Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Количественная 3D-визуализация клеток, инфицированных Trypanosoma cruzi, спящих амастиготов и Т-клеток в интактных осветленных органах

3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63919

⸱

23 июня 2022 г.

 ,  ,  ,  , 
1Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

В этой статье

Краткое содержание

Настоящий протокол описывает флуоресцентную микроскопию и автоматизированные программные методы визуализации и точной количественной оценки размножающихся и спящих паразитов Trypanosoma cruzi и Т-клеток в неповрежденных, очищенных органах и тканях. Эти методы обеспечивают надежный способ оценки результатов лечения и предлагают новое понимание взаимодействия паразита и хозяина.

Аннотация

Болезнь Шагаса является забытой патологией, которая поражает миллионы людей во всем мире, в основном в Латинской Америке. Возбудитель болезни Шагаса, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), является облигатным внутриклеточным паразитом с разнообразной биологией, который заражает несколько видов млекопитающих, включая человека, вызывая сердечные и пищеварительные патологии. Надежное выявление инфекций T. cruzi in vivo уже давно необходимо для понимания сложной биологии болезни Шагаса и точной оценки результатов схем лечения. Текущий протокол демонстрирует интегрированный конвейер для автоматизированной количественной оценки клеток, инфицированных T. cruzi, в 3D-реконструированных, очищенных органах. Флуоресцентная микроскопия позволяет точно визуализировать и количественно оценивать активно размножающихся и спящих паразитов T. cruzi и иммунных эффекторных клеток в целых органах или тканях. Также был успешно принят конвейер CUBIC-HistoVision для получения равномерной маркировки очищенных органов антителами и ядерными пятнами. Очистка тканей в сочетании с 3D-иммуноокрашиванием обеспечивает непредвзятый подход к всесторонней оценке протоколов лечения лекарственными препаратами, улучшает понимание клеточной организации тканей, инфицированных T. cruzi, и, как ожидается, будет способствовать открытиям, связанным с иммунными реакциями против T. cruzi , повреждением тканей и восстановлением при болезни Шагаса.

Введение

Болезнь Шагаса, вызванная простейшим паразитом T. cruzi, является одной из самых забытых тропических болезней в мире, вызывая около 13 000 ежегодных смертей. Инфекция часто прогрессирует от острой к хронической стадии, вызывая сердечную патологию у 30% пациентов, включая аритмии, сердечную недостаточность и внезапную смерть 1,2. Несмотря на сильный иммунный ответ хозяина, вызванный против паразита во время острой фазы, низкое количество паразитов хронически сохраняется на протяжении всей жизни хозяина в тканях, таких как сердце и скелетные мышцы. Несколько факторов, включая отсроченное начало адаптивных иммунных реакций и наличие нереплицирующих форм паразита, могут способствовать способности T. cruzi избегать полного устранения иммунной системой 3,4,5,6. Кроме того, невоспроизводящиеся спящие формы паразита демонстрируют низкую восприимчивость к трипаноцидным препаратам и могут частично быть ответственны за неудачу лечения, наблюдаемую во многих случаях 7,8.

Разработка новых методов визуализации дает возможность получить представление о пространственном распределении паразитов в инфицированных тканях и их взаимосвязи с иммунными клетками, участвующими в их контроле. Эти характеристики имеют решающее значение для лучшего понимания процессов борьбы с паразитами иммунной системой и отслеживания редких спящих паразитов, присутствующих в хронических тканях.

Светоплавная флуоресцентная микроскопия (LSFM) является одним из наиболее полных и непредвзятых методов для 3D-визуализации крупных тканей или органов без тонкого сечения. Световые микроскопы используют тонкий лист света, чтобы возбуждать только флуорофоры в фокальной плоскости, уменьшать фотоотбеливание и фототоксичность образцов и записывать изображения тысяч слоев тканей с помощью сверхбыстрых камер. Высокий уровень прозрачности тканей, необходимый для правильного проникновения лазерного света в ткани, получен путем гомогенизации показателя преломления (RI) после делипидации и обесцвечивания тканей, что уменьшает рассеяние света и выдаетвысококачественные изображения 9,10,11.

