929-100G-F | |
| мужской и женский Luer-Lok a 1/8 в национальной трубной резьбе, NPT | Cole-Parmer | 41507-44 | |
| Masterflex L/S Digital Drive | Cole-Parmer | RK-07522-20 | Перистальтический насос с цифровым дисплеем |
| Masterflex L/S Легкая загрузка Головка насоса для прецизионных трубок | Cole-Parmer | RK-07514-10 | |
| Masterflex Силиконовая трубка (платина) L/S 16 | Cole-Parmer | 96420-16 | BioPharm Платиновый силикон |
| MC Pro 5 Термоамплификатор | Eppendorf | EP950040025 | |
| метанол | Thermo-Fisher | A412-4 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | SDS-PAGE cast and running appartus |
| Mouse-Anti-NDV | Novus Biologicals | NBP2-11633 | Клон 6H12 |
| Сыворотка для нормальной козы | Abcam | AB7481 | |
| NP-40 | Thermo-Fisher | 85124 | |
| Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K | PALL | OS100T02 | |
| Optima XE-90 Ультрацентрифуга | Beckman Coulter | A94471 | |
| OWL Easycast B1A Мини гель Система электрофореза | Thermo-Fisher | B1A | |
| PBS 10X Solution | Thermo-Fisher | BP399-20 | |
| Поли(этиленгликоль) в среднем Mn 20 000 | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
| PowePac 300 | BioRad | Модель 1655050 - для электрофореза в агарозном геле | |
| Q5 High Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| QIA Amp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| RedSafe | Thermo-Fisher | 50999562 | |
| Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10 000 MWCO 0,5-3 мл | Thermo-Fisher | 66380 | |
| Додецилсульфат натрия | Thermo-Fisher | BP166-500 | |
| Гидроксид натрия (гранулы) | Thermo-Fisher | S318-10 | |
| Специфические яйца без патогенов | CFIA | NA | Поставщик будет варьироваться в зависимости от местоположения |
| Сахароза | Thermo-Fisher | S5-3 | |
| Supracap 50 Глубинный фильтр | PALL | SC050V100P | |
| хирургические | ножницыThermo-Fisher | 08-951-5 | |
| SW41Ti Ротор | Beckman Coulter | 331362 | Используется в протоколе на шагах 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7 |
| SX4750 Ротор | Beckman Coulter | 369702 | |
| SXX4750 Адаптер для труб с консиальным дном | Beckman Coulter | 359472 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | |
| Тонкостенные центрифужные пробирки Ultraclear ( 9/16 in x 3 1/2 in) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris Base | Thermo-Fisher | BP152-5 | |
| Винтовой зажим для трубок | PALL | 88216 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-1L | |
| Манометры для коммунальных услуг | Cole-Parmer | 68355-06 |
Ссылки
- Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
- Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. V....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
