Настоящий протокол был одобрен местным комитетом по этике экспериментов на животных и Институциональным комитетом по благополучию животных (APAFIS#30483-2021031811339219 v1, Комитет по этике животных Университета Парижа Сакле, Франция). Животные лечились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, разработанным Национальным институтом здравоохранения, и Принципами ухода за лабораторными животными, разработанными Национальным обществом медицинских исследований.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические процедуры проводились в условиях строгой стерильности с использованием тех же методов, которые использовались для человека. Экспериментальные процедуры включали крупных белых поросят (45-60 кг) и проводились под общим наркозом.
1. Протокол кондиционирования и анестезии животных
- Дайте животным акклиматизироваться в течение 7 дней, с конгенерами и обогащением окружающей среды, чтобы обеспечить благополучие животных.
- Не кормите животных за 12 ч до их включения в протокол эксперимента.
- Проводят премедикацию за 30 мин до процедуры с внутримышечной инъекцией эквимолярной смеси тилетамина и золазепама (10 мг/кг) в мышцы шеи.
- Как только животное успокоится, вставьте катетер в ушную вену и индуцируйте общую анестезию внутривенным болюсом пропофола (2 мг / кг) в сочетании с введением атракурия (2 мг / кг).
- Интубируйте животное с помощью 7,5 мм оротрахеального зонда.
- Контролируйте животное с помощью непрерывной ЭКГ, выдоха CO2 и оксиметрии.
- Поддерживайте общую анестезию ингаляционным изофлураном (2%), смешанным с 40% кислородной добавкой.
2. In situ гемодинамическая и эхокардиографическая оценка сердца
ПРИМЕЧАНИЕ: Гемодинамическая оценка проводится с помощью катетера Swan Ganz, в то время как базовая функциональная оценка сердца выполняется с помощью трансторакальной эхокардиографии.
- Вставьте чрескожную оболочку из 8 французских (Fr) в брахиоцефальный венозный ствол по методике Зельдингера8.
- После обезвоживания катетера и установки давления 0 вставьте катетер Swan Ganz в оболочку 8 Fr до тех пор, пока на экране мониторинга не будет наблюдаться профиль легочного давления.
- Получите давление окклюзии легочной артерии, протолкнув катетер Пило-Ганца в легочном кровообращении, пока баллон надувается.
- Оценить сердечный выброс с помощью терморазбавления путем инфузии 10 мл холодного (4 °C) физиологического раствора в проксимальной линии катетера Swan Ganz. Повторите измерение три раза.
- Оцените фракцию выброса левого желудочка (LVEF) с помощью биплана Симпсона по методике9.
- Исследуйте аортальный клапан и корень аорты, чтобы выявить любое структурное расстройство или регургитацию аорты выше степени 2, которые могут поставить под угрозу перфузию ex situ сердца через восходящую аорту (рисунок 1).
3. Описание и грунтовка нормотермической перфузионной машины ex situ (NESP)
ПРИМЕЧАНИЕ: Модифицированный модуль NESP используется для альтернативного выполнения перфузии Лангендорфа и перфузии рабочего режима. Вкратце, подключите аортальную линию цепи к камере соответствия через Y-образный разъем. Добавьте детский оксигенатор и резервуар для кардиотомии (высота 70-80 см над аортальным разъемом модуля), чтобы обеспечить постнагрузку левого желудочка примерно 70 мм рт.ст. во время режима работы. Подключите еще один резервуар кардиотомии (высота 7-10 см над аортальным разъемом модуля) к основной приточной линии с помощью Y-образного разъема для обеспечения предварительной нагрузки левого предсердия примерно 10 мм рт.ст. во время режима работы (рисунок 2). Коронарный поток оценивается с помощью датчика потока, подключенного к легочной канюле. К цепи подключены центробежный насос, мембранный оксигенатор и нагреватель-охладитель (рисунок 2). Описания решений приведены в таблице 1.
- Грунтуйте перфузионный контур грунтовочным раствором (табл. 1).
- Установите производительность насоса на 1500 мл/мин.
- Добавьте кровь, полученную от свиньи-донора (1200-1500 мл) в схему.