Разработаны подходы к очистке тканей для визуализации целых мышей 12,13,14, органоидов 15,16,17, органов, экспрессирующих репортерные флуоресцентные маркеры 18,19,20,21,22,23, а в последнее время ограниченного числа тканей человека 24 . Современные методы очистки тканей подразделяются на три семейства: (1) методы на основе органических растворителей, такие как протоколы DISCO 25,26, (2) методы на основе гидрогеля, такие как CLARITY27, и водные методы, такие как CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . Протоколы CUBIC поддерживают форму органа и целостность тканей, сохраняя флуоресценцию эндогенно экспрессируемых репортерных белков. Самое последнее обновление этого метода, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), также позволяет обнаруживать эпитопы с использованием флуоресцентно меченых антител и маркировки ДНК28.

В настоящем протоколе использовался конвейер CUBIC для обнаружения T. cruzi , экспрессирующих флуоресцентные белки в осветленных интактных тканях мыши. Оптически прозрачные ткани были визуализированы LSFM, реконструированы в 3D, а точное общее количество инфицированных T. cruzi клеток, спящих амастиготов и Т-клеток на орган было автоматически количественно определено. Также этот протокол был успешно принят для получения единообразной маркировки очищенных органов антителами и ядерными пятнами. Эти подходы необходимы для понимания расширения и контроля T. cruzi у инфицированных хозяев и полезны для полной оценки химио- и иммунотерапевтических средств для болезни Шагаса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование было проведено в строгом соответствии с Политикой Службы общественного здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных животных и Руководством Ассоциации по оценке и аккредитации аккредитации по уходу за лабораторными животными. Протокол использования животных (контроль инфекции T. cruzi у мышей-A2021 04-011-Y1-A0) был одобрен Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Джорджии. В6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J и C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J мыши (самки, 1-2 месяца) использовались для настоящего исследования. Мыши были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов).

