Методическая статья

Изготовление и характеристика наноматрики на основе Януса слой за слоем для содействия регенерации хряща

DOI:

10.3791/63984

⸱

6 июля 2022 г.

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает сборку послойного наноматричного каркаса основания Janus (JBNm) путем последовательного добавления базовых нанотрубок Janus (JBNts), матрилина-3 и трансформирующего фактора роста Beta-1 (TGF-β1). JBNm был сфабрикован и охарактеризован; кроме того, он демонстрировал отличную биологическую активность, стимулируя функции клеток, такие как адгезия, пролиферация и дифференцировка.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Были разработаны различные каркасы биоматериала для управления клеточной адгезией и пролиферацией в надежде способствовать выполнению конкретных функций для использования in vitro и in vivo . Добавление факторов роста в эти каркасы биоматериала обычно делается для обеспечения оптимальной среды клеточной культуры, опосредующей дифференцировку клеток и ее последующие функции. Тем не менее, факторы роста в обычном каркасе биоматериала обычно предназначены для высвобождения при имплантации, что может привести к непреднамеренным побочным эффектам на окружающие ткани или клетки. Здесь основанная на ДНК наноматрица Януса (JBNm) успешно достигла высоко локализованного микроокружения с послойной структурой для самоустойчивых конструкций хрящевой ткани. JBNms самособираются из базовых нанотрубок Janus (JBNts), матрилина-3 и трансформирующего фактора роста бета-1 (TGF-β1) посредством биоаффина. JBNm был собран в соотношении TGF-β1:матрилин-3:JBNt 1:4:10, поскольку это было определенное соотношение, при котором могла происходить правильная сборка в послойную структуру. Сначала к раствору матрилина-3 добавляли раствор TGF-β1. Затем эту смесь несколько раз пипетировали для обеспечения достаточной однородности перед добавлением раствора JBNt. Это образовало слой за слоем JBNm, после повторной пипетки несколько раз. Были проведены различные эксперименты, чтобы охарактеризовать послойную структуру JBNm, только JBNts, только матрилин-3 и только TGF-β1. Образование JBNm изучали с помощью спектров поглощения UV-Vis, а структуру JBNm наблюдали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ). Поскольку инновационный каркас JBNm, находящийся послойно, формируется в молекулярном масштабе, можно наблюдать флуоресцентный краситель, меченый JBNm. TGF-β1 ограничен внутренним слоем инъекционного JBNm, который может предотвратить высвобождение факторов роста в окружающие области, способствовать локализованному хондрогенезу и способствовать антигипертрофному микроокружению.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Каркасы в тканевой инженерии играют жизненно важную роль в обеспечении структурной поддержки прикрепления клеток и последующего развития тканей1. Как правило, обычные тканевые конструкции без каких-либо строительных лесов полагаются на среду клеточной культуры и добавляют факторы роста для опосредования дифференцировки клеток. Кроме того, это добавление биологически активных молекул в каркасы часто является предпочтительным подходом в руководстве дифференцировкой клеток и функцией 2,3. Некоторые каркасы могут имитировать биохимическое микроокружение нативных тканей независимо друг от друга, в то время как другие могут напрямую влиять на функции клеток через факторы роста. Тем не менее, исследователи часто сталкиваются с проблемами при выборе каркасов, которые могут положительно повлиять на адгезию, рост и дифференцировку клеток, обеспечивая при этом оптимальную структурную поддержку и стабильность в течение длительного периода 4,5. Биологически активные молекулы часто слабо связаны с каркасом, что приводит к быстрому высвобождению этих белков при имплантации, что приводит к их высвобождению в нежелательных местах. Это приводит к побочным эффектам на ткани или клетки, которые не были преднамеренно нацелены 6,7.

Строительные леса обычно изготавливаются из полимерных материалов. Наноматрица основания Януса (JBNm) представляет собой биомиметическую каркасную платформу, созданную с помощью нового послойного метода для самоустойчивой конструкции хрящевой ткани8. Эти новые нанотрубки, вдохновленные ДНК, были названы базовыми нанотрубками Януса (JBNts), поскольку они должным образом имитируют структуру и химию поверхности коллагена, обнаруженного во внеклеточном матриксе (ECM). С добавлением биологически активных молекул, таких как матрилин-3 и трансформирующий фактор роста бета-1 (TGF-β1), JBNm может создать оптимальное микросреднее окружение, которое затем может стимулировать желаемую функциональность клеток и тканей9.

JBNts представляют собой новые нанотрубки, полученные из синтетических версий нуклеооснового аденина и тимина. JBNts формируются путем самосборки10; шесть синтетических нуклеотидов связываются, образуя кольцо, и эти кольца подвергаются π-π укладочным взаимодействиям для создания нанотрубки длиной 200-300 мкм11. Эти нанотрубки структурно похожи на коллагеновые белки; Имитируя аспект микроокружения нативного хряща, JBNts, как было показано, обеспечивает благоприятный участок прикрепления для хондроцитов и мезенхимальных стволовых клеток человека (hMSCs)11,12,13,14. Поскольку нанотрубки подвергаются самосборке и не требуют какого-либо инициатора (например, ультрафиолетового света), они демонстрируют захватывающий потенциал в качестве инъекционного каркаса для труднодоступных областей дефектов15.