- Установите газовый смеситель для достижения парциального давления кислорода >250 мм рт.ст.
- Подключите к схеме раствор для технического обслуживания и раствор адреналина (таблица 1) и установите начальную производительность соответственно на уровне 5 мл/ч и 0,1 мл/ч.
- Установите температуру перфусата при комнатной температуре (RT) перед размещением сердца в перфузионном модуле.
- Во время рабочего режима подключают шприц добутамина с концентрацией 2,5 мг/мл (выход в пределах 0,04-0,12 мг/ч).
4. Забор сердца и аппаратура для нормотермической перфузии сердца ex situ
- Закупка сердца
- Поместите животное в положение лежа на спине и продолжайте поддерживать общую анестезию.
- Выполняют срединную стернотомию и открывают перикард.
- Подвешивайте перикард четырьмя стойкими швами.
- Поместите 4-0 полипропиленовых швов на правое предсердие и на восходящую аорту, чтобы закрепить канюляции жгутами.
- После инфузии гепарина (300 UI/кг) и тщательного расслоения корня аорты вводят двухступенчатую венозную канюлю в правое предсердие для забора крови и однопросветную канюлю в восходящую аорту для инфузии кардиоплегии.
- Изолировать верхнюю и нижнюю полую вену силастическими жгутами.
- Подключите венозную канюлю к пакету для сбора крови, содержащему 10 000 МЕ нефракционированного гепарина.
- Поместите тело поросенка в положение Тренделенбурга, чтобы улучшить дренаж крови в собирающий мешок.
- После завершения забора крови перекрестно зажмите восходящую аорту, введите кардиоплегию Дель Нидо в корень аорты (таблица 1) и проверьте, что восходящая аорта находится под давлением (без регургитации аорты).
- Разгрузите правое и левое предсердие, открыв нижнюю полую вену и правую легочную вену соответственно, в то время как верхняя полая вена зажимается жгутом.
- Как только инфузия кардиоплегии завершена, обжаривают левую гемазигосную вену двумя швами 4-0 полипропилена.
- Приступайте к сердечным закупкам, сохраняя 2 см легочного ствола вместе с задней стенкой левого предсердия.
- Убедитесь, что нет патентного овального отверстия, осмотрев межпредсердную перегородку и закройте ее при необходимости с помощью 4-0 полипропиленовых швов.
- Аппаратура сердца перед NESP
- Поместите сердце в физиологический раствор с температурой 4 °C и отделите восходящую аорту от легочного ствола. Убедитесь, что аортальный клапан и коронарная остия не повреждены.
- Вставьте четыре заложенных шва (4-0 полипропилена) на 5 мм ниже дистального отдела восходящей аорты и вставьте инфузионную канюлю в аорту. Зажмите зажим шланга вокруг аорты, чтобы закрепить канюлю.
- Вставьте дренажную канюлю в легочный ствол и закрепите 3-0 полипропиленовым шовом.
- Закройте нижнюю и верхнюю полую вену 5-0 полипропиленовыми ходовыми швами.
- Закройте заднюю стенку левого предсердия скользящим швом 4-0 полипропилена.
- Вставьте левую вентиляционную канюлю через заднюю стенку стенки левого предсердия и зажгите жгут вокруг.
- Вставьте канюлю предварительной загрузки в придаток левого предсердия и зажмите жгут вокруг.
5. Подключение к аппарату NESP и реанимация сердца
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед приборами сердца убедитесь, что материалы, необходимые для реанимации, доступны рядом с перфузионным контуром, особенно дефибриллятор с внутренними зондами и внешний кардиостимулятор с эпикардиальными электродами. Убедитесь, что напорная линия подключена к линии аорты, а выходной датчик размещен на линии коронарного потока. Линия догрузки должна быть зажата, как и линия предварительной нагрузки цепи рабочего режима.
- Уменьшите расход насоса до 200 мл/мин.
- Подключите сердце к аортальному разъему после обезвоживания разъема. Убедитесь, что сердце надлежащим образом подключено к перфузионному модулю так, чтобы нижние стенки желудочков и левое и правое предсердие находились перед оператором. Избегайте скручивания восходящей аорты, чтобы предотвратить регургитацию аорты.
