Методическая статья

Метод очистки тканей для визуализации нейронов от мезоскопических до микроскопических масштабов

DOI:

10.3791/63941

⸱

10 мая 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroanatomy, Juntendo University Graduate School of Medicine, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Juntendo University Graduate School of Medicine, 3Advanced Research Institute for Health Sciences, Juntendo University, 4Department of Neuroscience, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Japan Society for the Promotion of Science, 6Department of Oral Anatomy and Neurobiology, Graduate School of Dentistry, Osaka University, 7Department of Multi-Scale Brain Structure Imaging, Juntendo University Graduate School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол предоставляет подробный метод визуализации нейронов в срезе мозга с использованием метода очистки тканей ScaleSF. Протокол включает в себя подготовку тканей головного мозга, осветление тканей, обработку очищенных срезов и конфокальную лазерную сканирующую микроскопическую визуализацию нейронных структур от мезоскопического до микроскопического уровней.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен подробный протокол для визуализации нейронных структур от мезоскопического до микроскопического уровней в тканях мозга. Нейронные структуры, начиная от нейронных цепей и заканчивая субклеточными нейронными структурами, визуализируются в срезах мозга мыши, оптически очищенных с помощью ScaleSF. Этот метод очистки является модифицированной версией ScaleS и представляет собой гидрофильный метод очистки тканей для срезов тканей, который обеспечивает мощную очищающую способность, а также высокий уровень сохранения флуоресцентных сигналов и структурной целостности. Настраиваемая трехмерная (3D)-печатная камера визуализации предназначена для надежного монтажа очищенных тканей мозга. Мозг мыши, которому вводили аденоассоциированный вирусный вектор, несущий усиленный ген зеленого флуоресцентного белка, фиксировали 4% параформальдегидом и разрезали на срезы толщиной 1 мм с помощью вибрирующего слайсера тканей. Срезы мозга очищали в соответствии с протоколом очистки, который включал последовательные инкубации в трех растворах, а именно: раствор scaleS0, фосфатный буферный физиологический раствор (-) и раствор ScaleS4, в общей сложности 10,5-14,5 ч. Очищенные срезы мозга были установлены на камере визуализации и встроены в 1,5% агарозный гель, растворенный в растворе ScaleS4D25(0). Получение 3D-изображения срезов осуществлялось с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, оснащенного мульти-погружным объективом большого рабочего расстояния. Начиная с мезоскопической нейрональной визуализации, нам удалось визуализировать тонкие субклеточные нейронные структуры, такие как дендритные шипы и аксональные бутоны, в оптически очищенных срезах мозга. Этот протокол облегчит понимание нейронных структур от схемы до субклеточных компонентных масштабов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы очистки тканей улучшили глубинно-независимую визуализацию биологических и клинических образцов с помощью световой микроскопии, что позволяет извлекать структурную информацию на интактных тканях 1,2. Методы оптической очистки также могут потенциально ускорить и снизить стоимость гистологического анализа. В настоящее время существуют три основных подхода к очистке: гидрофильный, гидрофобный и гидрогелевой методы 1,2. Гидрофильные подходы превосходят в сохранении флуоресцентных сигналов и целостности тканей и менее токсичны по сравнению с двумя другими подходами 3,4.

Гидрофильный метод очистки, ScaleS, занимает отличительное положение с сохранением структурной и молекулярной целостности, а также мощной очищающей способностью (спектр очистки-сохранения)5. В предыдущем исследовании мы разработали протокол быстрой и изометрической очистки, ScaleSF, для срезов тканей (толщина ~ 1 мм), изменив процедуру очистки ScaleS6. Этот протокол очистки требует последовательных инкубаций срезов мозга в трех растворах в течение 10,5-14,5 ч. Метод отличается высоким спектром очистки-сохранения, который совместим даже с электронным микроскопическим (ЭМ) анализом (дополнительный рисунок 1), что позволяет создавать многомасштабную трехмерную (3D) визуализацию высокого разрешения с точной реконструкцией сигнала6. Таким образом, ScaleSF должен быть эффективен, особенно в головном мозге, где нейронные клетки развивают буйные процессы огромной длины и организуют специализированные тонкие субклеточные структуры для передачи и приема информации. Извлечение структурной информации с помощью шкал от контурного до субклеточного уровней на нейронных клетках весьма полезно для лучшего понимания функций мозга.

