Количественная оценка динамики цитоскелетов с помощью дифференциальной динамической микроскопии

Summary

Дифференциальная динамическая микроскопия (ДДМ) сочетает в себе особенности динамического рассеяния света и микроскопии. Здесь представлен процесс использования DDM для характеристики восстановленных цитоскелетных сетей путем количественной оценки субдиффузной и клеточной динамики частиц в виментиновых сетях и баллистического движения активных миозин-управляемых актин-микротрубочек композитов.

Abstract

Клетки могут ползать, самовосстанавливаться и настраивать свою жесткость из-за их удивительно динамичного цитоскелета. Таким образом, восстановление сетей цитоскелетных биополимеров может привести к появлению множества активных и адаптируемых материалов. Однако разработка таких материалов с точно настроенными свойствами требует измерения того, как динамика зависит от состава сети и методов синтеза. Количественная оценка такой динамики оспаривается вариациями во времени, пространстве и пространстве формулирования составных сетей. Протокол здесь описывает, как метод анализа Фурье, дифференциальная динамическая микроскопия (DDM), может количественно оценить динамику биополимерных сетей и особенно хорошо подходит для исследований сетей цитоскелетов. DDM работает над временными последовательностями изображений, полученных с использованием ряда методов микроскопии, включая лазерное сканирование конфокальной, широкоугольной флуоресценции и ярко-полевой визуализации. Из таких последовательностей изображений можно извлечь характерные времена декорреляции флуктуаций плотности по диапазону волновых векторов. Также разработан удобный для пользователя пакет Python с открытым исходным кодом для выполнения DDM-анализа. С помощью этого пакета можно измерить динамику меченых компонентов цитоскелета или встроенных индикаторных частиц, как показано здесь с помощью данных сетей промежуточных нитей (виментина) и активных сетей актин-микротрубочек. Пользователи, не имеющие опыта программирования или обработки изображений, смогут выполнять DDM с помощью этого программного пакета и связанной с ним документации.

Introduction

Цитоскелет представляет собой сеть белковых нитей, которая охватывает цитоплазму эукариотических клеток, соединяя клеточную поверхность с ядром. Он обладает уникальными свойствами материала, обеспечивая механическую защиту от больших и повторяющихся механических нагрузок, а также приводя к динамическим изменениям формы ячейки¹. Восстановленные цитоскелетные сети могут привести к целому ряду интересных динамических поведений, от клетки встроенных частиц до баллистического движения, управляемого молекулярными двигателями 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Методы анализа динамики таких сетей включают отслеживание движения встроенных микросфер-индикаторов ^6,7,12,13,14, анализ изображений для отслеживания размера белково-плотных кластеров с течением времени⁸, динамическое рассеяние света¹⁵, велоциметрию изображения частиц ^{4,16,17,18,19} , вычисление мощности спектральной плотности изображений с течением времени¹⁹, и анализ кимографа²⁰. По мере того, как проводится больше исследований восстановленных сетей цитоскелетов, будь то понимание клеточной механики или активной материи, все более необходимы надежные, непредвзятые и воспроизводимые методы характеристики динамики. Дифференциальная динамическая микроскопия (DDM)^21,22, относительно новый метод, который использовался для изучения динамики цитоскелетов, является одним из таких методов, который эффективно количественно определяет динамику с несколькими пользовательскими параметрами. С помощью программного пакета, описанного здесь, исследователи с небольшим опытом в программировании или анализе изображений смогут использовать DDM для своей собственной работы.

DDM - это метод анализа изображений для извлечения динамики образца. Подобно отслеживанию частиц или велоциметрии изображений частиц, DDM требует временных рядов изображений (часто тысяч изображений), обычно записываемых с помощью микроскопа. В отличие от отслеживания частиц, отдельные объекты или трассирующие шарики не должны локализоваться (или даже быть локализуемыми) на изображении. В отличие от отслеживания частиц и велоциметрии изображений частиц, один восстанавливает динамику ансамбля с помощью DDM с относительно небольшим количеством заданных пользователем параметров. С помощью DDM изображения анализируются в пространстве Фурье для определения времени распада флуктуаций плотности в диапазоне волновых чисел, q, где q = 2πu, а u — величина пространственных частот, . Один получает информацию, похожую на рассеяние, но с реальными космическими изображениями, полученными на^{микроскопе} 21,22,23. Таким образом, можно воспользоваться преимуществами различных контрастообразующих методов микроскопии, таких как широкоугольная флуоресценция^22,24, конфокальная флуоресценция²⁵,^{поляризованная 26}, темное поле²⁷ или флуоресценция светлого листа²⁸ микроскопий. Кроме того, изображения, используемые для DDM-анализа, могут использоваться для отслеживания частиц или велоциметрии изображений частиц для предоставления дополнительной информации.

Это сочетание функций динамического рассеяния света и оптической микроскопии делает DDM мощным и универсальным методом. С момента своего первого описания Cerbino и Trappe в 2008^{году 21}, где было продемонстрировано, что DDM измеряет диффузию коллоидных частиц 73 нм, DDM использовался для измерения протекающих коллоидов²⁹, коллоидной агрегации^30,31, вязкоупругости нематических жидких кристаллов²⁶, динамики коллоидных гелей³², огрубеющих пен³³, наночастиц в замкнутых средах^34, 35,36,37, бактериальная ^{подвижность} 38,39,40,41, диффузия слабо рассеянных белковых кластеров⁴², капиллярные волны на границах раздела^{жидкости 43} и другие системы. Те, кто ищет более полный список публикаций, использующих DDM, могут обратиться к тщательным обзорным документам по этому вопросу ^22,23,44,45.

DDM также использовался для исследования динамики биологических сетей. Drechsler et al. использовали DDM для измерения динамики актина в живых ооцитах дрозофилы ⁴⁶. Burla et al. количественно оценили динамику индикаторных частиц в сетях гиалуроновой кислоты и гиалуронан-коллагеновых композитов⁴⁷. Несколько применений DDM для изучения динамики индикаторных частиц в восстановленных цитоскелетных сетях ^9,10, транспорта молекул ДНК в таких сетях^48,49 и динамики активных восстановленных сетей также были задокументированы 11,50,51. ПреимуществоМ DDM при измерении динамики в таких системах является то, что отдельные частицы или молекулы не нужно локализовать и отслеживать. Так, например, динамика молекул ДНК в переполненных средах может быть измерена с помощью DDM, несмотря на сложность отслеживания таких маленьких и несферических молекул. Кроме того, с помощью флуоресцентной микроскопии можно использовать многоцветную маркировку для выборочного измерения динамики отдельных компонентов в сложном композите.

Для выполнения DDM со временем создается последовательность изображений I(x,y,t). Для заданного времени задержки, Δt, находят все (или подмножество) пар изображений, разделенных этим временем задержки. Квадратное преобразование Фурье разности каждой пары,

вычисляется и усредняется вместе. Эта величина, , радиально усредняется, при условии, что динамика изотропна. Это дает матрицу DDM (также называемую функцией структуры изображения), . Этот процесс показан графически на рисунке 1. Чтобы определить динамику образца по этой DDM-матрице, предполагается, что DDM-матрица принимает вид

где A — амплитуда, которая зависит от деталей микроскопа и структуры образца, B — фон, который зависит от шума на изображениях, а f (q, Δt) — промежуточная функция рассеяния (ISF), содержащая информацию о динамике^21,22. В простых случаях

где τ — характерное время распада или декорирования. Такой ISF был использован в нескольких исследованиях, использующих DDM на эргодических системах, таких как разбавленные коллоидные суспензии 21,24,27,37,40,52. Однако другие формы ISF могут быть использованы для моделирования различных типов динамики. Например, можно использовать кумулятивное расширение для моделирования ISF для полидисперсных образцов как

где μ — мера полидисперсности^42,53; Если флуктуации плотности распадаются на два отдельных режима, можно использовать ISF, подобный

^{26, 54, 55, 56, 57};

другие ISF могут быть использованы для плавания микроорганизмов или других активных частиц 38,39,40,41,58,59.

