Настоящий протокол описывает простой способ выделения преадипоцитов из жировой ткани у эмбрионов бройлеров. Этот метод позволяет выделить с высоким выходом, первичной культурой и адипогенной дифференцировкой преадипоцитов. Окрашивание маслом Red O и окрашивание липидов/ДНК измеряли адипогенную способность изолированных клеток, индуцированных дифференцировочными средами.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение преадипоцитов из эмбрионов цыплят-бройлеров
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Первичные преадипоциты являются ценной экспериментальной системой для понимания молекулярных путей, которые контролируют дифференцировку и метаболизм адипоцитов. Куриные эмбрионы дают возможность выделить преадипоциты с самой ранней стадии развития жировой ткани. Эта первичная клетка может быть использована для выявления факторов, влияющих на пролиферацию преадипоцитов и адипогенную дифференцировку, что делает их ценной моделью для исследований, связанных с детским ожирением и контролем избыточного отложения жира у домашней птицы. Быстрый рост постнатальной жировой ткани эффективно истощает корм, распределяя его вдали от роста мышц у цыплят-бройлеров. Таким образом, методы понимания самых ранних стадий развития жировой ткани могут дать подсказки для регулирования этой тенденции и определения способов ограничения расширения жировой ткани в раннем возрасте. Настоящее исследование было разработано для разработки эффективного метода выделения, первичной культуры и адипогенной дифференцировки преадипоцитов, выделенных из развивающейся жировой ткани коммерческих эмбрионов цыплят бройлеров (мясного типа). Процедура была оптимизирована для получения клеток с высокой жизнеспособностью (~ 98%) и повышенной способностью дифференцироваться в зрелые адипоциты. Этот простой метод выделения, культивирования и дифференцировки эмбриональных преадипоцитов поддерживает функциональный анализ роста и развития жиров в раннем возрасте.
Введение
Ожирение является глобальной угрозой для здоровья как взрослых, так и детей. Дети с избыточным весом или ожирением примерно в пять раз чаще страдают ожирением во взрослом возрасте, что подвергает их значительно повышенному риску сердечно-сосудистых заболеваний, диабета и многих других сопутствующих заболеваний. Около 13,4% американских детей в возрасте 2-5 лет имеют ожирение1, что свидетельствует о том, что тенденция накапливать избыток жира в организме может быть приведена в движение очень рано в жизни. По самым разным причинам накопление избыточной жировой ткани является проблемой для цыплят-бройлеров (мясного типа). Современные бройлеры неве....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Теннесси. Свежеоплодотворенные коммерческие яйца бройлеров (Cobb 500) были получены из местного инкубатория. Яйца инкубировали при 38 °C с относительной влажностью 60% до рассечения в эмбриональные дни 16-18 (E16-E18). Жировую ткань собирали из подкожного (бедренного) депо.
1. Подготовка к изоляции и культуре
- Подготовьте культуру и инструменты.
- Перед началом вскрытия установите рабочую зону в ламинарной вытяжке. Продезинфицируйте рабочую зону и все инструменты, обмазав их 70% этанолом. Выпол....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Первичные преадипоциты морфологически похожи на фибробласты, с неправильными, звездообразными формами и центральным ядром (рисунок 2A-C). Клетки легко прилипают к пластике тканевой культуры и начинают размножаться вскоре после прикрепления. Они быстро дифференцируют и накапливают липидные капли (рисунок 3D) при поступлении жирных кислот в среде. Жизнеспособность (98%, основанная на исключении красителя), о которой сообщается в п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хотя в нескольких хорошо описанных протоколах сообщалось об выделении преадипоцитов 14,15,16,17, изоляция для эмбриональных преадипоцитов была оптимизирована, что может быть использовано для функционального анализа роста и развития жира в раннем возрасте у цыплят бройлеров. Этот протокол дает высокожизнеспособные предшественники эмбриональных адипоцитов с высоким потенциалом дифференцировки. Бо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы благодарят UT AgResearch и Департамент наук о животных за поддержку и оптимизацию этого протокола. Эта работа финансировалась за счет гранта Министерства сельского хозяйства США.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Дозатор | Eppendorf | Z683825 | одноканальный дозатор, 100 - 1000 и микро; L |
| 1 мл наконечник для пипетки | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% изопропанол | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 мл колба | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% формальдегид | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-луночный планшет | Falcon | 353046 | 96-луночный планшет для анализа с использованием тканевых культур |
| Costar | 3632 | ||
| 96-луночный планшет, черное дно | Costar | 3603 | обработанное культурой тканей |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| настольный стеклоочиститель (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Вверх и вверх Up | NDC 1167300334 | 20% рабочий раствор |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Сетчатый фильтр, 40 & микро; m | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Куриная сыворотка | Gibco | 16110082 | |
| коническими центрифужными пробирками, 15 мл | VWR | 10025-690 | |
| Конические центрифужные пробирки, 50 мл | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| изогнутыми щипцами, 100 мм | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Изогнутые хирургические ножницы, 115 мм | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Дистиллированная вода | Millipore | SYNSV0000 | дозируется по мере необходимости |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Этанол | Decon Labs | 2701 | 70% рабочий раствор |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | |||
| EVOS | M7000 | ||
| Считыватель флуоресцентных пластин | Biotek | Synergy H1 | |
| Фольга | Reynolds | Wrap Сверхпрочная алюминиевая фольга, 125 КВ. ФУТОВ. | |
| Контейнер для заморозки | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Желатин | Миллипор | 4055 | 2% рабочий раствор |
| Гематоцитометр (счетная камера) | Corning | 480200 | глубиной 0,1 мм |
| Fisher Scientific | 6845 | ||
| Инструмент Стерилизатор | VWR | B1205 | |
| Линолевая кислота-олеиновая Кислотно-альбуминовый | Sigma | L9655 | 1x рабочий раствор |
| микроскоп | Evos | AMEX1000 | |
| многоканальный пипетка | Thermo Scientific | 4661070 | 12-канальные пипетки, 30 - 300 &; L |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| 2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Масло красное O | Sigma | O-0625 | |
| Орбитальный шейкер | IKA | KS130BS1 | |
| Бумажное полотенце | Tork | RK8002 | |
| Парапленка | Парапленка M | PM996 | |
| Пенициллин/Стептомицин (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Рабочий раствор |
| Чашки Петри, 100 мм | Falcon | 351029 | |
| чашки Петри, 60 мм | Falcon | 351007 | |
| Шейкер для тарелок | VWR | 200 | |
| RBC Лизис Буфер | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Маленький стакан, 100 мл | Pyrex | 1000-100 | |
| Спектрофотометр Планшетный ридер | Biotek | Synergy H1 | |
| Стерильная марля | McKesson | 762703 | |
| прямыми щипцами, 120 мм | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Прямые ножницы, 140 мм | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Колба | Corning | 430639 | Инкубатор для культуры |
| тканей | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Тканевое ситечко, 250 & микро; m | Пирс | 87791 | |
| Трипан синий морилка | Gibco | 15250061 | |
| трипсин | Gibco | 15400054 | 0,1% рабочий раствор |
| пинцет, 110 мм | Робоз хирургический | RS-5035 | |
| тип 1 коллагеназа | Gibco | 17100017 | |
| водяной баней | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Ватман 1 класс фильтровальная бумага | ватман | 1001-110 |
Ссылки
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolutio....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