1. Инфекция, перфузия и рассечение

  1. Внутрибрюшинно заражают мышей трипомастиготами колумбийского (DTU TcI) или бразильского (DTU TcV) штамма T. cruzi , экспрессирующими флуоресцентные белки tdTomato или GFP соответственно. Доза инфекции может варьироваться от 50 000 до 200 000 трипомастиготов, разбавленных в 100 мкл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные подробности о генерации паразитов-репортеров и мышиных моделях инфекции доступны в Canavaci et al. пункт 29 и Бустаманте и др.30.
  2. Усыпляют мышей путем вдыхания углекислого газа со скоростью потока 3-7 л/мин. Как только животные перестанут проявлять какой-либо педальный рефлекс, сделайте продольный разрез через кожу от брюшка по направлению к грудине. Затем отрежьте стенку тела от живота и продолжайте через ребра с каждой стороны грудной клетки, пока грудина не будет поднята, обнажая сердце.
  3. Как описано на рисунке 1, сделайте разрез 2,5 мм в правой ушной раковине сердца и соберите дренажную кровь с помощью кончика микропипетки объемом 1 мл.
  4. Вставьте иглу бабочки (соединенную с одним концом перфузионной системы) в вершину левого желудочка, пока она не достигнет восходящей аорты. Используйте клей на основе геля (см. Таблицу материалов) для герметизации входного отверстия вокруг иглы и поддержания иглы в положении во время перфузий.
  5. Перфьюируйте мышей30 с 50 мл холодного гепарина-PBS (рН 7,4, 10 Ед/мл гепарина) или до тех пор, пока жидкость, которая выходит из мыши к лотку для сбора, не будет очищена от крови.
  6. Перфьюсировать с 50 мл холодного 4% (мас./об.) параформальдегида (PFA) (рН 7,4) в PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация ткани PFA, вероятно, является одним из критических этапов протокола, особенно для поддержания эпитопных структур и последующей иммунодетекции. PFA со временем разлагается, поэтому он должен быть свежеприготовленным. рН раствора также важен, чтобы избежать чрезмерной фиксации, которая может привести к плохой очистке тканей.
    ВНИМАНИЕ: PFA умеренно токсичен при контакте с кожей. Острое воздействие также сильно раздражает нос, глаза и горло. Длительное воздействие низких уровней в воздухе или коже может вызвать раздражение кожи, такое как дерматит и зуд, а также астматические респираторные проблемы. Носите защиту лица и глаз и не дышите пылью, газом, туманом, парами или парами.
    1. После перфузии PFA перфузии перфьюируйте мышь 100 мл буфера CUBIC-P для достижения уровней прояснения, упомянутых на этапе 1.5.
    2. Для получения буфера CUBIC-P растворите 10% N-бутилдиэтаноламина, 5% тритона X-100 и 5% 1-N-метилимидазола в двухдистиллированной воде или используйте коммерческие коктейли (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 1.6.1.-1.6.2. рекомендуются только для высокопигментированных органов, таких как сердце и почки, поскольку они требуют предварительного этапа очистки для получения повышенного уровня прозрачности. После использования CUBIC-P рассекните органы и приступайте непосредственно к шагу 2: Очистка тканей.
  7. Рассекните образцы тканей/органов30 для получения изображения и зафиксируйте их в 4% (мас./об.) PFA в PBS (~10 мл/весь орган) в течение ночи (ON) при 4 °C с мягким встряхиванием (не более 5 x g) в конических трубках по 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все инкубации, начиная с этого момента, должны выполняться на трубах, укладываемых горизонтально при температуре 20-30 °C, защищенных от света.
  8. Промыть образец в 10 мл PBS (дополненного 0,05% азида натрия (NaN3) в течение 3 ч (три раза) при комнатной температуре (RT) с легким встряхиванием (5 x g).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани могут быть заморожены путем инкубации в 10 мл 30% сахарозы в PBS с мягким встряхиванием (5 х г) при 4 °C ON в конических пробирках по 50 мл. После того, как ткани опустятся на дно трубки, вставьте их в соединение OCT и держите при -80 °C. Разморозить при РТ до полного расплавления соединения ОКТ, затем промыть в PBS (~10 мл/весь орган) ON при 4 °C с мягким встряхиванием (5 х г) в конических пробирках по 50 мл. Перейдите к шагу 2.

2. Очистка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Все очистки тканей, выполненные в этой работе, были выполнены с использованием протокола CUBIC I22. Были использованы три различных коктейля: CUBIC-P для делипидации и быстрого обесцвечивания во время перфузий, CUBIC-L для делипидации и обесцвечивания и CUBIC-R для сопоставления RI. Окрашивание ДНК и иммуноокрашивание проводились с использованием набора для ядерного окрашивания CUBIC-HV 1 3D и комплекта иммуноокрашивания CUBIC-HV 1 3D соответственно (см. Таблицу материалов).

  1. Погружают отдельные органы в 10 мл 50% разбавленного водой CUBIC-L (см. Таблицу материалов) с легким встряхиванием (5 х г) при РТ (ON) в конических трубках по 50 мл. Держите трубки плоскими на трясущейся пластине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать повреждения тканей, органы поддерживаются в одной трубке, а растворы собираются с помощью вакуумной системы. Для приготовления CUBIC-L растворяют 10% N-бутилдиэтаноламин и 10% Тритон Х-100 в двухдистиллированной воде с использованием коммерческих коктейлей (см. Таблицу материалов).
    ВНИМАНИЕ: CUBIC-L вызывает серьезные повреждения глаз. Носите средства защиты для глаз и лица. Утилизируйте на утвержденном заводе по утилизации отходов.
  2. Погружают образец в 10 мл 100% CUBIC-L в течение 6 дней (освежая раствор на 3 день).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В конце этого инкубационного периода ткани должны быть почти полностью прозрачными.
  3. Промыть прозрачные органы PBS (дополненным 0,05% NaN3) в течение 2 ч (три раза) при 37 °C с легким встряхиванием (5 х г). Переносите ткани в новую коническую трубку объемом 50 мл с каждой промывкой, чтобы удалить Triton X-100.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как описано на рисунке 2B, если целью эксперимента является визуализация эндогенно экспрессированных репортерных белков трансгенных паразитов T. cruzi или мышей (рисунок 2C-F), пропустите шаги 3, 4 и 5 и перейдите непосредственно к шагу 6.