Рисунок 1: Обзор DDM-анализа. Из временных рядов изображений вычисляется преобразование Фурье разности изображений для вычисления матрицы DDM. Матрица DDM может быть адаптирована к модели для определения временной шкалы флуктуаций плотности в диапазоне значений q . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Здесь описано использование программного пакета DDM-анализа, разработанного на Python, PyDDM. Этот программный пакет основан на работе, проделанной нашими исследовательскими лабораториями и другими опубликованными исследованиями за последние несколько лет. Основными мотиваторами для создания этого программного пакета являются необходимость (1) отслеживания и хранения метаданных и параметров, используемых в анализе; (2) тщательная документация с подробными примерами анализа от начала до конца; и 3) простой способ использования различных (или создания новых) математических моделей для подгонки данных (например, добавление моделей ISF, таких как модели, недавно разработанные для активных нитей⁶⁰, было бы простым). Существуют и другие программные пакеты для DDM-анализа, хотя не все они хорошо документированы и написаны на языке программирования с открытым исходным кодом. Например, есть код C++ с вычислениями на GPU (https://github.com/peterlu/ConDDM)²⁵, код C++, использующий преобразования Фурье во времени для ускорения вычислений (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)⁶¹, версии MATLAB и Python (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)⁴⁰, код MATLAB (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)²⁷ и код MATLAB с количественной оценкой неопределенности ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)⁶². Поскольку этот пакет PyDDM хорошо документирован и обеспечивает большую гибкость в том, как рассчитывается и анализируется матрица DDM, он, как мы надеемся, может быть полезен для исследователей, желающих реализовать DDM, независимо от их опыта в программировании или анализе изображений.

Протокол показывает, как этот программный пакет может быть использован для количественной оценки динамики восстановленных цитоскелетных сетей in vitro . Это делается с использованием двух различных наборов данных визуализации: (1) изображений субмикронных индикаторных частиц, встроенных в виментиновую сеть, сделанных с помощью микроскопии яркого поля, и (2) изображений флуоресцентно меченых нитей актина и микротрубочек в запутанной композитной сети с активностью, управляемой миозином, взятой с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Анализ этих двух наборов данных подчеркивает заметные сильные стороны DDM, в том числе его способность анализировать изображения, сделанные с помощью различных методов визуализации (например, яркой или конфокальной флуоресценции), извлекать динамику либо из встроенных индикаторов, либо из меченых нитей и количественно оценивать различные динамики (например, субдиффузивную и ограниченную или баллистическую).

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Файл Jupyter Notebook, содержащий код для каждого шага в следующем протоколе, можно найти в следующем репозитории GitHub, https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples. PDF-файл этого файла включен в Дополнительный файл 1. Кроме того, пошаговое руководство по коду и документации по каждой функции и классу можно найти на веб-сайте, https://rmcgorty.github.io/PyDDM/.

1. Установка программного обеспечения

1. Чтобы следовать примеру файлов анализа DDM, установите Jupyter Notebook для выполнения кода. Установите другие необходимые общие пакеты Python, включая NumPy и Matplotlib. Все эти пакеты поставляются в комплекте с дистрибутивом Anaconda (см. https://www.anaconda.com/products/individual).
2. Установите пакет Python xarray⁶³. Этот пакет необходим для организации и хранения метаданных и параметров анализа. При использовании дистрибутива Anaconda установите xarray (вместе с его рекомендуемыми зависимостями) с помощью команды:
   conda install -c conda-forge xarray dask netCDF4 bottleneck
3. Установите пакет PyYAML с помощью команды:
   conda install -c anaconda yaml
   Этот пакет необходим для чтения метаданных об изображениях для анализа и параметрах, заданных пользователем для анализа и подгонки.
4. Установите пакет PyDDM, скачав его из репозитория GitHub или с помощью команды git:
   https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git клонов git

2. Планирование сеансов визуализации

1. Выберите оптимальный доступный способ визуализации и оптические настройки. Как уже упоминалось, DDM может быть использован с рядом методов микроскопии.
2. Чтобы помочь в планировании соответствующего объектива и размера изображения для использования, определите диапазон волновых чисел, q, которые будут зондироваться на основе размера пикселя и общего размера изображения. Подтвердите, что выбор увеличения и поля зрения оптимальны для эксперимента, исходя из этих расчетов. Для изображений, проанализированных здесь, для активной композитной сети актин-микротрубочек были использованы объектив 60x 1,4 NA и размер изображения 256 x 256 пикселей с размером пикселя 0,83 мкм. Для изображений бусин, встроенных в виментиновую сеть, использовался объектив 100x 1.4 NA и размер изображения 512 x 512 пикселей с размером пикселя 0,13 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальный q задается 2π/NΔx, где размер изображения (предположительно квадратный) равен N × N пикселей с размером пикселя Δx. Максимальное q — это минимум π/Δx и 2π NA/λ, где NA — числовая апертура объектива изображения, а λ — длина волны света (для визуализации яркого поля можно заменить NA на_{(объектив NA} +_{конденсатор} NA)/2).
3. Затем рассмотрим диапазон временных рамок для исследования. Как правило, DDM-анализ выполняется на последовательностях не менее 1000 кадров.
   1. Чтобы определить подходящую частоту кадров, рассмотрите ожидаемое время, необходимое объектам в выборке для перемещения на расстояние в порядке минимальной разрешаемой шкалы длин (соответствующей максимальному q).
   2. Рассматривая верхний предел диапазона исследуемых временных шкал, признайте, что, как правило, спектр мощности сотен различий изображения заданного времени задержки Δt усредняется вместе, чтобы обеспечить достаточную статистику для снижения шума. Следовательно, получайте последовательности изображений длиннее, чем максимальная исследуемая временная шкала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если известен ожидаемый коэффициент диффузии , D, или скорость, v, то можно оценить ожидаемое время распада характеристики, используя τ = 1/Dq² или τ = 1/vq вместе с диапазоном q, который был определен на основе поля зрения и размера пикселя. Диапазон ожидаемых значений τ в доступном диапазоне q может помочь в выборе частоты кадров и количества кадров для получения.

3. Пробоподготовка и получение изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о параметрах подготовки образцов и визуализации, используемых для данных, представленных в разделе репрезентативных результатов, см. предыдущие публикации авторов ^11,51,64 и Дополнительный файл 2.

