Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы мыши

4.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63916

⸱

6 апреля 2022 г.

 , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Penn State College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы является жизнеспособным методом модуляции экспрессии генов без ущерба для сократимости мышц у мышей.

Аннотация

Транзиторная модуляция экспрессии генов в мышиных скелетных мышцах путем плазмидной электропорации является полезным инструментом для оценки нормальной и патологической физиологии. Сверхэкспрессия или нокдаун генов-мишеней позволяет исследователям манипулировать отдельными молекулярными событиями и, таким образом, лучше понимать механизмы, которые влияют на мышечную массу, мышечный метаболизм и сократимость. Кроме того, электропорация плазмид ДНК, которые кодируют флуоресцентные метки, позволяет исследователям измерять изменения субклеточной локализации белков в скелетных мышцах in vivo. Ключевая функциональная оценка скелетных мышц включает измерение сократимости мышц. В этом протоколе мы демонстрируем, что исследования сократимости целых мышц все еще возможны после инъекции плазмидной ДНК, электропорации и модуляции экспрессии генов. Целью этой учебной процедуры является демонстрация пошагового метода плазмидной электропорации ДНК в скелетные мышцы мыши для облегчения поглощения и экспрессии в миофибрах передней и разгибательной мышц большеберцовой кости, а также демонстрация того, что сократимость скелетных мышц не нарушается инъекцией и электропорацией.

Введение

Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы in vivo является важным инструментом для оценки изменений в физиологии скелетных мышц и молекулярной сигнализации путем модуляции экспрессии генов в различных физиологических и патофизиологических условиях 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Экспериментальный перенос генов в скелетные мышцы был продемонстрирован еще в 1990 году Wolff et al., где как РНК, так и ДНК были успешно перенесены без электропорации, а экспрессия люциферазы поддерживалась в течение не менее 2 месяцев10. Относительно низкая эффективность трансфекции только при инъекции проблематична, и Айхара и Миядзаки продемонстрировали повышенный перенос генов с электропорацией в 1998 году путем электропорации конструкции pCAGGS-IL-5 в переднюю мышцу большеберцовой кости (TA) и измерения экспрессии IL-5 сыворотки11. С тех пор во многих исследованиях изучалась эффективность различных концентраций ДНК, объемов и параметров электропорации для обеспечения максимальной эффективности переноса генов. Mir et al. проверили различные параметры электропорации, включая напряжение, число импульсов, продолжительность и частоту импульса, а также концентрацию ДНК, и определили, что большее напряжение, число импульсов и концентрация ДНК способствовали увеличению эффективности электропорации12. Основным предостережением к высокому электропорационному напряжению является то, что, хотя оно способствует увеличению поглощения ДНК миофибрами, оно также вызывает повреждение мышц, что может сбить с толку результаты. Schertzer et al. показали, что электропорация при 200 В вызывала повреждение примерно у 50% миофибров через 3 дня после электропорации, тогда как только 10% миофибров были повреждены при 50 В13. Мы приняли во внимание переменные, влияющие на эффективный перенос ДНК по сравнению с повреждением мышц, и обнаружили, что напряжение 125 В на сантиметр ширины суппорта достаточно для достижения эффективного переноса генов.

Анализ площади поперечного сечения мышечного волокна и сократимости всей мышцы после электропорации является важным аспектом метода измерения изменений размера и функции мышц из-за модуляции генов. Мы и другие ранее продемонстрировали, что электропорация контрольных векторов сама по себе не вызывает уменьшения площади миофибры. Конструкция зеленого флуоресцентного белка (EGFP) была полезным флуоресцентным индикатором трансфекции ДНК в этих исследованиях13,14. Ряд исследований исследовали сократимость ТА in situ после электропорации и обнаружили различные результаты. Одно исследование показало, что электропорация 75 В/см вызвала около 30% снижения тетановой силы через 3 дня после электропорации, а через 7 дней после электропорации тетаническая сила вернулась к контрольному уровню, в то время как электропорация 50 В/см не ставила под угрозу силу13,15. Другое исследование показало, что была 30% потеря тетанической силы через 3 ч после электропорации 180 В / см, которая восстановилась до фиктивных уровней силы через 7 дней16.