3. Окрашивание ДНК

  1. Разбавляют коммерчески доступный краситель нуклеиновой кислоты (см. Таблицу материалов) в 5 мл окрашивающего буфера (входит в комплект) при разведении 1/2 500.
  2. Погрузить ткань в раствор ядерного красителя и инкубировать при 37 °C с мягким вращением в течение 5 дней с использованием конических трубок по 15 мл в положении стоя.
  3. Промывайте 15 мл 3D ядерного окрашивающего промывочного буфера (входит в комплект) в течение 2 ч (три раза) на РТ с мягким встряхиванием (5 х г).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие ДНК-красители могут быть использованы в этих концентрациях и времени инкубации: DAPI (входит в комплект): 1/200, 5 дней инкубации; БОБО-1: 1/400, 5 дней инкубации; Пропидия йодида (PI) (входит в комплект): 1/100, 3 дня инкубации; RedDot2: 1/250, 3 дня инкубации. Если конкретная цель эксперимента состоит в том, чтобы визуализировать оба эндогенно экспрессированных репортерных белка и использовать ядерные пятна, пропустите шаги 4 и 5 и перейдите непосредственно к шагу 6.

4. Пищеварение внеклеточного матрикса (ECM)

ПРИМЕЧАНИЕ: Гиалуронидазное переваривание ECM должно быть выполнено для облегчения надлежащего проникновения антител в глубокие области тканей28.

  1. Погружайте отдельные органы в 15 мл реакционного буфера гиалуронидазы в течение 2 ч при 37 °C в коническую трубку объемом 50 мл в плоском положении, защищенном от света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения реакционного буфера гиалуронидазы растворяют 10 мМ КАПСО; 150 мМ хлорида натрия (NaCl) и 0,05% NaN3 (см. Таблицу материалов) в двухдистиллированной воде и отрегулируйте рН до 10.
  2. Готовят ферментный раствор путем смешивания 75 мкл 20 мг/мл гиалуронидазы с 425 мкл реакционного буфера гиалуронидазы. Для получения 20 мг/мл запаса гиалуронидазы растворяют гиалуронидазу в 50 мМ карбонатного буфера, 150 мМ NaCl, 0,01% BSA и 0,05% NaN3 (см. Таблицу материалов). Отрегулируйте pH до 10 и аликвоту в объемах 77 мкл при -30 °C.
  3. Откажитесь от реакционного буфера гиалуронидазы с помощью пипетки и погрузите орган в раствор фермента (500 мкл в конической трубке объемом 15 мл) в положении стоя, защищенном от света в течение 24 ч при 37 °C с легким встряхиванием (5 х г).
  4. Промыть образец в 15 мл гиалуронидазы промывочного буфера в конической трубке объемом 50 мл в горизонтальном положении, защищенном от света в течение 2 ч (три раза) при 37 °C с легким встряхиванием (5 х г).
    1. Для получения промывного буфера гиалуронидазы растворяют 50 мМ карбонатного буфера, 150 мМ NaCl, 0,1% (v/v) тритона X-100, 5% (v/v) метанола и 0,05% NaN3. Отрегулируйте pH до 10. Для получения 10-кратного карбонатного буфера-запаса NaCl растворите 2,96 г карбоната натрия, 1,86 г гидрокарбоната натрия и 8,77 г NaCl в 100 мл двухдистиллированной воды с 0,05% NaN3 (см. Таблицу материалов) и отрегулируйте рН до 10.