1. Основываясь на рассмотрении шкал времени и длины для зондирования, получите последовательности изображений, в идеале, более 1000 кадров.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Код будет анализировать квадратные изображения или квадратные области, представляющие интерес в изображении, поэтому отрегулируйте размер кадра соответствующим образом.
2. Сохраняйте последовательности изображений в виде трехмерного стека TIFF в оттенках серого. Кроме того, формат, используемый системами Nikon Instruments, формат ND2, может быть прочитан установленным пакетом. Если изображения сохранены в каком-либо другом формате, используйте ImageJ или другую программу обработки изображений для преобразования изображений в стек TIFF.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании файлов ND2 необходимо установить пакет nd2reader из https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader.

4. Настройка параметров

1. Создайте копию файла параметров example_parameter_file.yml, предоставленного в репозитории кода PyDDM в папке примеров. Откройте этот YAML-файл с помощью текстового редактора, такого как NotePad++, или текстового редактора в JupyterLab. См. Дополнительный файл 2 для примера файла параметров YAML, используемого при анализе данных, представленных в разделе репрезентативных результатов.
2. В скопированном файле YAML укажите каталог данных и имя файла, соответствующие анализируемой последовательности изображений. В разделе метаданных укажите размер пикселя и частоту кадров.
3. В разделе Analysis_parameters приведены подробные сведения о том, как следует рассчитывать матрицу DDM. Некоторые параметры здесь являются необязательными.
   1. Как минимум, укажите значения параметров, number_lag_times и last_lag_time. Они соответствуют количеству различных времен задержки, для которых вычисляется матрица DDM, и наибольшему времени задержки (в кадрах) для использования, соответственно. Для данных трассирующих шариков в виментиновых сетях, используемых здесь, параметры number_lag_times и last_lag_time составили 60 и 1000 соответственно. Код вычисляет матрицу DDM для времени задержки от 1 кадра (или какого-либо другого минимального времени задержки, если указан необязательный параметр first_lag_time) до last_lag_time с логарифмическим интервалом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если бы были получены M-кадры, можно было бы рассчитать матрицу DDM для времени задержки до M-1. Однако при плохой статистике при таком большом времени задержки данные, вероятно, будут шумными. Самое длительное время задержки для вычисления матрицы DDM будет зависеть от деталей данных, но мы предлагаем попробовать около одной трети общей продолжительности серии изображений.
4. Предоставьте подробную информацию о том, как матрица DDM или функция промежуточного рассеяния (ISF) должны быть помещены в раздел Fitting_parameters. Присвойте имя модели под параметром model. Укажите начальное угадывание, нижнюю и верхнюю границу для каждого из параметров подгонки в выбранной модели.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы отобразить список возможных моделей подгонки, запустите функцию print_fitting_models. Модели также можно найти в онлайн-документации на веб-сайте PyDDM.

5. Вычисление матрицы DDM

1. Инициализируйте экземпляр класса DDM_Analysis. Для этого предоставьте метаданные и параметры анализа, рассмотренные выше, передав имя файла с включенным полным путем к файлу YAML DDM_Analysis. Кроме того, можно передать метаданные и параметры в виде структуры данных словаря Python.
2. Запустите calculate_DDM_matrix функции для вычисления матрицы DDM. Этот расчет может занять несколько минут или дольше в зависимости от размера кадра и количества задержек. Типичное время выполнения показано на рисунке 2 .
3. Проверьте возвращенные данные, которые будут находиться в структуре данных из пакета xarray, известного как Dataset. Эта структура данных хранится под атрибутом ddm_dataset.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой структуре данных будет храниться не только матрица DDM, но и связанные с ней переменные и метаданные. Он также будет сохранен на диск в формате NetCDF.
4. Осмотрите графики и фигуры, которые будут сгенерированы и отображены. Эти рисунки также сохраняются в виде PDF-файла в каталоге данных.
   1. Посмотрите, что один из сгенерированных графиков показывает ансамбль-усредненный квадратный модуль преобразованных Фурье изображений, как функцию q. По умолчанию код использует этот параметр для оценки фонового параметра B. Оцените фон , предположив, что в пределе большого q он приблизится к B/2, где B является фоном.
   2. Если не достигает плато на большом q, то используйте другой метод оценки B. Для этого задайте параметр background_method в файле YAML или в качестве необязательного аргумента ключевого слова для функции calculate_DDM_matrix. Более подробная информация о методах оценки B представлена в разделе репрезентативных результатов.

Рисунок 2: Время вычисления для вычисления матрицы DDM. В (A) и (B) показано время вычисления матрицы DDM, , . Данные, используемые во всех случаях, представляют собой фильм из 5000 кадров с размером изображения 512 х 512 пикселей. Матрица DDM была рассчитана на 30 лагов, логарифмически расположенных между 1 кадром (0,01 с) и 1000 кадрами (10 с). Код выполнялся на настольном компьютере Intel i7-10700 с тактовой частотой 2,90 ГГц и 32 ГБ оперативной памяти. В (A) показан эффект изменения того, сколько различий изображений используется при вычислении матрицы DDM для каждого времени задержки. Для этого изображения объединяются в корзину, чтобы получить размер изображения 256 x 256. Для каждого времени задержки Δt изображения, разделенные этим Δt , вычитаются, и результирующая матрица преобразуется Фурье. Для данного Δt могут быть использованы все пары изображений, разделенные этим Δt (показаны синим цветом), могут быть использованы только неперекрывающиеся пары изображений (например, кадры 1 и 10, 10 и 19 и т. Д.; показаны коричневым цветом), или для каждого Δt может быть использовано 300 пар изображений или меньше. В (B) показано влияние изменения размера изображения на время вычисления. Изображения были объединены либо путем группировки 2 x 2, 4 x 4 или 8 x 8 пикселей, в результате чего размеры изображений составляли 256 x 256, 128 x 128 или 64 x 64 соответственно. Для каждого из них при вычислении матрицы DDM для каждого Δt используется около 300 пар изображений. (C) Из матрицы DDM можно извлечь промежуточную функцию рассеяния (ISF). Это показано для трех случаев в пункте (А). Синие точки данных (без смещения) соответствуют ISF, когда для каждого Δt используется максимальное количество пар изображений; коричневые точки данных (со смещением 0,1) соответствуют ISF, когда для каждого Δt используются неперекрывающиеся пары изображений; а розовые точки данных (со смещением 0,2) соответствуют ISF, когда для каждого Δt используется не более 300 пар изображений. ISF, обнаруженный с использованием неперекрывающихся пар изображений, показывает шумность при длинном Δt. В этом случае используется несколько пар изображений при длинном Δt (например, для Δt 1000 кадров используется только 4 пары изображений). (D) Путем подгонки ISF к экспоненциальной функции определяется характеристическое время распада, τ, для каждого волнового числа, q. В розовом цвете результаты отображаются после объединения исходных изображений на 2 x 2, в результате чего размер изображения составляет 256 x 256. Серым цветом результаты отображаются после биннинга на 8 x 8, в результате чего размер изображения составляет 64 x 64. При объединении данных информация о динамике при более высоких волновых числах теряется, но расчет матрицы DDM для изображений 64 x 64 примерно в 16 раз быстрее, чем для изображений 256 x 256. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

6. Установка матрицы DDM или ISF

1. Инициализируйте экземпляр класса DDM_Fit. Для этого передайте DDM_Fit имя файла YAML, содержащего метаданные изображения и параметры для подгонки.
2. Решите, какую модель для матрицы DDM или ISF использовать для подгонки данных. Перечислите доступные модели, выполнив функцию print_fitting_models. Укажите модель, которая будет использоваться в файле параметров YAML или с помощью функции reload_fit_model_by_name.
3. Задайте начальные догадки и границы для каждого параметра в выбранной модели в предоставленном файле параметров YAML. Чтобы изменить начальное предположение для любого параметра, используйте функцию set_parameter_initial_guess. Установите границы для параметров с помощью функции set_parameter_bounds. Например, как видно из дополнительного файла 2, для данных о трассирующих шариках в сети виментина первоначальное предположение для времени распада составляло 1 с, а границы этого параметра составляли 0,01 с и 2000 с.
4. Выполните подгонку с помощью функции fit. Назначьте переменную выходным данным этой функции, чтобы легко получить доступ к результатам.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта функция может принимать множество необязательных аргументов. В документации по коду и приведенных примерах приведен список таких аргументов, а также сведения о том, когда следует установить для них значения, отличные от значений по умолчанию.