Здесь мы предоставляем подробный протокол для визуализации нейронных структур с масштабами от мезоскопического / схемы до микроскопического / субклеточного уровня с использованием ScaleSF. Протокол включает в себя подготовку тканей, осветление тканей, обработку очищенных тканей и конфокальную лазерную сканирующую микроскопию (CLSM) визуализацию очищенных тканей. Наш протокол фокусируется на опросе нейронных структур от схемы до субклеточных компонентных масштабов. Подробную процедуру приготовления растворов и стереотаксической инъекции векторов аденоассоциированного вируса (AAV) в мозг мыши см. в Miyawaki et al. 20167 и Okamoto et al. 20218, соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты были одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию Университета Дзюнтендо (одобрение No 2021245, 2021246) и выполнены в соответствии с Фундаментальными руководящими принципами надлежащего проведения экспериментов на животных Научным советом Японии (2006). Здесь использовали самцов мышей C57BL/6J, которым вводили вектор AAV, несущий ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) и трансгенных мышей парвалбумина (PV)/миристоилирования-EGFP-рецептора липопротеинов низкой плотности C-концевой бактериальной искусственной хромосомы (BAC) трансгенных мышей (мыши PV-FGL)9 . Мыши PV-FGL поддерживались на фоне C57BL/6J. В отношении этого исследования не было обнаружено различий по признаку пола.

1. Тканевая подготовка

  1. Перфузионная фиксация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 1.1.1-1.1.3 в вытяжном шкафу, чтобы ограничить воздействие параформальдегида (PFA).
    1. Обезболить взрослых самцов мышей (8–16 недель) внутрибрюшинной инъекцией передозировки пентобарбитала натрия (200 мг/кг). Подтверждают адекватность анестезии отсутствием снятия пальцев ног и рефлексов моргания глаз.
    2. Откройте грудную полость и срежьте хирургическими ножницами правый предсердный придаток. Перфьминируйте мышей 20 мл ледяного фосфатного буферного раствора (PBS) с помощью иглы 23 Г, прикрепленной к шприцу объемом 20 мл, с последующей перфузией 20 мл ледяного холодного 4% PFA в 0,1 М фосфатном буфере (ПБ) с использованием другого шприца объемом 20 мл.
      ВНИМАНИЕ: ПФА токсичен и тератогенен. Избегайте вдыхания или контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой.
    3. Удалите ткани мозга из черепа пинцетом. Переложите ткани мозга в трубку объемом 15 мл, содержащую 4% PFA в 0,1 М ПБ, защитите образцы от света и осторожно качайте в течение ночи при 4 °C на шейкере при 50–100 об/мин.
    4. ПРИМЕЧАНИЕ: Собранные ткани мозга могут храниться в течение нескольких недель в 0,02% азида натрия (NaN3) в PBS при 4 °C.
      ВНИМАНИЕ: NaN3 токсичен. Избегайте вдыхания или контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. Поместите его внутрь вытяжного капюшона.
  2. Подготовка мозгового среза
    1. Приготовьте 4% агар в PBS, добавив 2 г агара к 50 мл PBS. Разогрейте смесь в микроволновой печи до полного растворения агара. Дайте раствору остыть до 40-45 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вязкое свойство, обеспечиваемое агаропектином, основным компонентом агара, улучшает легкость разрезания срезов ткани.
    2. Добавьте 10 мл раствора агара в 6-луночную культуральную пластину. Погрузите мозговую ткань в раствор агара с помощью щипцов. Дайте агару затвердеть на льду.
    3. Извлеките внедренную мозговую ткань из колодца и обрежьте агар лезвием бритвы. Закрепите блок агара на дне вибратомной ванны с помощью суперклея и налейте 0,1 М ПБ в буферный лоток.
    4. Очистите другое лезвие бритвы, используя безворсовую папиросную бумагу, пропитанную этанолом, и прикрепите лезвие к держателю лезвия вибрирующего слайсера тканей.
    5. Установите скорость сечения 0,14 мм/с с амплитудой 1,4 мм и частотой 75–77 Гц. Разрежьте ткань мозга на кусочки толщиной 1 мм и соберите срезы в 6-луночную пластину клеточной культуры, содержащую PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Срезы мозга могут храниться в течение нескольких недель в 0,02% NaN3 в PBS при 4 °C.

2. Осветление тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Композиции используемых растворов ScaleS перечислены в таблице 1. Образцы должны быть защищены от света, покрываясь фольгой. Этапы очистки показаны на рисунке 1A.

  1. Добавьте 8 мл раствора ScaleS0 в одну лунку 6-луночной клеточной культуральной пластины и добавьте 8 мл раствора ScaleS4 в другую лунку пластины и предварительно нагрейте до 37 °C в инкубаторе.
  2. Переложите срезы мозга в предварительно подогретый раствор ScaleS0 шпателем и высиживайте в течение 2 ч при 37 °C в встряхивающемся инкубаторе при 90 об/мин.
  3. Переложите пермеабилизированные срезы мозга в 8 мл PBS(–) в 6-луночную пластину для культивирования клеток шпателем и промывайте в течение 15 мин, держа в орбитальном шейкере при 40–60 об/мин. Повторите это дважды.
  4. Переложите кусочки мозга в предварительно разогретый 8 мл раствора ScaleS4 шпателем и очистите их путем инкубации в встряхивающем инкубаторе при 90 об/мин в течение 8–12 ч при 37 °C. Очищенные срезы мозга можно увидеть на рисунке 1.