В следующей подробной процедуре мы демонстрируем инъекцию и электропорацию плазмиды PCDNA3-EGFP в мышцах ТА и разгибателя digitorum longus (EDL) мышей. Мы также демонстрируем, что этот метод не влияет на сократимость всей мышцы EDL. Цель состоит в том, чтобы продемонстрировать эффективное поглощение плазмид в миофибрах, не вызывая потери функции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты с использованием животных проводились в Медицинском колледже штата Пенсильвания, одобрены Комитетом по институциональным уходу и использованию животных Университета штата Пенсильвания и проводились в соответствии с этическими стандартами, изложенными в Хельсинкской декларации 1964 года и последующих поправках к ней. Для этой процедуры использовались 12-недельные самки мышей C57BL/6. Все хирургические инструменты были автоклавированы для стерильности перед экспериментами.

1. Препарат для инъекций/электропорации ТА и ЭДЛ

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти этапы идентичны для приготовления инъекций/электропорации ТА и ЭДЛ.

  1. Плазмиды очищения экспрессии до концентрации 1 мкг/мкл, разбавленной в стерильном PBS до начала эксперимента. Для этой процедуры использовался коммерчески доступный набор для очистки без эндотоксинов для очистки пустого вектора pcDNA3-EGFP (GFP) или pcDNA3 (контроль).
  2. Рассчитать концентрацию плазмиды для обеспечения адекватного объема инъекции (ТА 50 мкг ДНК в 50 мкл стерильного PBS; EDL 10 мкг ДНК в 10 мкл стерильных PBS) и аликвотные образцы.
  3. Запрограммируйте настройки электропоратора с помощью выбранного колеса и нажатием на колесо для выбора параметров следующим образом: Режим - НН, Напряжение - 12,5 В/мм (регулируется в момент впрыска), длина импульса - 20 мс, количество импульсов - 5, интервал - 200 мс, полярность - униполярная.
  4. Обезболивайте мышей, используя газ изофлуран. Поместите мышей в индукционную коробку с 5% изофлураном. Подтверждают хирургическую плоскость анестезии отсутствием рефлекса защемления пальца ноги с помощью щипцов и снижают изофлуран до 2% поддерживающей дозы. Переведите мышей в соответствующий носовой конус, опирающийся на пластину циркулирующей воды при 37 °C для остальной части процедуры.
  5. Удалите волосы с обеих задних конечностей с помощью небольших машинок для резания волос. Очистите нижние конечности чередованием 70% этанола / бетадина для дезинфекции области инъекции.

2. Впрыск ТА/электропорация

  1. Когда мышь находится в положении лежа, найдите сухожилие TA, видимое через кожу на боковой стороне голени. Используя микрошприц объемом 50 мкл со съемной иглой 30 Г, вставьте иглу на 1-2 мм выше миотендинозного соединения под небольшим углом 5°, пока игла не достигнет верхнего конца мышцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция в середину мышцы является целью.
  2. Медленно нажмите на плунжер, медленно втягивая иглу вдоль пути инъекции, чтобы доставить 50 мкл плазмидного раствора. Мышца должна набухать.
  3. Установите таймер на 1 мин и измерьте толщину ножки на ТА. В зависимости от размера мыши это может быть от 5-10 мм. Установите электроды суппорта на измеряемую толщину и установите напряжение электропоратора на 12,5 В/мм.
  4. Через 1 мин поместите электроды суппорта вокруг нижней конечности. Электроды должны быть плотными, но не чрезмерно плотными. Подайте 5 импульсов квадратной волны с длительностью 20 мс и интервалами 200 мс (мышца должна дергаться с каждым импульсом).
  5. Повторите с альтернативной конечностью, используя контрольный вектор.
  6. Выньте мышь из наркоза и дайте ей восстановиться на грелке, установленной на 37 °C. После выздоровления верните мышь в клетку.