7. Интерпретация результатов подгонки

1. Генерация графиков для проверки припадков и q-зависимости параметров соответствия с функцией fit_report.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта функция сгенерирует серию графиков, которые также будут сохранены в формате PDF. Необязательные аргументы этой функции можно использовать для изменения создаваемых графиков.
2. Среди сгенерированных графиков будет рисунок с 2 х 2 подсюжетами, показывающими матрицу DDM или ISF (в зависимости от выбранной модели подгонки) при четырех значениях q (указанных в качестве необязательного аргумента для fit_report), а также рассчитанную матрицу DDM или ISF с использованием модели и параметров наилучшего соответствия. Чтобы построить DDM-матрицу или ISF вместе с наиболее подходящим интерактивным способом, используйте класс Browse_DDM_Fits как показано в приведенных примерах при использовании среды Jupyter Notebook.
3. Из графика характеристического времени распада τ по отношению к волновому числу q определите, следует ли динамика диффузионному, субдиффузионному, баллистическому или какому-либо другому типу движения. Это можно сделать, выполнив поиск соотношения степенного закона между τ и q.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На логарифмическом графике τ vs. q , сгенерированном функцией fit_report, будут показаны три линии, соответствующие степенному закону, укладывающемуся в заданный диапазон значений q . Сплошная черная линия соответствует соответствию τ против q степенному закону, τ = 1 / Kq^β, где K и β являются свободными параметрами. Пунктирная линия оранжевым цветом соответствует подгонке к простой диффузии, τ = 1 / Dq², где D — коэффициент диффузии. Пунктирная линия синим цветом соответствует подгонке к τ = 1 / vq, где v — скорость.

8. Сохранение результатов

1. Результаты подгонки будут сохранены в наборе данных xarray. Используйте функцию xarray to_netcdf или встроенный модуль python pickle для сохранения этой структуры данных на диск. Используйте функцию xarray open_dataset для загрузки этих файлов netCDF.
2. Используйте функцию save_fit_results_to_excel для сохранения результатов подгонки вместе с данными в файл листа.

Results

Здесь мы покажем примеры анализа, проведенного с помощью PyDDM из двух разных наборов экспериментов. В одной серии экспериментов субмикронные трассирующие шарики были встроены в сети, состоящие из промежуточного белка нити виментина, и визуализированы с использованием объектива 100x в режиме яркого поля со скоростью 100 кадров / с (рисунок 3A). Виментин экспрессируется в мезенхимальных клетках и является ключевым фактором, определяющим механические свойства цитоплазмы⁶⁵ и механическую стабильность ядра в клетках, выполняющих замкнутую миграцию ^66,67. До сих пор восстановленные виментиновые сети изучались в основном макроскопической реологией 64,68,69, тогда как динамике уделялось сравнительно мало внимания 13,70,71. Дополнительные сведения об этих экспериментах можно найти в Дополнительном файле 2. В другой серии экспериментов активные сети цитоскелетов были получены с актином, микротрубочками и миозином. Спектрально различимые флуоресцентные метки позволяли визуализировать нити актина и микротрубочек с помощью двухцветного лазерно-сканирующего конфокального микроскопа с использованием объектива 60x со скоростью 2,78 кадра/ с (рисунок 3B, C). Актиновые и микротрубочки являются важными факторами динамических изменений формы клеток, причем их действия координируются механическими и биохимическими взаимодействиями⁷². Дополнительные подробности этих экспериментов можно найти в¹¹. Отдельные кадры из последовательностей изображений, сделанных в этих экспериментах, показаны на рисунке 3.

Рисунок 3: Проанализированные изображения из временных рядов. (A) Изображение Брайтфилда бусин размером 0,6 мкм в виментиновой сети. (В,С) Изображение микротрубочек (B) и актина (C) в активном композите актин-микротрубочка, сделанное с помощью 60-кратного объектива на лазерно-сканирующем конфокальном микроскопе, с использованием света возбуждения 561 нм для визуализации микротрубочек и 488 нм света возбуждения для визуализации актина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Для изображений трассирующих бусин в виментиновых сетях записывались фильмы по 5000 кадров размером 512 х 512 пикселей при 100 кадрах/с. Из них матрица DDM была вычислена с 60 логарифмически интервальными временами задержки между 1 и 1000 кадрами, или 0,01 с и 10 с. Для оценки фона было вычислено B, среднее значение преобразованных в квадрате изображений Фурье, ^{равное 55,73}. Было сделано предположение, что при наибольших 10% q-значений эта величина равна B/2 и что B не зависит от q. Это метод пакета по умолчанию для оценки B, но другие методы возможны, установив для параметра background_method другое значение.

С параметрами A(q) и B , определенными из , можно извлечь промежуточную функцию рассеяния (ISF) из матрицы DDM. Примеры ISF показаны на рисунке 4. На фиг.4А показан ISF из изображений шариков диаметром 0,6 мкм, встроенных в сеть с концентрацией виментина 19 мкм. На фиг.4В показан ISF для однотипных шариков в сети с концентрацией виментина 34 мкМ. Интересно, что ни в том, ни в другом случае ISF не снизились до нуля. При больших задержках ISF должен приближаться к нулю для эргодических систем. То есть в таких системах флуктуации плотности должны полностью относиться к большим временам задержки. Тот факт, что ISF здесь не распался до нуля, мог быть результатом неточных оценок A(q) и B, которые были использованы для поиска ISF из вычисляемой матрицы DDM. Примечательно, что метод, используемый здесь, может переоценить B в некоторых сценариях⁶². Тем не менее, более вероятно, что динамика шариков индикатора действительно неэргодична, поскольку бусины имеют сопоставимый размер с размером сетевой сетки и, следовательно, могут стать клетками. Другие данные подтверждают вывод о неэргодичности. А именно, размер шарика, составляющий 0,6 мкм, был больше расчетного среднего значения для размеров ячеек 0,4 мкм для концентрации 19 мкМ и 0,3 мкм для концентрации 34 мкМ. Кроме того, результаты отслеживания одиночных частиц этих трассирующих шариков, которые показаны позже, также показали ограниченное движение.