- Отрегулируйте аортальное давление до 30 мм рт.ст. при РТ.
- Во время реанимации выполняйте плавный массаж сердца до восстановления синусового ритма.
- Медленно увеличивайте расход насоса в течение 15-25 мин с шагом 50 мл/мин для достижения аортального давления 65 мм рт.ст. При этом увеличивают температуру перфузата с шагом 2-4 °C до 37 °C.
- Как только аортальное давление достигнет 65 мм рт.ст., а температура перфузата - 37 ° C, подайте электрический удар при 5 Дж, если это необходимо, и повторяйте до тех пор, пока синусовый ритм не восстановится.
- Закрепите эпикардиальный электрод на задней стенке правого желудочка и подключите к внешнему кардиостимулятору. Темп сердца при 80 BPM, чтобы перегрузить спонтанный ритм.
- Подключите легочную канюлю к линии коронарного потока.
- Выполните образцы артериальной и венозной крови для газового и биохимического анализа перфузата. Регистрируют начальную концентрацию лактата и корректируют биохимические нарушения для достижения следующих целей: глюкоза >1 г/л, K+ 3,5-5,5 ммоль/л, Ca2+ 1,0-1,20 ммоль/л, рН 7,35-7,45, Na+ 135-145 ммоль/л и HCO3-20-24 ммоль/л.
- Отрегулируйте расход насоса для достижения среднего аортального давления 65-75 мм рт.ст. и коронарного потока 650-850 мл/мин.
- Выполняйте анализ газов артериальной крови каждые 15 минут, чтобы убедиться, что экстракция лактата миокардом эффективна. Если венозный лактат выше артериального лактата, то увеличивают среднее аортальное давление до 80 мм рт.ст., уменьшая поддерживающий раствор, и проверяют концентрацию лактата через 15 мин. Если клиренс артериовенозного лактата все же нарушен, то увеличьте коронарный поток до >850 мл и проверьте концентрацию лактата через 15 мин.
6. Процедура режима работы
ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективный артериовенозный клиренс лактата обычно достигается в течение 30 мин после начала перфузии Лангендорфа. Рабочий режим затем может быть инициирован путем подключения канюли предварительной нагрузки к резервуару предварительной нагрузки (эта линия ранее была зажата во время режима Лангендорфа). Аналогично линия послегрузки соединена с линией аорты (рисунок 2). Установите датчик потока на линии послегрузки для измерения сердечного выброса.
- Откройте линию предварительной загрузки и отрегулируйте расход насоса, чтобы обеспечить стабильное заполнение резервуара предварительной нагрузки. В этот период левое предсердие и левый желудочек постепенно наполняются кровью.
- Откройте линию аортальной догрузки и зажмите основную линию цепи, используемой для перфузии Лангендорфа. Резервуар послегрузки постепенно заполняется. Обеспечьте дренаж резервуара линией перелива, которая возвращает перфусат обратно в основной резервуар контура.
- Начинают инфузию добутамина со скоростью 0,04 мг/мин.
- Выполните анализ образцов газов артериальной и венозной крови, чтобы убедиться, что экстракция лактата миокарда по-прежнему эффективна.
- Как только сердечный выброс стабилен, выполните инвазивную гемодинамическую оценку вместе с эпикардиальными ультразвуковыми измерениями.
7. Оценка контура давления-объема (PV) методом проводимости
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы калибровки должны выполняться в рабочем режиме.
- Установка фотоэлектрического катетера в левый желудочек
- Очистите катетер проводимости косички 7 Fr физиологическим раствором и подключите его к аппаратному интерфейсу.
- Осторожно протолкните катетер в интродуктор 8 Fr оболочку, предварительно вставленную через крышу левого предсердия, чтобы она была выровнена с митральным клапаном.
- Как только катетер пересечет митральный клапан, отрегулируйте соответствующее положение, учитывая оптимальное давление и объемные сигналы. Если шума слишком много, осторожно переместите катетер проводимости, чтобы улучшить качество петель.