5. Иммуноокрашивание

  1. Маркируйте сосудистую систему с помощью антител против α-СМА (альфа-малый мышечный актин, см. Таблицу материалов), следуя приведенным ниже шагам.
    1. Генерация первичного плюс конъюгированного Fab фрагмента вторичного комплекса антител. Начните эту реакцию за 1,5 ч до процедуры окрашивания.
      1. Рассчитайте необходимое количество первичных и вторичных антител (смешайте в соотношении 1:0,5 по весу).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для первичного антитела анти-α-СМА необходимо 3,5 мкг для маркировки всего сердца или фрагмента скелетной мышцы аналогичных размеров. Для продукта 2,5 мг/мл необходимо 3,5/2,5 = 1,4 мкл раствора антител. Для вторичного антитела AlexaFluor 647 антимышечного fab фрагмента необходимо 1,75 мкг для маркировки всего сердца или фрагмента скелетной мышцы аналогичных размеров. Для продукта 1,7 мг/мл необходимо 1,75/1,7 = 1 мкл раствора антител.
      2. Смешайте первичные и вторичные антитела в янтарной пробирке 2 мл и инкубируйте в течение 1,5 ч при 37 °C.
    2. Для буферного обмена смешайте 7,5 мл 2x HV1 3D иммуноразрушающего буфера (входит в комплект, см. Таблицу материалов) с 7,5 мл двойной дистилированной воды и погружайте образец ткани на 1,5 ч при 32 °C с мягким встряхиванием (5 х г) в конической трубке объемом 15 мл в горизонтальном положении. Начинают эту реакцию одновременно с генерацией комплекса антител (за 1,5 ч до процедуры иммуноокрашивания).
  2. Выполните 3D-иммуноокрашивание, выполнив следующие действия.
    1. В конической пробирке объемом 15 мл приготовьте раствор для окрашивания антител после дополнительного файла 1.
    2. Соберите образец ткани из буферной обменной среды (этап 5.1.2) и погрузите его в раствор для окрашивания антител. Инкубировать ткани индивидуально в течение 1 недели при 32 °C с легким встряхиванием (5 х г) трубок в положении стоя, защищенном от света. Запечатайте трубку парафиновой пленкой, чтобы избежать испарения.
    3. Переместите до 4 °C и высиживайте ON в положении стоя.
    4. Охладите 1x HV1 3D иммуноокрашивающий промывочный буфер (входит в комплект, см. Таблицу материалов) до 4 °C и промывайте образец буфером 15 мл (два раза) в течение 30 мин каждый при 4 °C с мягким встряхиванием (5 x g). Держите конические трубки объемом 15 мл в горизонтальном положении до шага 5.2.7.
    5. Развести формалин до 1% в 1x HV1 3D иммуноразрушающий промывочный буфер и погрузить образец в 8 мл раствора на 24 ч при 4 °C с мягким встряхиванием (5 х г).
    6. Инкубировать в свежем 1% растворе формалина в течение 1 ч при 37 °С с легким встряхиванием (5 х г).
    7. Промыть в 15 мл PBS в течение 2 ч при 25 °C с легким встряхиванием (5 х г).
  3. Повышайте сигнал tdTomato с помощью антител к красному флуоресцентному белку (RFP), следуя приведенным ниже шагам.
    1. Соблюдайте те же сроки инкубации и температуры, что и на этапе 5.2.2. Рассчитайте количество первичных и вторичных антител (см. Таблицу материалов) и смешайте их в соотношении 1:0,5 по весу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для первичного антитела анти-RFP необходимо 5 мкг для маркировки всего сердца или фрагмента скелетной мышцы аналогичных размеров. Для продукта 1,25 мг/мл требуется 5/1,25 = 4 мкл раствора. Для вторичного антитела Alexa Fluor 647 anti-rabbit Fab fragment, 2,5 мкг необходимо для маркировки всего сердца или фрагмента скелетной мышцы аналогичных размеров. Для продукта 1,5 мг/мл необходимо 2,5/1,5 = 1,7 мкл раствора.
    2. Приготовьте раствор для окрашивания антител, как указано в дополнительном файле 1.
  4. Увеличьте сигналы GFP с помощью нанотел против GFP, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Соблюдайте те же сроки инкубации и температуры, что и в шаге 5.2.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нанотела анти-GFP (см. Таблицу материалов) конъюгированы с Alexa Fluor 647, поэтому генерация комплекса антител не нужна.
    2. Приготовьте раствор для окрашивания антител, как указано в дополнительном файле 1.