Рисунок 4: Промежуточные функции рассеяния при нескольких волновых числах для виментиновых сетей. ISF строится как функция времени задержки для значений q примерно от 1 до 9 ^мкм-1. (A) ISF из изображений шариков 0,6 мкм в виментиновой сети с концентрацией виментина 19 мкм. (B) ISF из изображений шариков 0,6 мкм в виментиновой сети с концентрацией виментина 34 мкм. Длительное временное плато задержки ISF при значении значительно выше нуля указывает на неэргодичность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Учитывая, что динамика, вероятно, неэргодична, ISF соответствуют форме , где C — коэффициент неэргодичности ³². Эта форма ISF использовалась в предыдущих исследованиях неэргодической динамики, таких как коллоидные гели^32,74 или индикаторные частицы в актин-микротрубочных сетях ¹⁰. Пунктирные черные линии на рисунке 4 показывают совпадения вместе с данными. Из этих припадков теперь можно посмотреть на q-зависимость времени распада, τ, и параметра неэргодичности, C.

Рисунок 5: Время распада в сравнении с волновым числом для виментиновых сетей. От припадков к ISF время распада τ определяется для диапазона значений q . Для ясности мы показываем не значение τ для каждого q, а просто логарифмически распределенное множество. Синим (коричневым) являются данные из изображений шариков размером 0,6 мкм в сетях виментина с концентрацией виментина 19 мкМ (34 мкМ). Полосы ошибок представляют стандартные отклонения в τ для нескольких фильмов (четыре фильма для данных с сетью 19 мкМ [синий] и пять фильмов для данных с сетью 34 мкМ [tan]). Красные пунктирные линии обозначают предполагаемые границы нашего временного и пространственного разрешения, как описано в результатах. Сплошная черная линия показывает масштабирование, которое указывает на диффузное движение. Ни один из наборов данных не следует этому масштабированию. Скорее, бусины в сети 19 мкМ показывают субдиффузивное движение (с β > 2), а бусины в сети 34 мкМ показывают ограниченное или заключенное в клетку движение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Время распада показало большую неопределенность, как на низком q , так и на высоком q экстремумах, как показано на рисунке 5. Полосы ошибок на этом графике показывают стандартное отклонение среди четырех видео, проанализированных для случая более низкой концентрации виментина, или пяти видео, проанализированных для более высокой концентрации. Чтобы понять источник большой неопределенности на этих крайностях, рассмотрите как временное, так и пространственное разрешение. Приблизительные пределы разрешения показаны тремя красными пунктирными линиями. Две горизонтальные линии соответствуют минимальному и максимальному времени задержки. Учитывая частоту кадров 100 кадров/с и максимальное время задержки, соответствующее 1000 кадрам (20% от общей продолжительности видео), точность была потеряна при измерении динамики, происходящей быстрее 0,01 с или медленнее 10 с. При более низких значениях q установленные значения для τ были больше 10 с. Поэтому следует ожидать больших неопределенностей во время распада, которое превышает максимальное время задержки. В верхней части q-диапазона время распада приблизилось к минимальному времени задержки 0,01 с, но оставалось выше него. Вместо того, чтобы быть ограниченным временным разрешением, при этих более высоких значениях q , пространственное разрешение может быть ограничивающим фактором. Учитывая размер пикселя 0,13 мкм, наибольшее значение для q составляло около 24 ^мкм-1. Однако дифракционное ограниченное разрешение не обязательно позволяет точно измерять динамику на этих высоких пространственных частотах. Аппроксимация оптического разрешения приводит к верхнему пределу волнового числа около 16 ^мкм-1, учитывая числовую диафрагму объектива, NA, 1,4 и длину волны света. Это обозначено вертикальной красной пунктирной линией на рисунке 5. Действительно, данные были шумными при больших значениях q. Еще до этого приблизительного верхнего предела q наблюдалась повышенная неопределенность в τ, и это могло быть связано с переоценкой q_max. Более низкое оптическое разрешение, чем прогнозировалось, может быть связано с тем, что масляная иммерсионная линза использовалась для изображения за пределами крышки в водный образец или потому, что конденсаторная линза была неидеально выровнена.

Для шариков размером 0,6 мкм, встроенных в менее концентрированную сеть (виментин 19 мкМ), можно наблюдать на логарифмическом графике времени распада против волнового числа, что время распада уменьшалось с волновым числом таким образом, чтобы это соответствовало степенному закону (рисунок 5). Однако он, по-видимому, не следует тому, что можно было бы ожидать для нормального диффузного движения, где . Скорее, τ уменьшался более круто с увеличением q. Это свидетельствует о субдиффузивном движении, которое часто происходит для бусин в переполненных средах, таких как эти. Подгонка τ(q) в диапазоне от 1,4 ^мкм-1 до 12,3 ^мкм-1 к степенному закону вида τ = 1/Kq^β дает параметры переноса K = 0,0953 мкм^β /с и β = 2,2. Для тех, кто более привык думать о нормальной диффузии и субдиффузии в терминах среднего квадратного смещения (MSD) частиц индикатора как функции времени задержки (т. Е. MSD = K' Δt^α), полезно признать, что субдиффузивная экспонента масштабирования в уравнении MSD, α, эквивалентна α = 2 / β. Другими словами, значение β = 2,2 согласуется с субдиффузной экспонентой масштабирования в уравнении MSD α = 0,9. Можно было бы установить PyDDM так, чтобы он соответствовал τ(q) в этом диапазоне q-значений, указав индексы массива q либо с параметром, Good_q_range в файле YAML, либо передав необязательный аргумент forced_qs функции generate_fit_report. Диапазон q от 1,4 ^мкм-1 до 12,3 ^мкм-1 для приведенных здесь данных будет соответствовать индексам массива q от 15 до 130.

Для шариков размером 0,6 мкм в более концентрированной сети (34 мкМ) время распада показало небольшую зависимость от q. Вероятно, это связано с неэргодичностью бусин в сети с меньшим размером ячеек. Чтобы исследовать неэргодичность в этой системе, параметр nonergodicity, C, должен быть построен как функция q, как показано на рисунке 6. Для шариков 0,6 мкм в виментиновой сети 19 мкМ C ≈ 0,2 с небольшой зависимостью от q (не показано). Однако для сети с 34 мкМ виментина и для сети с еще более высокой концентрацией виментина 49 мкМ логарифм C был пропорционален q2, как показано на фиг.6. Эта связь между C и q ожидается для ограниченного движения. Для бусин, захваченных в карманах сети, MSD, как ожидается, будет плато в достаточно длительное время задержки (т. Е. , Где - MSD и δ² - максимальный MSD). Поскольку ISF может быть выражен в терминах MSD как , и поскольку неэргодический ISF переходит в C с длительным временем задержки (т.е. ), соотношение получается^32,75. Поэтому можно использовать C(q) для поиска δ², и это дало δ² = 0,017 мкм2 и 0,0032 ^мкм2 для 34 и 49 мкМ виментиновых сетей соответственно (что соответствует δ = 0,13 мкм и 0,057 мкм).