- Калибровка катетера с фотоэлектрическим контуром
- Калибровка давления
- Как только катетер проводимости будет соответствующим образом расположен в левом желудочке, откройте интерфейс калибровки на программном обеспечении и откалибруйте значение давления с помощью программного обеспечения для сбора данных для измерения проводимости.
- Начните запись, выберите давление 0 мм рт.ст. и 100 мм рт.ст. на интерфейсе управления и записывайте в течение 5 с каждый.
- Затем остановите запись и откройте интерфейс калибровки давления. Сопоставьте соответствующий сигнал с уровнем давления.
- После калибровки убедитесь, что сигнал соответствует значениям, полученным при инвазивном мониторинге артериального давления.
- Калибровка объема
- Калибровка проводимости
- Откройте интерфейс управления в программном обеспечении для измерения проводимости.
- Начните запись, один за другим выберите объемы, предложенные интерфейсом калибровки.
- Позвольте интерфейсу записывать в течение 5 с каждый, затем остановите запись.
- Используйте полученные данные-трассировку и откройте интерфейс калибровки объема.
- Сопоставьте соответствующую трассировку с уровнем давления.
- Параллельная калибровка объема
- Окружающая сердечная ткань проводит электричество и способствует общему объемному сигналу. Удалите этот параллельный объем для точного измерения объема (калибровка после обработки).
- Чтобы оценить параллельный объем в этой установке (стенка миокарда), введите 10 куб. см гипертонического физиологического раствора (4%) в линию левого предсердия один раз.
- Не повторяйте операцию во избежание гипернатриемии.
- Калибровка поправочного коэффициента поля
- Введите значение объема штриха, полученное в результате ультразвуковых измерений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент альфа будет рассчитываться с учетом соотношения ударных объемов, полученных либо ультразвуковыми измерениями, либо катетеризацией проводимости.
- Сбор фотоэлектрических данных
- Остановите эпикардиальную стимуляцию сердца, чтобы избежать помех сигналу проводимости. Запись данных в установившемся состоянии при стабилизации сигнала (рисунок 3)
- Выберите серию из 10 последовательных циклов и откройте программное обеспечение для анализа. Программное обеспечение автоматически обеспечит работу с инсультом, предварительно рекрутируемую работу инсульта, максимальную dP / dt, минимальную dP / dt и тау-индекс.
- Чтобы получить отношение конечное систолическое давление-объем и отношение конец-диастолическое давление-объем, запишите сигнал во время окклюзии преднагрузки. Постепенно зажимайте линию перфузии предсердий до тех пор, пока не будет эффективным снижение преднатяга (рисунок 4). Затем медленно отпустите зажим.
8. Эпикардиальная эхокардиографическая оценка сердца в рабочем состоянии
- Приобретение ультразвуковых петель
- Поместите три эпикардиальных электрода ЭКГ, подключенных к аппарату эхокардиограммы.
- Нанесите стерильную драпировку вокруг сердца и используйте зонд чреспищевода.
- Приложите зонд к верхней стенке левого предсердия и вручную вращайте преобразователь до получения четырехкамерного вида (рисунок 5).
- Запустите программное обеспечение эхокардиографического сбора для оценки работоспособности миокарда в режиме X-plan.
- Затем запустите двигатель ультразвукового зонда для получения трех- и двухкамерных видов. Анализ этих видов позволяет измерить фракцию выброса левого желудочка и глобальную продольную деформацию9.
- Оценка индекса работы миокарда (MWI)
- Приступайте к приобретению четырех-, трех- и двухкамерных видов и регистрируйте одновременное артериальное давление (рисунок 6).
- Оцените глобальную продольную деформацию, используя эти представления и открытое программное обеспечение MWI. Используйте инвазивное артериальное давление, обнаруженное внешним датчиком на перфузионном контуре во время захвата петли.
- Вручную уведомлять программное обеспечение о точном времени открытия и закрытия аортального и митрального клапанов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение MWI автоматически обеспечит глобальный MWI, конструктивную работу, напрасную работу и эффективную работу.