Этот протокол описывает размерную эксклюзионную хроматографию, легкий и воспроизводимый метод обогащения внеклеточных везикул Mycobacterium tuberculosis из супернатантов культуры.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Микобактерии туберкулеза Обогащение внеклеточных пузырьков с помощью хроматографии с исключением размеров
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Роль внеклеточных везикул (EV) в контексте бактериальной инфекции стала новым способом понимания микробной физиологии. В частности, mycobacterium tuberculosis (Mtb) EV играют роль во взаимодействии хозяина и патогена и реакции на стресс окружающей среды. Mtb EV также очень антигенны и демонстрируют потенциал в качестве компонентов вакцины. Наиболее распространенным методом очистки Mtb EV является ультрацентрифугирование с градиентом плотности. Этот процесс имеет несколько ограничений, включая низкую пропускную способность, низкую производительность, зависимость от дорогостоящего оборудования, технические проблемы, и это может негативно повлиять на полученную подготовку. Хроматография с исключением размеров (SEC) является более мягким альтернативным методом, который борется со многими ограничениями ультрацентрифугирования. Этот протокол демонстрирует, что SEC эффективен для обогащения Mtb EV и производит высококачественные препараты Mtb EV повышенной производительности быстрым и масштабируемым способом. Кроме того, сравнение с ультрацентрифугированием градиента плотности с помощью количественных и квалификационных процедур демонстрирует преимущества SEC. В то время как оценка количества EV (анализ отслеживания наночастиц), фенотипа (просвечивающая электронная микроскопия) и содержания (вестерн-блоттинг) адаптирована к Mtb EV, предоставленный рабочий процесс может быть применен к другим микобактериям.
Введение
Высвобождение внеклеточных везикул (EV) патогенами может быть ключом к раскрытию новых технологий для борьбы с инфекционными заболеваниями1. Микобактерии туберкулеза (Mtb) являются возбудителем с высокими последствиями, заражая примерно одну треть населения мира и ежегодно унося жизни миллионов людей2. Производство EV Mtb хорошо документировано, но неуловимо в биогенезе и различных ролях (т.е. иммуностимулирующих, иммуносупрессивных, железо и питательных веществ) этих EV в контексте инфекции 3,4,5. Попытки понять соста....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Институциональный комитет по биобезопасности Университета штата Колорадо одобрил настоящее исследование (19-046B). Культивирование микобактерий туберкулеза и сбор богатых EV супернатантов культуры выполнялись обученным персоналом в лаборатории с высокой степенью локализации. Материалы были вывезены из зоны с высоким уровнем локализации после того, как был выполнен, подтвержден и одобрен институциональной политикой в области биобезопасности действительный метод инактивации. При воспроизведении протокола, если валидированный метод инактивации или стерильной фильтрации невозможен, в лаборатории с высокой степенью локализации необходимо выполнить следующие процед....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Культуральный фильтрат белка (CFP) из Mycobacterium tuberculosis (Mtb) концентрировали, количественно оценивали, а затем 3 мг материала наносили на колонку эксклюзионной хроматографии (SEC). Концентрации белка и частиц были перечислены BCA и NTA соответственно. Ожидаемые диапазоны восстановления белка и частиц плюс точные значения, полученные для этих результатов, приведены в таблице 1. Значения, намного превышающие эти диапазоны, могут указывать на загрязнение или проблемы с целостностью столбц.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Внеклеточные везикулы Микобактерии туберкулеза являются высокоантигенными резервуарами, что представляет их в качестве привлекательного направления для разработки диагностических инструментов и будущих вакцин 4,19,20. Исторически сложилось так, что ультрацентрифугирование градиента плотности использовалось для отделения mtb EV от другого растворимого, секретируемого материала8. Хотя этот процесс .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы выразить признательность NKG за поддержку со стороны Колледжа ветеринарной медицины и биомедицинских наук и Совместной исследовательской программы Исследовательского совета колледжа для NKG и финансирование ATCC (награда No 2016-0550-0002) KMD. Мы также хотели бы поблагодарить Энн Симпсон за техническую поддержку и BEI Resources, NIAID, NIH за следующие реагенты: Моноклональные антимикобактерии туберкулеза LpqH (ген Rv3763), IT-54 (производится in vitro), NR-13792, моноклональные антимикобактерии туберкулеза GroES (ген Rv3418c), клон IT-3 (SA-12) (производится in vitro), NR-49223 и моноклональные антимикобактерии туберкулеза LAM, клон CS-35 (производится ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 20x MES SDS Беговой буфер | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 луночный планшет | Corning | 15705-066 | |
| Автоматический сборщик фракций | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark предварительно окрашенный белковый лестница | Invitrogen | 10748010 | |
| настольная центрифуга | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus - 70 Центробежный фильтр, отсечка 100 кДа | Миллипор Sigma | UFC710008 | Ультрафильтрационное устройство, используемое на этапе 1.1 |
| Система электроблоттинга | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Параформальдегид | Электронная микроскопия Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 меш Cu Сетки | Электронная микроскопия | науки FCF200H-Cu-TA | |
| Козий антимышиный IgG H& L (щелочная фосфатаза), целая молекула, 1 мл | AbCam | ab6790 | Вторичное антитело |
| JEM-1400 Просвечивающий электронный микроскоп | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Считыватель микропланшетов | BIOTEK | Epoch | |
| Моноклональный Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Первичное антитело |
| Моноклональное Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Первичное антитело |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, клон CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Первичное антитело |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | Для плазменной очистки сетки ПЭМ | |
| Nanosight оснащен шприцем, насосом и компьютером с программным обеспечением NanoSight NTA | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose мембрана, рулон, 0,2 шт. m | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Фосфатно-солевой буфер, 1X без кальция и магния | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Analyzer Набор для анализа белка | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad 1645050 | ||
| qEV Original 35 нм 5/шт | IZON Science | SP5-USD | SEC колонка |
| SDS буфер для образцов | Boster | AR1112 | Собственный рецепт используется в этой процедуре, однако этот продукт является эквивалентом |
| SDS-PAGE гелевой камеры | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | В этой процедуре используется внутренний протокол, однако этот набор является эквивалентом |
| Uranyl Acetate | Electronscopy Sciences | 22400 |
Ссылки
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-R....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