Рисунок 6: Параметр неэргодичности в сравнении с волновым числом для виментиновых сетей. От соответствия к ISF параметр неэргодичности C определяется для диапазона значений q. В загаре (красный) приведены данные из изображений шариков 0,6 мкм в виментиновых сетях с концентрацией виментина 34 мкМ (49 мкМ). Полосы ошибок представляют собой стандартные отклонения в τ для нескольких фильмов (пять фильмов для данных с сетью 34 мкМ [tan] и четыре фильма для данных с сетью 49 мкМ [красный]). Ось Y имеет логарифмическое масштабирование. Далее следует q-зависимость от C, которая позволяет извлечь максимальное среднее квадратическое смещение, δ². Подходит к показанным сплошным линиям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Можно использовать другие методы для извлечения размера удержания δ из данных, а также субдиффузной экспоненты, найденной при исследовании τ(q) для шариков в сети виментина 19 мкМ. Во-первых, можно использовать метод, описанный Bayles et ^al.76 и Edera et ^al.77 для извлечения MSD из матрицы DDM. Примечательно, что этот метод не требует подгонки матрицы DDM. Нужно только вычислить матрицу DDM, D(q, Δt) и (из которой можно определить A(q) и B ). Затем, чтобы найти MSD, используется связь . Обратите внимание, что этот метод поиска MSD предполагает, что распределение перемещений частиц является гауссовским, хотя предыдущая работа показала, что в некоторых случаях MSD, полученные из DDM, согласуются с MSD из отслеживания частиц, даже если смещения не являются гауссовскими⁷³. Для этой системы, как и ожидалось⁷⁸, в распределении больших перемещений существует негауссовская негауссианность, как показано на рисунке S1. В пакете PyDDM должна быть выполнена функция extract_MSD, которая возвращает . Во-вторых, можно использовать отслеживание отдельных частиц, чтобы найти MSD. Хотя DDM можно использовать для анализа изображений, где либо высокая плотность частиц, либо ограниченное оптическое разрешение запрещают точную локализацию частиц, для изображений бусин 0,6 мкм в виментиновых сетях мы смогли локализовать и отслеживать бусины с помощью программного обеспечения trackpy (https://github.com/soft-matter/trackpy)⁷⁹. Этот программный пакет для отслеживания частиц использует алгоритмы, описанные Крокером и Гриером⁸⁰.

Рисунок 7: Среднее квадратичное смещение по сравнению со временем задержки для виментиновых сетей. MSD был определен с использованием двух методов. Во-первых, MSD был вычислен из матрицы DDM (показанной с твердыми символами). Затем MSD был определен с использованием отслеживания одной частицы (SPT) для поиска траекторий частиц (открытые символы). Полосы ошибок определяются таким же образом, как описано в предыдущих двух условных обозначениях. (A) MSD для шариков 0,6 мкм в виментиновой сети 19 мкМ указывают на субдиффузивное движение, с хорошим согласием между двумя методами нахождения MSD. (B) MSD для шариков 0,6 мкм в виментиновой сети 49 мкМ указывают на движение в клетке, с хорошим согласованием между двумя методами нахождения MSD и с максимальным MSD, найденным по параметру неэргодичности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

MsD и время задержки для шариков 0,6 мкм в сети виментиновой сети 19 мкМ и в виментиновой сети 49 мкМ показаны на рисунке 7. В обоих случаях MSD, полученный из DDM, хорошо согласуется с MSD, обнаруженным с помощью отслеживания одной частицы (SPT). Кроме того, для менее концентрированной сети субдиффузивная экспонента масштабирования (α в ) составляла около 0,9. Это согласуется с τ(q) масштабированием найденного путем подгонки ISF для определения τ(q) (то есть 2/2.2 = 0,9). Для более концентрированной сети MSD плато с более длительным временем задержки. Максимальный MSD, полученный путем анализа q-зависимости параметра неэргодичности (показанный на рисунке 7B с горизонтальной линией при δ² = 0,0032 мкм2), был примерно тем же значением, к которому MSD из SPT и DDM, по-видимому, плато. На рисунке 7А существует расхождение между msD с самым длительным временем задержки, определенным по DDM и SPT. Хотя это может быть связано с ограниченным числом длинных траекторий времени задержки, также может быть так, что дальнейшая оптимизация диапазона значений q, для которых матрица DDM используется для оценки каждого времени задержки (как это сделано Bayles et ^al.76 и Edera et ^al.77), улучшит наши результаты, и такая оптимизация будет в центре внимания будущей работы.

Эти эксперименты, в которых были записаны последовательности изображений трассирующих шариков, встроенных в сеть промежуточных нитей виментина, позволили провести независимый анализ: DDM (с использованием пакета, описанного здесь) и SPT (с использованием trackpy). Оба анализа могут выявить степень субдиффузии и длины удержания, что позволяет использовать два независимых метода анализа изображений для обеспечения дополнительных показателей. Существуют дополнительные количества, которые можно сравнить по SPT и DDM. Например, неоднородность в динамике образца может проявляться как негауссовская негауссовость в распределении перемещений частиц (т.е. распределении Ван Хоува), определяемом из SPT, а также в ISF, определяемом из DDM, который подходит к растянутой экспоненциальной^34,35. На рисунке S1 показано распределение Ван Хоува для частиц 0,6 мкм в виментиновых сетях и обсуждается показатель растяжения, обнаруженный при подгонке ISF — метрики, используемые в тандеме в предыдущих исследованиях для демонстрации гетерогенной динамики частиц в биомиметических системах ^9,10,47 или других переполненных средах ³⁴ . В качестве другого примера, ISF можно рассчитать на основе траекторий частиц, измеренных с помощью SPT, и сравнить с полученными DDM ISF. В то время как средние квадратные смещения и распределения смещений являются метриками, которые чаще всего извлекаются из анализа SPT, можно также вычислить ISF по траекториям частиц, используя (см. Рисунок S2). Этот ISF можно сравнить с DDM-генерируемыми ISF и использовать для выявления динамики, не очевидной в MSD⁵⁹.

Хотя получение изображений индикаторных частиц в сети может позволить использовать дополнительные методы анализа SPT и DDM, важно отметить, что преимущество DDM перед SPT заключается в том, что он не требует изображений бусин (или других признаков), которые могут быть легко локализованы и отслежены. Чтобы продемонстрировать этот момент, мы далее выделим анализ активных сетей нитей актина и микротрубочек, где флуоресцентная маркировка актина и тубулина позволяет визуализировать оба типа нитей, отличающихся друг от друга с помощью различных флуорофоров, с помощью многоцветного лазерно-сканирующего конфокального микроскопа.

Изображения были получены с помощью лазерно-сканирующего конфокального микроскопа сетей актин-микротрубочек с активностью, обусловленной миозином (миозин скелетных мышц кролика II; Цитоскелет #MY02). Подробности экспериментов и результатов были ранее описаны¹¹, а репрезентативные результаты, показанные здесь, взяты из анализа двух фильмов, представленных в дополнительных материалах (фильмы S1 и S4) для¹¹. Обе последовательности изображений были записаны со скоростью 2,78 кадра/с в течение 1000 кадров.

Для анализа этих изображений матрица DDM была рассчитана на 50 лагов в диапазоне от 0,4 с до 252 с (1 кадр на 700 кадров). Затем матрица DDM была адаптирована к модели , при этом промежуточной функцией рассеяния была . Таким образом, существует четыре параметра соответствия: A, τ, s и B. Результаты этих припадков показаны на рисунке 8. Было отмечено, что матрица DDM для конкретного значения q имела плато при низком времени задержки, увеличивалась со временем задержки, а затем стабилизировалась (или показывала признаки начала плато) в большие промежутки времени задержки. Матрица DDM для более низких значений q не достигла плато при длительном времени задержки. Поэтому следует ожидать низкой точности в измерении времени распада для этой низкой динамики q (масштаб большой длины).

