Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышечная модель повреждения брюшины, вызванного хлоргексидином глюконатом

2.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63903

⸱

28 апреля 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, College of Medicine, I-Shou University, 2Division of Nephrology, Department of Internal Medicine, E-DA Hospital, 3Department of Pediatrics, National Cheng Kung University Hospital, 4Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, National Cheng Kung University, 5Division of Nephrology, Department of Internal Medicine, E-DA Dachang Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Настоящий протокол устанавливает модель перитонеального фиброза, индуцированного хлоргексидином глюконатом (КГ), у мышей с помощью перитонеального диализа (ПД). Текущая модель проста и удобна в использовании по сравнению с другими моделями PD на животных.

Аннотация

Перитонеальный фиброз является важным осложнением перитонеального диализа (БП). Для исследования и решения этой проблемы требуется соответствующая животная модель БП. Настоящий протокол устанавливает модель перитонеального фиброза, индуцированную хлоргексидином глюконатом (ХГ), которая имитирует состояние пациента с БП. Перитонеальный фиброз был индуцирован внутрибрюшинной инъекцией 0,1% КГ в 15% этаноле в течение 3 недель (вводили через день), в общей сложности девять раз у самцов мышей C57BL / 6. Затем на 22-й день были проведены перитонеальные функциональные пробы. После того, как мыши были принесены в жертву, была собрана париетальная брюшина брюшной стенки и висцеральная брюшина печени. Они были толще и более фиброзными при микроскопическом анализе после трихромного окрашивания Массона. Скорость ультрафильтрации снизилась, а массовый транспорт глюкозы указал на индуцированное ХГ увеличение проницаемости брюшины. Созданная таким образом модель БП может быть применена для улучшения технологии БП, эффективности диализа и продления выживаемости пациентов.

Введение

Перитонеальный диализ (ПД) является одним из видов заместительной почечной терапии. Однако у ПД есть проблемы, которые невозможно решить. Например, длительное лечение БП может вызвать повреждение брюшины, что в конечном итоге приведет к неудаче ультрафильтрации и прекращению лечения 1,2,3,4,5,6. Перитонеальный фиброз является одним из самых серьезных осложнений 7,8. Перитонеальный фиброз характеризуется отложением и накоплением внеклеточного матрикса в интерстиции, а также неоангиогенезом и васкулопатией брюшины 9,10.

Основными причинами этих перитонеальных изменений являются рецидивирующий перитонит и небиосовместимость диализата, которые являются гиперосмотическими, с высоким содержанием глюкозы, низким рН и накоплением продуктов распада глюкозы11,12. Таким образом, подходящие экспериментальные модели на животных могут помочь исследователям лучше изучить физиологические и патологические изменения брюшины во время терапии БП. Таким образом, создание модели БП животных важно для улучшения технологии БП и эффективности диализа, а также для продления выживаемости пациентов. Это исследование было направлено на создание модели БП у мышей путем внутрибрюшинной (внутривенной) инъекции хлоргексидина глюконата (КГ), как описано ранее13,14. Эта модель мыши PD проста, удобна в использовании и осуществима по сравнению с другими моделями PD животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на мышах были одобрены Центром лабораторных животных больницы E-DA / Университета I-Shou и проводились в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» (NRC, США 2011 г.). Для настоящего исследования использовали самцов мышей C57BL/6 в возрасте 7-8 недель.

1. Химическая подготовка

  1. Приготовьте химический раздражитель, разбавив 0,1% хлоргексидина глюконата (CG, см. Таблицу материалов) в 15% этаноле.

2. Лечение животных

  1. Назначьте трех мышей в качестве контрольной группы. Выполняйте внутрибрюшинную инъекцию (в/) 1 мл/кг 0,9% физиологического раствора (НС) через день в течение 3 недель, всего девять раз.
  2. Назначьте трех мышей в группу перитонеального фиброза. Индуцировать перитонеальный фиброз с помощью хлоргексидина глюконата (ХГ) путем внутримышечного введения 0,1% ХГ в 15% этаноле (этап 1.1) в дозе 12,5 мкл / г массы тела. Выполняйте это через день в течение 3 недель, всего девять раз.

3. Тесты функции брюшины (модифицированный тест перитонеального равновесия)