3. Монтаж мозгового среза

ПРИМЕЧАНИЕ: Настраиваемая камера визуализации используется для надежного монтажа очищенных срезов мозга (рисунок 2)6. Камера состоит из рамы камеры и нижней крышки. Адаптеры ступени микроскопа также предназначены для установки камеры визуализации непосредственно на ступенях микроскопа (рисунок 2A, B). Каркас камеры и адаптеры ступени микроскопа могут быть напечатаны на 3D-принтере с использованием собственных или аутсорсинговых услуг 3D-печати. Данные 3D-автоматизированного проектирования (CAD) камеры визуализации представлены в Furuta et al. 20226.

  1. Для подготовки камеры прикрепите раму камеры к крышке с помощью чувствительного к давлению клея.
  2. Готовят 1,5% агарозу в растворе ScaleS4D25(0) (гель ScaleS4), добавляя 1,5 г агарозы в 100 мл раствора во флаконе. Хорошо перемешайте раствор, перемешав и разогрейте раствор в микроволновой печи до полного растворения агарозы. После этого дайте раствору остыть до 37 °C.
  3. Установите очищенный мозговой срез на нижнюю крышку камеры визуализации шпателем. Протрите лишний раствор с очищенного среза с помощью чистой папиросной бумаги без ворса.
  4. Добавьте гель ScaleS4 на срез мозга с помощью микропипетки, чтобы заполнить камеру визуализации. Поместите сверху еще одну крышку с щипцами и поместите кусок безворсовой папиросной бумаги и стеклянный слайд на крышку в указанном порядке.
  5. Перенесите камеру визуализации в холодильник при температуре 4 °C. Поместите металлические гири на стеклянную горку и оставьте их на 30 минут.
  6. Извлеките металлические гири, стеклянную горку, безворсовую папиросную бумагу и крышку из камеры визуализации и вытрите лишний гель (рисунок 2A, B).
  7. Поместите камеру визуализации в стеклянную чашку Петри диаметром 60 мм и прикрепите ободок камеры визуализации к чашке с помощью клея, похожего на давление. Прикрепите камеру в нескольких точках к чашке Петри.
  8. Вылейте раствор ScaleS4 в посуду и аккуратно встряхивайте в течение 1 ч при 20-25 °C на орбитальном шейкере при 40-60 об/мин. Замените свежим раствором и удалите пузырьки воздуха на поверхности геля, аккуратно соскребая поверхность с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл. Установите погруженную камеру визуализации на ступень микроскопа (рисунок 2C).