Характерное время распада, τ, от прилегания к матрице DDM показано на рисунке 9. Результаты представлены для активной актин-микротрубочки композитной сети (аналогично фильму S1¹¹) и для активной актиновой сети (аналогично фильму S4¹¹). Обе сети были получены с одинаковыми концентрациями актина и миозина, но сеть только актина была создана без тубулина, как описано в¹¹. Для этих двух типов активных сетей наблюдаемое соотношение степенного закона было . Это масштабирование указывает на баллистическое движение и на то, что сокращение и поток, управляемые миозином, доминируют над тепловым движением нитей. Из τ = (vq)^-1 можно найти характерную скорость, v, около 10 нм/с для активной сети актин-микротрубочек и 75 нм/с для активной актиновой сети. Эти значения согласуются с анализом велоциметрии изображения частиц тех же видео, показанных в¹¹. Масштабирование не соответствовало нижним значениям q для активной композитной сети актин-микротрубочки. Вероятно, это связано с тем, что истинное время распада для этой композитной сети актин-микротрубочки при более низких значениях q больше, чем максимальное время задержки вычисляемой матрицы DDM. Максимальное время задержки обозначено горизонтальной красной линией на рисунке 9, а время распада отклоняется от ожидаемого масштабирования вблизи этих более длительных времен.

Рисунок 8: Матрица DDM и время задержки для активной композитной сети актин-микротрубочки. Матрица DDM для нескольких значений q строится как функция времени задержки из пленки композитной сети, состоящей из 2,9 мкМ актиновых мономеров, димеров тубулина 2,9 мкМ и миозина 0,24 мкМ. Эти данные показывают анализ как раз микротрубочкового канала многоцветного временного ряда изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9: Время распада в сравнении с волновым числом для активных сетей актин-микротрубочек. Из соответствия матрицы DDM обнаруживается время распада , τ, как функция волнового числа, q. График τ vs q для изображений активной сети актин-микротрубочек (анализируя только канал микротрубочек) коричневого цвета и для изображений активной актиновой сети зеленым цветом. Обе сети имеют одинаковые концентрации актина и миозина (2,9 мкМ и 0,24 мкМ соответственно); актин-микротрубочка имеет 2,9 мкМ димеров тубулина. Время распада для активной актиновой сети намного меньше, чем время распада для активной сети актин-микротрубочек, что указывает на более быстрое движение активной актиновой сети. В обоих случаях динамика является баллистической, поскольку данные следуют за тенденцией. Вставка: график ISF против времени задержки, масштабируемого по волновому числу (Δt × q), показывает коллапс ISF в диапазоне значений q . Это также указывает на баллистическое движение. ISF, показанные в этой вставке, взяты из активной сети актинов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Для этих данных активных сетей мы выбрали DDM-матрицу, . Это контрастирует с тем, что было сделано для данных шариков в виментиновой сети, где A (q) и B были оценены без какой-либо подгонки для изоляции ISF, f (q, Δt). В этом случае для активных сетевых данных A и B были оставлены в качестве подходящих параметров, поскольку методы, используемые для оценки B , не приводили к хорошим соответствиям. Метод оценки B по умолчанию заключается в вычислении и предположении, что в целом q это относится к B/2. Однако этот метод переоценил B для этих данных, что проявилось в том, что при расчете ISF из B , оцененных таким образом (не показанных), ISF были больше 1 в ранние времена задержки (тогда как они должны были идти от максимума 1 до нуля или некоторого неэргодичного параметра с увеличением времени задержки). Другие методы оценки B можно выбрать, используя параметр background_method. Одним из этих других методов является оценка B как минимума матрицы DDM в раннее время задержки (установленное с background_method = 1). Аналогичный метод был использован Bayles et ^al.76, хотя они не предполагали, что B является постоянным с q. Другой вариант заключается в том, чтобы оценить B как среднее значение за все время задержки матрицы DDM при максимальном q (заданном с background_method = 2). Эти различные методы оценки фона, а также результаты, позволяющие B быть параметром свободного подгонки, показаны на рисунке 10. Из этих графиков видно, что амплитуда, A, не достигала нуля при наибольших значениях q , так как не плато на большом q (рисунок 10B), а поскольку D(q_max, Δt) перешла от более низкого плато времени задержки к некоторому более высокому плато времени задержки (т.е. при q_max было ненулевое A; Рисунок 10D). Поэтому не было бы целесообразно ни оценивать В как , ни как . Следует проверить q и D(q_max, Δt) и Δt , прежде чем принимать решение о том, как (или если) оценивать B.

Рисунок 10: Фоновое и волновое число для активных сетей актин-микротрубочек. Подгоняя матрицу DDM, можно найти фон, B, как функцию волнового числа, q. ПоказанB   против q для изображений активной сети актин-микротрубочек (анализируя только канал микротрубочек), определенных по этим соответствиям фиолетовым символам. Три сплошные линии в (А) показывают оценки фона, найденного без какой-либо подгонки. Верхняя, самая темная линия в (A) показывает предполагаемый фон с использованием , что может быть уместно, если плато до постоянного значения при большом q. Из (B) обратите внимание, что еще не достигло постоянного значения при наибольшем исследованном q. Поэтому использование этого метода переоценивает фон. Нижняя строка в (A) показывает предполагаемый фон с использованием . Если матрица DDM показывает низкое плато времени задержки, как показано в (C) с красной линией, то этот метод может быть подходящим для оценки фона. Средняя, самая светлая линия в (A) показывает предполагаемый фон от . Этот метод может быть целесообразным, если при q_max амплитуда A достигла нуля. Из (D) видно, что амплитуда не равна нулю и, следовательно, этот метод переоценивает фон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок S1: Вероятностные распределения смещений частиц. Вероятностные распределения перемещений частиц показывают негауссовскую величину для концентраций виментина 34 мкМ и 49 мкМ. Отслеживание одиночных частиц диаметром 0,6 мкм в виментиновых сетях различных концентраций проводилось. Различное время задержки показано в распределениях смещения для трех условий. (A) Распределение смещений частиц в виментиновой сети 19 мкМ соответствует функции Гаусса. Ширина гаусса увеличивается с увеличением времени задержки. (B) Распределение перемещений частиц в виментиновой сети 34 мкМ показывает большую негауссовскую степень, особенно при больших смещениях, чем в случае 19 мкМ. (C) Распределение смещений частиц в виментиновой сети 49 мкМ также показывает негауссовость. Кроме того, ширина распределений не увеличивается со временем задержки так же значительно, как в образцах с более низкими концентрациями виментина, что указывает на замкнутое движение. Негауссовские распределения Ван Хоува (наблюдаемые для всех образцов виментина, но наиболее очевидные в более высоких концентрациях) связаны с гетерогенной динамикой, как это часто наблюдается при переносе частиц в переполненных и замкнутых средах. Другим показателем гетерогенного переноса, который определяется из DDM-анализа, является экспонента растяжения, используемая для соответствия промежуточной функции рассеяния (параметр s в уравнении для ISF используется здесь: + ). Средние показатели растяжения в q-диапазоне от 0,4 ^мкм-1 до 9,4 ^мкм-1 составляют, от самой высокой концентрации виментина до самой низкой, 0,53 ± 0,07, 0,64 ± 0,02 и 0,86 ± 0,04 (среднее ± стандартное отклонение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Промежуточные функции рассеяния от DDM и SPT. Показаны промежуточные функции рассеяния (ISF) для пяти различных волновых чисел. Время ISF против лага, найденное через DDM, строится с помощью круговых маркеров, а ISF вычисляется из траекторий одной частицы с открытыми квадратами. Пунктирные черные линии показывают соответствие приобретенным DDM ISF. ISF рассчитывается по траекториям одиночных частиц, используя . В (A) ISF показан для частиц 0,6 мкм в виментиновых сетях 19 мкМ. В (B) ISF показан для частиц 0,6 мкм в виментиновых сетях 34 мкМ. Расхождения в ISF, обнаруженные в DDM и SPT, вероятно, обусловлены ограниченным числом длительных траекторий времени задержки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: Протокол для использования DDM. Представлены входные и выходные шаги, показанные в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Сведения о подготовке образцов и примеры файлов параметров для сетей виментина. Приведены подробные этапы подготовки образцов и получения изображений на виментиновых сетях. Кроме того, приводится пример файла параметров для анализа данных, представленных в разделе репрезентативных результатов по сетям виментина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Программный пакет, описанный здесь, использует DDM для анализа флуктуаций плотности, наблюдаемых на изображениях, полученных с помощью оптического микроскопа. Впервые были показаны репрезентативные результаты из данных индикаторных частиц, встроенных в виментиновые сети. Анализ таких данных может быть использован для характеристики размера ячеек и жесткости сети аналогично тому, как отслеживание одиночных частиц использовалось во многих прошлых исследованиях^сетей цитоскелетов ^6,12,13. Преимущество использования DDM по сравнению с отслеживанием одной частицы заключается в том, что DDM не требует локализации частиц. Поэтому даже на изображениях, где плотность частиц слишком высока или частицы слишком малы для локализации и отслеживания, DDM все еще может определять динамику. Где отслеживание одной частицы было бы предпочтительнее, так это при проверке изменчивости частицы к частице. С DDM можно найти усредненную динамику ансамбля, тогда как при отслеживании одной частицы можно вычислить как MSD одной частицы, так и MSD ансамбля. Тем не менее, DDM можно использовать для исследования гетерогенной динамики путем анализа нескольких областей интереса в большом поле зрения.