3. Впрыск/электропорация EDL

  1. Когда мышь находится в положении лежа, найдите передний гребень большеберцовой кости визуально и с помощью мягкой пальпации.
    1. С помощью скальпеля делают неглубокий разрез через кожу на боковой стороне переднего гребня большеберцовой кости на 5 мм ниже колена на 2 мм выше миотендинозного соединения ТА.
    2. С помощью небольших ножниц тупое рассечение фасции, обнажая мышцу ТА.
    3. Опять же, используя тупое рассечение ножницами, отделите мышцу ТА от большеберцовой кости осторожно, потянув мышцу сбоку, обнажив EDL. Небольшие, изогнутые щипцы могут быть использованы для поддержания ТА чистым от EDL во время процедуры.
  2. Используя микрошприц объемом 50 мкл со съемной иглой 30 г, вставьте иглу в EDL продольно, пока игла не достигнет верхнего конца мышцы.
  3. Медленно нажмите на плунжер, медленно втягивая иглу вдоль пути инъекции, чтобы ввести 10 мкл плазмидного раствора (мышца должна набухать).
  4. Установите таймер на 1 мин и измерьте толщину ножки на EDL. В зависимости от размера мыши это может быть от 5-10 мм. Установите электроды суппорта на измеряемую толщину и установите напряжение электропоратора на 12,5 В/мм.
  5. Через 1 мин поместите электроды суппорта вокруг нижней конечности. Электроды должны быть плотными, но не чрезмерно плотными. Подайте 5 импульсов квадратной волны с длительностью 20 мс и интервалами 200 мс (мышцы должны дергаться с каждым импульсом).
  6. Закройте разрез одноразовыми нерассасывающимися нейлоновыми швами 4/0.
  7. Повторите с альтернативной конечностью или оставьте конечность нетронутой в качестве абсолютного контроля.
  8. Выньте мышь из наркоза и дайте ей восстановиться на грелке, установленной на 37 °C. Вводят соответствующий подкожный анальгетик сразу после операции и через 12-24 ч после операции. После выздоровления верните мышь в клетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие исследования показали дефицит сократимости мышц в ТА сразу после электропорации и то, что сократительное восстановление происходит в течение 3 дней13,15. По этой причине анализ мышц ТА и ЭДЛ на гистологию, экспрессию белка или сократимость мышц проводится через 3-10 дней после электропорации. Длительная экспрессия EGFP наблюдалась до 3 недель после процедуры13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Электропорация для облегчения переноса генов в скелетных мышцах является полезным методом, используемым для оценки изменений в физиологии мышц. Мы продемонстрировали подробную, пошаговую процедуру для достижения эффективного переноса генов как в мышцах ТА, так и в мышцах EDL. Различия в эффективности трансфекции возникают из-за ряда переменных. Среди этих переменных - параметры электропорации (импульсы, напряжение, длительность импульса и т. Д.), Размер конструкции гена и концентрация / объем вводимой ДНК. Ранее мы показ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Перенос генов in vivo в скелетных мышцах, усиленный электропорацией, является полезным и относительно простым инструментом для модуляции экспрессии белка в мышцах. Мы показали шаги, необходимые для достижения эффективного переноса генов в мышцах EDL и TA, и продемонстрировали, что измерение сократимости EDL является жизнеспособным после процедуры. Этот метод не требует более сложных вирусных векторов и позволяет сравнивать трансфектированную и нетрансфектную область поперечного сечения мышечного волокна в одной ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

B.A.H. и D.L.W не заявляют о конфликте интересов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4-0 Нейлоновый шовный материал (нерассасывающийся)Ethicon662GШовный материал для закрытого разреза кожи
50&микро; l Шприц Hamilton80501микрошприц
C57BLl/6NHsd мышиEnvigo04412-недельные самки мышей, используемые для экспериментов
Электрод штангенциркуляBTX45-01021,0 см x 1,0 см нержавеющая сталь
Динамический контроль мышц Сбор / анализ данныхAurora Scientific605AПрограммное обеспечение используется для измерения и анализа сократимости мышц
ECM 830 Электропорационная системаBTX45-0662Электропоратор
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362Набор для очистки плазмид
Экстра узкие ножницыFine Science Tools14088-10Ножницы для тупого рассечения
Преобразователь силыAurora Scientific407AДля измерения силы от EDL
Micro-Masquito HemastatsFine Science Tools13010-12Гемастаты для исследования
pcDNA3.1 вектор экспрессии у млекопитающихFisher ScientificV79020Контрольный вектор
экспрессии pcDNA3-EGFP плазмидаAddgene13031Плазмида для экспрессии GFP
Изогнутые щипцы SemkenFine Science Tools11009-13Щипцы для хирургии
Хирургические лезвия из нержавеющей стали No 10Becton Dickinson37 1210Лезвия скальпеля
Tissue-Tek O.C.T. mediaVWR25608-930Замораживающие среды для гистологии
Агглютинин зародышей пшеницы- Texas RedThermo-Fisher ScientificW21405Мембранное окрашивание для сечения мышц

Ссылки

  1. Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
  2. Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
  3. Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
  4. Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
  5. Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
  6. Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
  7. Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
  8. Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
  9. Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
  10. Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
  11. Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
  12. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
  13. Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
  14. Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
  15. Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
  16. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
  17. Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
  18. Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
  19. Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
  20. Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
  21. Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732(2015).
  22. Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
  23. Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
  24. Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
  25. Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Электропорация плазмидперенос геновскелетные мышцы мышисократимость мышцинъекция ДНКмодуляция экспрессии геновпередняя большеберцовая мышцадлинный разгибатель пальцевлокализация белка
Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы мыши
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.