6. Сопоставление RI

  1. Погрузить прозрачные органы в 5 мл 50% разбавленного водой раствора CUBIC-R+ (см. Таблицу материалов) при РТ (ON) с легким встряхиванием (5 х г) в конической трубке объемом 50 мл. Держите трубы в положении стоя в течение всего шага согласования RI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Переработанные решения CUBIC R+ из предыдущих экспериментов могут быть повторно использованы (до четырех раз) на этом этапе. Для приготовления раствора CUBIC-R+ растворяют 45% 2,3-диметил-1-фенил-5-пиразолона (антипирина), 30% никотинамида или N-метилникотинамида и 0,5% N-бутилдиэтаноламина в двухдистиллированной воде или используют коммерческий буфер CUBIC-R+ (см. Таблицу материалов).
    ВНИМАНИЕ: CUBIC-R+ вызывает раздражение кожи, серьезное раздражение глаз и повреждение органов. Носите защитные перчатки и обеспечьте защиту глаз и лица. Не дышите пылью, парами, газом, туманом или парами. Утилизация на утвержденном заводе по утилизации отходов.
  2. Заменить 50% CUBIC-R+ на 5 мл 100% CUBIC-R+ и инкубировать с мягким встряхиванием (5 х г) на RT в течение 2 дней. Затем переложите ткани на стопку безворсовых салфеток и осторожно переверните ткани, чтобы удалить раствор CUBIC-R+ с поверхностей органов в течение 5 минут.

7. Монтаж

  1. После высыхания тканей перенесут их в 5 мл монтажного раствора (RI = 1,520) (см. Таблицу материалов) в шестилуночной пластине для культивирования клеток и инкубируют их (ON) в RT. Часто переворачивают ткани для устранения пузырьков воздуха, особенно на поверхностях органов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органы могут храниться более 6 месяцев в монтажном растворе или CUBIC-R+.
  2. Приклейте ткани к держателю образца микроскопа с помощью гелевого клея на основе цианоакрилата.
  3. Погрузите образцы в кварцевую кювету микроскопа, заполненную 120 мл монтажного раствора, и визуализируйте их поперечно к их продольной оси. Прилипайте к сердцу с вершиной, а аорта горизонтально выровнена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные и установленные органы могут быть разделены вибратомом и изображены с большим увеличением с помощью конфокальной микроскопии. Встраивают органы в 2% агарозу и разрезают участки по 100-500 мкм. Органы также могут быть вручную разделены острым лезвием для получения толстых тканевых срезов (>1000 мкм). После секционирования поместите срезы в стеклянные 35-миллиметровые чашки Петри, смонтируйте с помощью того же монтажного раствора, запечатайте лаком для ногтей и нанесите изображение с помощью конфокального микроскопа.

