Method Article

Одновременная визуализация и обнаружение на основе проточной цитометрии множественных флуоресцентных маркеров старения в терапевтических стареющих раковых клетках, вызванных терапией

DOI:

10.3791/63973

⸱

July 12th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Johannes Kepler University Linz, 2Charité - University Medicine Berlin, 3Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем метод визуализации и количественной оценки множественных маркеров, связанных со старением, в отдельных клетках.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Химиотерапевтические препараты могут вызывать непоправимое повреждение ДНК в раковых клетках, что приводит к апоптозу или преждевременному старению. В отличие от апоптотической гибели клеток, старение является принципиально иным механизмом, сдерживающим размножение раковых клеток. Десятилетия научных исследований выявили сложные патологические эффекты стареющих раковых клеток в опухолях и микросредах, которые модулируют раковые клетки и стромальные клетки. Новые данные свидетельствуют о том, что старение является мощным прогностическим фактором во время лечения рака, и поэтому быстрое и точное обнаружение стареющих клеток в образцах рака имеет важное значение. В данной работе представлен метод визуализации и выявления вызванного терапией старения (ТИ) в раковых клетках. Диффузные крупные В-клеточные линии лимфомы (DLBCL) обрабатывали мафосфамидом (MAF) или даунорубицином (DN) и исследовали на наличие маркера старения, связанного со старением β-галактозидазы (SA-β-gal), маркера синтеза ДНК 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) и маркера повреждения ДНК gamma-H2AX (γH2AX). Визуализация проточного цитометра может помочь генерировать одноклеточные изображения с высоким разрешением за короткий период времени для одновременной визуализации и количественной оценки трех маркеров в раковых клетках.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Различные стимулы могут вызвать клеточное старение, заставляя клетки входить в состояние остановки стабильного клеточного цикла. Эти стимулы включают внутренние сигнальные изменения или внешние стрессы. Внутренние сигналы включают прогрессирующее укорочение теломер, изменения в структуре теломер, эпигенетическую модификацию, нарушения протеостаза, митохондриальную дисфункцию и активацию онкогенов. Внешние стрессы включают воспалительные сигналы и /или повреждения тканей, радиационную или химическую обработку и лишение питания 1,2,3,4. Среди....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Клеточные линии DLBCL с лечением мафосфамидом или даунорубицином для индуцирования клеточного старения

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол также работает для адгезивных раковых клеток. В зависимости от размера клетки, семена 1-2 × 105 клеток в одну лунку из 6-луночной пластины и инкубируют пластину в инкубаторе 5% CO2, 37 °C в течение ночи перед обработкой. Этапы протокола такие же, как и для суспензионных ячеек, но с двумя исключениями. Во-первых, клетки должны быть трипсинизированы с пластины после шага 3.4. Во-вторых, этапы промывки выполняются без центрифугирования перед трипсинизацией.

  1. Подсчитайте D....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Компенсационная матрица была сгенерирована с использованием программного обеспечения для анализа изображений путем загрузки записанных данных одноцветных контрольных образцов. Как показано на дополнительном рисунке S1, при значении коэффициента перекрестных помех 0,248 был обнаружен непренебреживаемый (значение коэффициента ≥ 0,1) световой поток отЭдУ до С12ФДГ, в то время как перекрестные помехи между другими каналами не были значительными. Четыре различные клеточные линии DLBCL обрабатывали .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод исследовал способность к проникновению в старение четырех различных клеточных линий DLBCL при химиотерапии с визуализацией яркого поля и количественной оценкой на основе проточной цитометрии. На одноклеточном уровне мы успешно обнаружили основные C12FDG + EdU-Ki67 + стареющие популяции в обработанных клетках KARPAS422 и WSU-DLCL2 и в меньшей степени в клетках OCI-LY1, в то время как клеточная линия SU-DHL6 была устойчива к лечению. Разница в способности к проникновен.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Юн Ю от Университета Иоганна Кеплера в Линце (BERM16108001).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 647 анти-H2A.X Фосфо (Ser139) АнтителоBiolegend613407
Моноклональное антитело мыши против Ki-67 (Alexa Fluor 647)Biolegend350509
C12FDG (5-додеканоиламинофлуоресцеин Di-β-D-галактопиранозид)11590276Fisher
Scientific Хлорохин-дифосфатSigma aldrichC6628
Очищающее средство (Coulter Clenz)Beckman Coulter8546929
Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Kit ThermoScientificC10418
DaunorubicinMedchemexpressHY-13062A
Debubbler (70% изопропанола)Millipore1.3704
Программное обеспечение для анализа изображений (Amnis  ИДЕИ  6.3)LuminexCN-SW69-12
Программное обеспечение для приборов и визуализации (Amnis  ImageStreamX  Система проточного цитометра Mk II и программное обеспечение INSPIRE)Luminex100220
KARPASDSMZACC 31
мафосфамид циклогексиламинNiomechD-17272
OCI-LY1DSMZACC 722
параформальдегидFisher Scientific11473704
PETG (2-фенилэтил-&бета;-D-тиогалактозид) Sigma aldrichP4902
сапонинSigma aldrich47036
ОболочкаMilliporeBSS-1006-B
SpeedBead Kit дляLuminex400041
(0,4-0,7% гипохлорита)VWRJT9416-1
SU-DHL6DSMZACC 572
WSU-DLCL2ДСМЗАСС 575
Научный стерилизатора ImageStream

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  2. Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119),....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Imaging Flow CytometrySenescence MarkersTherapy Induced SenescenceFluorescent Marker DetectionDLBCL Cell LinesGamma H2AX DetectionEdU IncorporationC12 FDG StainingSingle Cell ImagingNuclear Foci Quantification

Related Articles