  1. Приготовьте диализирующий раствор, содержащий 4,25% глюкозы. Возьмите 0,5 мл образца диализата с помощью шприца, а затем проверьте концентрацию глюкозы в образце диализата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация глюкозы определяется по методу гексокиназы/G6PD. Образцы диализата были подвергнуты анализу Glu 2 L-типа и исследованы с помощью биохимического анализатора (см. Таблицу материалов). Это начальная концентрация глюкозы диализата.
  2. Обезболивают мышей внутримышечным введением Золетила и Ксилазина (приготовленных в соотношении 1:2 по объему, см. Таблицу материалов) в дозе 20 мкл/20 гв. Кроме того, используйте ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  3. Проводят внутривенную инстилляцию диализирующего раствора (2 мл/20 г массы тела).
  4. Через 30 минут оцените и проверьте глубину анестезии при отсутствии рефлекса защемления пальцев ног. Затем выполните вертикальный разрез по средней линии брюшной полости (под мечевидным отростком), затем откройте брюшную полость мышей и соберите внутрибрюшинную жидкость с помощью шприца (определяемого как «объем 1»). Затем измерьте вес чистого и сухого хлопка и поместите вату в брюшную полость мышей, чтобы поглотить остаточную внутрибрюшинную жидкость. Наконец, снова измерьте вес хлопка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прибавка в весе хлопка равна весу остаточной внутрибрюшинной жидкости. Затем преобразуйте в полученный объем (удельный вес: 1 г/см3; определяется как «объем 2»). Окончательный объем диализата составляет том 1 плюс том 2.
  5. Используйте 0,5 мл образца диализата (конечный диализат) для измерения концентрации глюкозы. Это конечная концентрация глюкозы диализата.
  6. Рассчитайте чистую ультрафильтрацию по формуле15:
    figure-protocol-1
  7. Рассчитайте проницаемость брюшины по следующей формуле15:
    figure-protocol-2

4. Тканевая подготовка мышц брюшной стенки и печени и гистологический анализ

  1. Принесите мышей в жертву с помощью пункции сердца (флеботомии)3,16.
  2. Разрез брюшной стенки (1 см х 1 см) и тотальная гепатэктомия. Зафиксируйте брюшную стенку и ткани печени мышей на ночь в 10% нейтральном буферном формалине.
  3. Подготовьте парафиновые срезы мышц брюшной стенки и печени толщиной 3 мкм и проведите гистологический анализ в соответствии с ранее опубликованным отчетом17.
  4. Оцените париетальную брюшину брюшной стенки и висцеральную брюшину поверхности печени мышей с помощью морфометрии18.
  5. Выполняйте статистический анализ с помощью программного обеспечения для статистики и построения графиков (см. Таблицу материалов). Выразите все данные как среднее ± SD и проанализируйте статистическую значимость с помощью t-критерия19. Определите значения с P < 0,05 как значимые результаты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1A, B париетальная брюшина брюшной стенки была заметно толще и более фиброзной при трихромном окрашиванииМассона 17, что указывает на то, что в группе, подвергшейся воздействию ХГ, перитонеальный фиброз более тяжелый, чем в контрольной группе с физиологическим раствором (NS). На рисунке 2A, B висцеральная брюшина поверхности печени также была заметно толще и более фиброзной, что доказывает, что...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании модель БП мыши представлена внутримышной инъекцией ХГ, и результаты показали перитонеальный фиброз и функциональное ухудшение в этой модели, которая имитировала состояние пациента с БП.

В протоколе есть несколько важных шагов. Во-первых, для выполнения внутривенной инъекции CG или NS кожа брюшной стенки мыши должна быть подобрана с помощью щипцов, чтобы предотвратить индуцированное пункцией внутрибрюшинное повреждение органов. Во-вторых, при сборе брюшины брюшной стенки для...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Мы искренне благодарим Шин-Хан Ценга за критическое обсуждение и частичное выполнение исследования. Это исследование было поддержано EDAHP110003 и NCKUEDA110002 из Исследовательского фонда больницы E-DA и Национального университета Ченг Кунг, Тайвань.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,9% Нормальный физиологический растворY F CHEMICAL CORP., Нью-Тайбэй,Тайвань-10
% нейтральный буферизованный формалинTaiwan Burnett International Co., Ltd., Тайбэй, Тайвань00002A
Автоматический биохимический анализаторHitachi Ltd., Токио, ЯпонияLabospect Series 008для определения концентрации глюкозы
Раствор хлоргексидина диглюконата, 20% в H2OSigma-Aldrich, MO, СШАC9394разбавленный до 0,1% 15% этанолом для инъекций
ЭтанолAvantor Performance Materials, LLC, PA, СШАBAKR8006-05разбавленный до 15% нормальным физиологическим раствором для рабочей концентрации
глюкоза (дианеальная)Baxter International, Inc., IL, США FNB9896Коммерческий раствор для диализа (4,25%)
GraphPad Prism 8.0Программное обеспечение GraphPad, Inc., CA, US
L-type Glu 2 анализFUJIFILM Wako, Япония461-32403
Xylazine 20Juily Pharmaceutical Co., Ltd., Нью-Тайбэй,Тайвань-Zoletil
50Virbac Laboratories, Carros, Франция-