8. Получение изображений

  1. Изобразите смонтированные образцы с помощью светового микроскопа (см. Таблицу материалов). Установите увеличение и размер шага между отдельными срезами до 3 мкм, а также используйте правые и левые листовые лазеры толщиной 5 мкм и шириной 100%. Установите постоянную продолжительность экспозиции на уровне 50-100 мс, а мощность лазера от 10% до 80% в зависимости от интенсивности флуоресцентного сигнала.
    1. Для совместного обнаружения tdTomato-экспрессирующих паразитов и Окрашенных DiR спящих амастиготов (рисунок 2C) используют красный (Ex/Em 561/620-660 нм) и инфракрасный (Ex/Em 785/845-55 нм) каналы соответственно. Для совместного обнаружения Т-клеток и tdTomato-экспрессирующих паразитов в CD8-репортерной мыши (рисунок 2D) используют зеленый (Ex/Em 488/525-50 нм) и красный канал соответственно.
    2. Для анализа коинфекций (рисунок 2E), а также для совместного обнаружения паразитов, экспрессирующих GFP в ядрах репортерных мышей (рисунок 2F), используют зеленый и красный каналы соответственно. Для обнаружения tdTomato-экспрессирующих паразитов, ядерного красителя и сосудистой системы сердца (рисунок 3B,C) используют красный, зеленый и дальний красный (Ex/Em 640/680-730 нм) каналы соответственно.
    3. Обнаружение анти-RFP антител с дальне-красным каналом и анти-GFP нанотел с помощью зеленого канала (рисунок 3D).
  2. Конвертируйте полученные стеки изображений TIFF и 3D реконструируйте органы с помощью программного обеспечения Imaris v9.7.2 (см. Таблицу материалов).

9. Реконструкция и количественная оценка поверхности с помощью программного обеспечения Imaris

  1. Выберите инструмент алгоритма обнаружения поверхностей и запустите мастер в программном обеспечении для анализа изображений.
  2. Выполните первоначальный анализ в интересующей 3D-области (случайно выбранной), а затем примените его ко всей 3D-реконструкции органа. После выбора интересующей области (ROI) выберите канал для анализа, снимите флажок кнопки smooth и выберите вычитание фона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вычитание фона вычисляет уникальное локальное фоновое значение для каждого вокселя и вычитает его из исходного значения пикселя. Диаметр самой большой сферы, которая помещается в объект, должен составлять до 200 мкм для клеток, инфицированных T. cruzi, 10 мкм для Т-клеток и 5 мкм для отдельных паразитов.
  3. Используйте гистограмму для настройки классификации и раскрывающийся список фильтров для выбора измерений для классификации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте гистограмму для корректировки классификации: рекомендуется измерение эллиптичности (сплюснутости) и сферичности.
  4. Завершите работу мастера, нажмите кнопку статистики и получите общее количество инфицированных паразитами клеток или Т-клеток в виде количества отключенных компонентов на определенный момент времени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Фиксированные ткани CUBIC промывали PBS для удаления фиксаторов, а затем инкубировали с коктейлями CUBIC-L, основным буферным раствором аминоспиртов, которые извлекают пигменты и липиды из ткани, что приводит к обесцвечиванию ткани при сохранении тканевой архитектуры. Линии сетки на бумаге можно увидеть сквозь ткани, указывающие на соответствующее очищение органов (рисунок 2А). После делипидации ткани промывали и погружали в CUBIC-R+ и монтажный раствор для гомогенизации и в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Отсутствие обширной визуализации целых органов паразитов и иммунного ответа ограничивает понимание сложности взаимодействий хозяина и паразита и затрудняет оценку методов лечения болезни Шагаса. В настоящем исследовании был принят конвейер CUBIC для осветления и окрашивания неповрежденных органов и тканей мышей, инфицированных T. cruzi.