Далее были показаны репрезентативные результаты из данных флуоресцентно меченых нитей в активной сети, состоящей из двух различно меченых типов цитоскелетных нитей¹¹. С помощью этих данных баллистическое движение было охарактеризовано без необходимости каких-либо локализуемых особенностей в изображении. Поскольку DDM извлекает ансамблевую усредненную динамику с небольшим количеством пользовательских входных данных, это делает сравнение серий изображений, полученных с различными условиями, простым (например, сравнение образцов с различным отношением актина к микротрубочкам или образцов с различными концентрациями миозина, как это сделано в⁵⁰). Кроме того, используя флуоресцентную визуализацию, мы можем исследовать динамику различных компонентов сети с помощью многоцветной маркировки. Это было сделано в ^11,50, где динамика актина и микротрубочек была отдельно проанализирована в активной композитной сети актин-микротрубочки с использованием многоцветной визуализации. В разделе репрезентативных результатов здесь были показаны только результаты из канала микротрубочек, но в предыдущей работе мы сравнили динамику микротрубочек и актиновых нитей¹¹.

Мы отмечаем, что эти репрезентативные результаты демонстрируют либо пассивную субдиффузию, либо активное баллистическое движение. Важно отметить, что DDM может быть использован для анализа систем, где есть кроссовер в типе динамики на промежуточных временных или длинных масштабах. В качестве примеров Kurzthaler et al. использовали DDM с системой активных коллоидов Януса для исследования активного направленного движения в коротких временных масштабах и рандомизации ориентации на более длинных временных масштабах⁵⁹; Giavazzi et al. использовали DDM с огрубляющей пеной и обнаружили кроссовер в динамике, соответствующий шкале длины пузырька³³; и Cho et al. использовали DDM с коллоидными гелями и обнаружили три различимых режима на разных масштабах длины, охватывающих от фрактальных кластеров до всей сети³².

Данные, включенные в раздел репрезентативных результатов, были получены с помощью микроскопии яркого поля и лазерно-сканирующей конфокальной микроскопии. Однако, как отмечалось ранее, DDM может использоваться со многими методами визуализации. При любом способе визуализации пользователи должны учитывать оптические настройки, такие как степень оптического сечения или глубина резкости. Высокая степень оптического сечения может уменьшить сигнал от объектов, находящихся вне фокуса, но нельзя будет точно измерить динамику во временных масштабах, превышающих временную шкалу для объектов, чтобы выйти из глубины резкости^25,28. Более подробное обсуждение того, как q-зависимая глубина резкости влияет на DDM-анализ, можно найти в²². Для визуализации яркого поля пользователям также может потребоваться учитывать толщину образца. В то время как для образцов со слабым рассеянием более толстые образцы могут обеспечивать больший сигнал⁴², мутные образцы могут потребовать изменения анализа с учетом многократного рассеяния⁸¹. Наконец, для методов визуализации, которые не являются инвариантными линейного пространства (то есть, когда интенсивность, регистрируемая камерой объекта, зависит от того, где этот объект находится в плоскости выборки x-y), может потребоваться учитывать дисперсию линейного пространства, как показано в DDM²⁷ темного поля.

Для тех, кто начинает работу с DDM, мы хотим подчеркнуть важность рассмотрения пространственного и временного разрешения. При проверке определенного времени затухания в зависимости от волнового числа важно отметить пределы своего разрешения (т. Е. Максимальное и минимальное время задержки и максимальное волновое число, как это сделано на рисунке 5). Следует тщательно продумать эти ограничения перед сбором данных, чтобы можно было выбрать оптимальный объектив, размер изображения, частоту кадров и продолжительность фильма. Другим важным соображением является то, как оценить фоновый параметр B. В литературе использовались многочисленные методы оценки фона, а последствия чрезмерного или недооценки В были описаны в предыдущих публикациях^62,77. Как показано на рисунке 10, PyDDM позволяет пользователям реализовывать различные методы оценки B, и мы предлагаем новым пользователям попробовать эти методы и оценить, какие из них подходят для использования.

Сильной стороной этого пакета является его тщательная документация и пошаговые руководства с примерами данных, хранение и организация метаданных для отслеживания того, как выполнялся анализ, и гибкость в том, как анализировать матрицу DDM (различные модели подгонки, несколько методов оценки фонового параметра B, возможность найти MSD). Однако в этом коде есть несколько аспектов, которые можно улучшить. В настоящее время код не оптимизирован для быстрой скорости вычислений. Методов ускорения вычислений было сообщено^61,62, и они будут реализованы в будущих выпусках. Кроме того, мы планируем внедрить недавно сообщенные методы для лучшей оценки неопределенностей и использовать моделирование для направления пользователей к соответствующей модели^{ISF 62}. Для других улучшений мы надеемся, что пользователи свяжутся с нами с предложениями.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMOS камера, Orca-Flash 4.0	Hamatsu
F-127 Pluronic	Sigma Aldrich
Jupyter Notebook
Nanodrop	Thermo Fisher
Nikon Ti-Eclipse микроскоп	Nikon
PLL-PEG-bio	SuSos AG, Dü Бендорф, Швейцария
Полистирольные бусины	Sigma Aldrich
Протеиновый диализ мини-кассета	Thermo Fisher
PyDDM	Университет Сан-Диего	N/A	Программное обеспечение с открытым исходным кодом доступно в https://github.com/rmcgorty/PyDDM