Ссылки

  1. Han, S. H., et al. Improving outcome of CAPD: twenty-five years' experience in a single Korean center. Peritoneal Dialysis International. 27 (4), 432-440 (2007).
  2. Kawaguchi, Y., Hasegawa, T., Nakayama, M., Kubo, H., Shigematu, T. Issues affecting the longevity of the continuous peritoneal dialysis therapy. Kidney International Supplements. 62, 105-107 (1997).
  3. Lee, Y. C., et al. Vitamin D can ameliorate chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis and functional deterioration through the inhibition of epithelial-to-mesenchymal transition of mesothelial cells. BioMed Research International. 2015, 595030(2015).
  4. Nakamoto, H., Kawaguchi, Y., Suzuki, H. Is technique survival on peritoneal dialysis better in Japan. Peritoneal Dialysis International. 26 (2), 136-143 (2006).
  5. Schaefer, F., Klaus, G., Muller-Wiefel, D. E., Mehls, O. Current practice of peritoneal dialysis in children: results of a longitudinal survey. Mid European Pediatric Peritoneal Dialysis Study Group (MEPPS). Peritoneal Dialysis International. 19, Suppl 2 445-449 (1999).
  6. Woodrow, G., Turney, J. H., Brownjohn, A. M. Technique failure in peritoneal dialysis and its impact on patient survival. Peritoneal Dialysis International. 17 (4), 360-364 (1997).
  7. Schmidt, D. W., Flessner, M. F. Pathogenesis and treatment of encapsulating peritoneal sclerosis: basic and translational research. Peritoneal Dialysis International. 28, Suppl 5 10-15 (2008).
  8. Augustine, T., Brown, P. W., Davies, S. D., Summers, A. M., Wilkie, M. E. Encapsulating peritoneal sclerosis: clinical significance and implications. Nephron Clinical Practice. 111 (2), 149-154 (2009).
  9. Di Paolo, N., Nicolai, G. A., Garosi, G. The peritoneum: from histological studies to mesothelial transplant through animal experimentation. Peritoneal Dialysis International. 28, Suppl 5 5-9 (2008).
  10. Fusshoeller, A. Histomorphological and functional changes of the peritoneal membrane during long-term peritoneal dialysis. Pediatric Nephrology. 23 (1), 19-25 (2008).
  11. Goffin, E. Peritoneal membrane structural and functional changes during peritoneal dialysis. Seminars in Dialysis. 21 (3), 258-265 (2008).
  12. Ito, T., Yorioka, N. Peritoneal damage by peritoneal dialysis solutions. Clinical and Experimental Nephrology. 12 (4), 243-249 (2008).
  13. Io, K., et al. SAHA suppresses peritoneal fibrosis in mice. Peritoneal Dialysis International. 35 (3), 246-258 (2015).
  14. Yoh, K., Ojima, M., Takahashi, S. Th2-biased GATA-3 transgenic mice developed severe experimental peritoneal fibrosis compared with Th1-biased T-bet and Th17-biased RORgammat transgenic mice. Experimental Animals. 64 (4), 353-362 (2015).
  15. Karl, Z. J. T., et al. Peritoneal Equilibration Test. Peritoneal Dialysis International. 7 (3), 138-148 (1987).
  16. Lee, Y. C., et al. The clinical implication of vitamin D nanomedicine for peritoneal dialysis-related peritoneal damage. International Journal of Nanomedicine. 14, 9665-9675 (2019).
  17. Goldner, J. A. Modification of the masson trichrome technique for routine laboratory purposes. The American Journal of Pathology. 14 (2), 237-243 (1938).
  18. Cheng, F. Y., et al. Novel application of magnetite nanoparticle-mediated vitamin D3 delivery for peritoneal dialysis-related peritoneal damage. International Journal of Nanomedicine. 16, 2137-2146 (2021).
  19. Ross, A., Willson, V. L. Basic and Advanced Statistical Tests: Writing Results Sections and Creating Tables and Figures. , SensePublishers. 13-16 (2017).
  20. Suga, H., et al. Preventive effect of pirfenidone against experimental sclerosing peritonitis in rats. Experimental and Toxicologic Pathology. 47 (4), 287-291 (1995).
  21. Ishii, Y., et al. An experimental sclerosing encapsulating peritonitis model in mice. Nephrology Dialysis Transplantation. 16 (6), 1262-1266 (2001).
  22. Nishino, T., et al. Antisense oligonucleotides against collagen-binding stress protein HSP47 suppress peritoneal fibrosis in rats. Kidney International. 64 (3), 887-896 (2003).
  23. Mishima, Y., et al. Enhanced expression of heat shock protein 47 in rat model of peritoneal fibrosis. Peritoneal Dialysis International. 23 (1), 14-22 (2003).
  24. Kushiyama, T., et al. Effects of liposome-encapsulated clodronate on chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (10), 3143-3154 (2011).
  25. Nishino, T., et al. Involvement of lymphocyte infiltration in the progression of mouse peritoneal fibrosis model. Renal Failure. 34 (6), 760-766 (2012).
  26. Lua, I., Li, Y., Pappoe, L. S., Asahina, K. Myofibroblastic conversion and regeneration of mesothelial cells in peritoneal and liver fibrosis. The American Journal of Pathology. 185 (12), 3258-3273 (2015).
  27. Kitamura, M., et al. Epigallocatechin gallate suppresses peritoneal fibrosis in mice. Chemico-Biological Interactions. 195 (1), 95-104 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Перитонеальный фиброзперитонеальный диализмышиная модельвнутрибрюшинная инъекцияпроницаемость брюшиныокрашивание по Массонумассовый транспорт глюкозыскорость ультрафильтрациимодель животного
Мышечная модель повреждения брюшины, вызванного хлоргексидином глюконатом
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.