4. Визуализация CLSM

  1. Получайте изображения с помощью CLSM, оснащенного объективом с несколькими погружениями на большое рабочее расстояние (WD) (числовая диафрагма 16x/0,60 [NA], WD = 2,5 мм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объективы с высоким NA могут обеспечить высокое дифракционное разрешение.
  2. Включите все необходимое оборудование для обработки изображений (рабочую станцию, микроскоп, сканер, лазеры и ртутную лампу) и запустите программное обеспечение для визуализации CLSM.
  3. Установите корректирующий воротник объектива с несколькими погружениями на 1,47. Раствор ScaleS4 имеет показатель преломления (RI) около 1,47 5,7. Аберрации, вызванные несоответствием RI, могут нарушить формирование изображения (рисунок 3).
  4. Погрузите объектив в раствор и позвольте ему медленно приблизиться к срезу. Удалите все пузырьки воздуха, захваченные на кончике объектива. Найдите интересующие области (ROI) в очищенных тканях с помощью эпифлуоресценции.
  5. Задайте параметры получения изображения, проверив соответствующие настройки.
    1. Определите битовую глубину для получения изображения. Размер данных изображения увеличивается с битовой глубиной.
    2. Задайте длину волны обнаружения. Отрегулируйте соответствующий затвор для детектора в соответствии со спектром излучения. Убедитесь, что длина волны обнаружения не покрывает лазерные линии.
    3. Установите разрешение xy . Большие форматы обеспечивают лучшее разрешение xy , но для сбора изображений требуется больше времени.
    4. Установите скорость сканирования. Более медленная скорость сканирования обеспечивает высокое отношение сигнал/шум. Тем не менее, это также увеличивает время выдержки пикселя и риск фотоотбеливания. Выбирайте соответственно.
    5. Отрегулируйте размер точечного отверстия. Размер точечного отверстия контролирует толщину оптического сечения. Меньший размер точечного отверстия создает более тонкое оптическое сечение и, следовательно, лучшее разрешение z , но уменьшает флуоресцентный сигнал. Увеличение размера точечного отверстия обеспечивает более толстый оптический участок с более сильным флуоресцентным сигналом.
    6. Установите мощность лазера, усиление детектора/усилителя и смещение. Постепенно увеличивайте мощность лазера и коэффициент усиления детектора/усилителя до получения подходящего изображения. Высокая мощность лазера несет в себе риск фотоотбеливания. Отрегулируйте смещение (контрастность) соответствующим образом, чтобы получить высокое отношение сигнал/шум.
    7. Определите необходимую площадь обработки почвы на основе размера ROI. Убедитесь, что вся длина и ширина ROI зафиксированы.
    8. Перемещайтесь по очищенным тканям во всех плоскостях и устанавливайте начальную и конечную точки стека. Установите размер z-шага в соответствии с требуемым z-разрешением.
  6. Собирайте изображения, когда вы удовлетворены настройками получения изображений, и записывайте захваченные изображения. Обрабатывайте изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптическая очистка среза мозга мыши толщиной 1 мм была достигнута с использованием этого протокола. Рисунок 1B представляет собой изображения передачи среза мозга мыши до и после очистки. Метод очистки тканей сделал срез мозга мыши толщиной 1 мм прозрачным. Незначительное расширение конечных размеров срезов мозга было обнаружено после инкубации в очищающем растворе в течение 12 ч (линейное расширение: 102,5% ± 1,3%). Сохранение флуоресценции и структурной целостности тканей оценивали с помощью целевой эк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги в рамках протокола
В протоколе есть несколько критических шагов, которые следует выполнять с максимальной осторожностью для получения значимых результатов. Равномерная фиксация образцов необходима для 3D-визуализации в крупномасштабных тканях. Объектив, образец и иммерсионная жидкость должны иметь соответствующий RI. RI-несоответствие между ними приведет к сильно нарушенной визуализации EGFP-экспрессирующих клеток в очищенных срезах мозга (рисунок 3). Коррекционная ре...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Йоко Исиду (Университет Дзюнтендо) за производство векторов AAV и Кисару Хосино (Университет Дзюнтендо) за техническую помощь. Это исследование было поддержано JSPS KAKENHI (JP20K07231 to K.Y.; JP21H03529 в Т.Ф.; JP20K07743 в М.К.; JP21H02592 в H.H.) и научные исследования по инновационной области «Резонанс био» (JP18H04743 to H.H.). Это исследование также было поддержано Японским агентством медицинских исследований и разработок (AMED) (JP21dm0207112 to T.F. и H.H.), Moonshot R&D от Японского агентства по науке и технике (JST) (JPMJMS2024 до H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) от JST (JPMJFR204D to H.H.), Грантами в помощь от Научно-исследовательского института заболеваний пожилого возраста в Медицинской школе Университета Джунтендо (X2016 до K.Y.; X2001 - H.H.), и проект брендинга частных школ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16x мультииммерсионный объективLeica MicrosystemsHC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR
АгарNacalai Tesque01028-85
АгарозаTaKaRa BioL03
ДиметилсульфоксидNacalai Tesque13407-45
D-сорбитNacalai Tesque06286-55
γ- циклодекстринWako Pure Chemical Industries037-10643
ГлицеринSigma-AldrichG9012
Huygens EssentialScientific Volume Imagingver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b
ImarisBitplanever. 9.0.0
Leica Application Suite XLeica MicrosystemsLAS X, ver. 3.5.5.19976
Метил-&бета;-циклодекстринТокио Химическая промышленностьM1356
ПараформальдегидMerck Millipore1.04005.1000
Фосфат буферизованный физиологический раствор (10x; pH 7.4)Nacalai Tesque27575-3110x PBS (–)
Азид натрияNacalai Tesque31233-55
Пентобарбитал натрияKyoritsu SeiyakuN/A
TCS SP8Leica MicrosystemsN/A Triton
X-100Nacalai Tesque35501-15
МочевинаNacalai Tesque35940-65
ВиброрезкаDosaka EMPRO7N

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  2. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  3. Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
  4. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  5. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  6. Furuta, T., et al. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 25 (1), 103601(2022).
  7. Miyawaki, A., et al. Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy. Protocol Exchange. , (2016).
  8. Okamoto, S., et al. Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system. STAR Protocols. 2 (1), 100230(2021).
  9. Kameda, H., et al. Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites. The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).
  10. Sohn, J., et al. A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system. PLoS One. 12 (1), 0169611(2017).
  11. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  12. Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).
  13. Kuramoto, E., et al. Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors. Cerebral Cortex. 19 (9), New York, N.Y. 2065-2077 (2009).
  14. Matsuda, W., et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
  15. Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
  16. Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
  17. Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6, 34331(2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D

Похожие статьи