В этом исследовании были протестированы многочисленные протоколы очистки тканей (PACT32, ECi33, FLASH<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы благодарим доктора Эцуо Сусаки за ценную помощь и рекомендации относительно протоколов очистки тканей и иммуноокрашивания. Кроме того, мы благодарны М. Кандасами из CTEGD Biomedical Microscopy Core за техническую поддержку с использованием LSFM и конфокальной визуализации. Мы также благодарим всех членов Исследовательской группы Тарлтона за полезные предложения на протяжении всего этого исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1-метилимидазолMillipore Sigma616-47-7
2,3-диметил-1-фенил-5-пиразолон (AntipyrineTCID1876
6-луночные клеточные культуральные планшетыThermoFisher Scientific140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragmentImmuno Research Laboratories315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories111-607-003
анти-GFP нанотело Alexa Fluor 647Chromotekgb2AF647-50
анти-RFPRockland600-401-379
анти-α-SMASigmaA5228
B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J мышьЛабораторныйштамм Джексона #007914Общее название: Ai14, Ai14D или Ai14(RCL-tdT)-D
B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J мышьThe Jackson LaboratoryStrain #007914Общее название: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 ЙодидThermoFisher ScientificB3582
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma#A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J мышьThe Jackson LaboratoryStrain #032080Common Название: Cd8a-cre (E8III-cre)
CAPSOSigma#C2278
Салфетки чистящие Kimwipes  Kimberly-ClarkT8788
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопZeissLSM 790
CUBIC-HV 1 3D набор для иммуноокрашиванияTCIC3699
CUBIC-HV 1 3D набор для ядерного окрашиванияTCIC3698
CUBIC-LTCIT3740
CUBIC-PTCIT3782
CUBIC-R+TCIT3741
Гелевый суперклей на основе цианоакрилатаScotch571605
DiR (DiIC18(7); 1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндотрикарбоцианина йодид) Компания: BiotiumBiotium#60017
Этилендиамин тетрауксусная кислота (ЭДТА)Millipore Sigma60-00-4
Falcon Центрифуга пробирки 15 млCorning
Центрифужные пробирки Falcon 50  млCorningCLS430290
формалинаSigma-AldrichHT501128
гепаринаThermoFisher ScientificJ16920. BBR
ГиалуронидазаSigma#H3884 или #H4272
Imaris File Converter x64BitPlanev9.2.0
Программное обеспечение ImarisBitPlanev9.3
ImSpector программное обеспечениеLaVision BioTec, Miltenyi Biotecv6.7
Игла для внутривенного введения 23-G Sartori, Minisart Шприцевой фильтр16534
Безворсовые салфеткиKimwipes
Световой флуоресцентный микроскопMiltenyi BiotecULtramicroscope II Система
МетанолThermoFisher Scientific041838.K2
Наконечники для микропипеток, 10 & микро; L, 200 & микро; L и 1,000 & микро; LAxygenT-300, T-200-Y и T-1000-B
Моторизованный дозатор пипетокFisher Scientific, Fisherbrand03-692-172
Монтажное решениеTCIM3294
N-бутилдиэтаноламинTCIB0725
НикотинамидTCIN0078
N-метилникотинамидTCIM0374
Параформальдегид (PFA)Sigma-Aldrich158127
фосфатный буферный физиологический раствор (PBS)Thermo Fisher Scientific14190-094
RedDot 2 Дальний красный ядерный красительBiotium#40061
Sacrifice Perfusion SystemLeica10030-380
Ножницы Fine Science Tools91460-11
Серологические пипеткиCostar Sterile4488
Встряхивающий инкубаторTAITECBR-43FM MR
Азид натрия (NaN3)ThermoFisher Scientific447815000
Sodium Карбонат (Na2CO3)ThermoFisher ScientificL13098.36
Sodium Chloride (NaCl)ThermoFisher Scientific447302500
Гидрокарбонат натрия (NaHCO3)ThermoFisher Scientific014707.A9
SYTOX-G Окрашивание зеленых нуклеиновых кислотThermoFisherScientific S7020
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Jackson CLS430791визуализации

Ссылки

  1. Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
  2. Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
  3. Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
  4. Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
  5. Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
  6. Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77(2006).
  7. Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039(2018).
  8. Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
  9. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369(2021).
  10. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
  11. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807(2021).
  12. Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
  13. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355(2019).
  14. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
  15. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
  16. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).
  17. Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  18. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  19. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  20. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  21. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  22. Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
  23. Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
  24. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
  25. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  26. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  27. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
  28. Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982(2020).
  29. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  30. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  31. Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
  32. Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
  33. Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495(2020).
  34. Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
  35. Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
  36. Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3D
Количественная 3D-визуализация клеток, инфицированных Trypanosoma cruzi, спящих амастиготов и Т-клеток в интактных осветленных органах
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.