Матрилин-3 представляет собой структурный белок внеклеточного матрикса, содержащийся в хряще. Этот белок играет значительную роль в хондрогенезе и правильной функции хряща16,17. В последнее время он был включен в каркас биоматериала, способствуя хондрогенезу без гипертрофии 9,18,19. Включая этот белок в JBNm, хрящевые клетки притягиваются к каркасу, который содержит компоненты, аналогичные компонентам его нативной микросреды. Кроме того, было показано, что матрилин-3 необходим для правильной передачи сигналов TGF-β1 в хондроцитах20. Факторы роста функционируют как сигнальные молекулы, вызывая специфический рост определенной клетки или ткани. Таким образом, для достижения оптимальной регенерации хряща матрилин-3 и TGF-β1 являются важными компонентами в JBNm. Добавление TGF-β1 в каркас слой за слоем может дополнительно способствовать регенерации хряща в тканевой конструкции. TGF-β1 является фактором роста, используемым для стимулирования процесса заживления остеохондральных дефектов, стимулируя пролиферацию и дифференцировку хондроцитов и hMSC21,22. Таким образом, TGF-β1 играет ключевую роль в регенерации хряща JBNm (J / T / M JBNm) 23, способствуя правильному росту, особенно когда он локализован в слоях JBNm.

Как упоминалось ранее, факторы роста обычно собираются на внешней стороне лесов без каких-либо конкретных методов включения. Здесь, с точно спроектированной наноархитектурой биоматериалов, JBNm был разработан для специфического нацеливания на предполагаемые клетки и ткани. JBNm состоит из TGF-β1, приклеенного к поверхностям JBNt во внутреннем слое, и матрилина-3, приклеенного к поверхностям JBNt во внешнем слое24,25. Включение TGF-β1 во внутренний слой послойной структуры позволяет создать высоко локализованное микросреду вдоль волокон JBNm, создавая гомеостатическую тканевую конструкцию с гораздо более медленным высвобождением белка12. Инъекционная способность JBNm делает его идеальной конструкцией хрящевой ткани для различных будущих применений биоматериала26.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Синтез JBNts

  1. Получают мономер JBNt с использованием ранее опубликованных способов, включающих синтез различных соединений12.
  2. Очищают сырой мономер JBNt после того, как он был синтезирован с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием колонны обратной фазы. Используйте растворитель А: 100% вода, растворитель В: 100% ацетонитрил и растворитель С: HCl водный раствор с рН = 1. Используйте расход 3 мл/мин. Собирают наибольший пик, полученный в ВЭЖХ за 7,2 мин.

2. Изготовление для JBNt/Matn1/TGF-β1 (Видео 1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Видео 1 показывает, что JBNm представляет собой инъекционное твердое вещество, образованное в физиологической среде (водный раствор, без ультрафиолетового излучения, без химических добавок и без нагревания), которое также биологически вдохновлено.

  1. Добавьте 8 мкл 1 мг/мл TGF-β1, суспендированного вH2O, до 32 мкл 1 мг/мл матрилина-3, суспендированного вH2O. Pipette для обеспечения правильного перемешивания этих белков.
  2. Добавьте 80 мкл 1 мг/мл JBNts, суспендированных вH2O, в раствор TGF-β1/матрилин-3. Пипетка многократно для обеспечения правильного смешивания. Наличие белых флоккул можно наблюдать сразу после добавления JBNts, что указывает на образование JBNm (Видео 1).

3. Наблюдение за образцами с ультрафиолетовым (UV-Vis) поглощением

ПРИМЕЧАНИЕ: Спектры поглощения UV-Vis были изучены для характеристики сборки JBNm. Это измерение было проанализировано для четырех категорий: только JBNts, только матрилин-3, только TGF-β1 и полный слой за слоем JBNm, состоящий из всех трех частей. Все исходные концентрации суспендированы вН2O.

  1. Для группы JBNt добавляют 5 мкл 1 мг/мл JBNts к 50 мклH2O, чтобы получить раствор 90,9 мкг/мл.
  2. Для группы матрилина-3 добавляют 40 мкл из 10 мкг/мл матрилина-3 до 15 мклH2O, чтобы получить раствор 7,3 мкг/мл.
  3. Для группы TGF-β1 добавляют 10 мкл из 10 мкг/мл TGF-β1 в 45 мклH2O, чтобы получить раствор 1,8 мкг/мл.
  4. Для группы JBNm добавляют 40 мкл от 10 мкг/мл матрилина-3 до 10 мкл 10 мкг/мл TGF-β1. Перемешивают для обеспечения правильного перемешивания, а затем добавляют 5 мкл 1 мг/мл JBNts в раствор, повторно пипетируя для смешивания образца.
  5. С помощью спектрофотометра измерьте спектр поглощения каждой группы.

4. Измерение зета-потенциала образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Дзета-потенциал был проанализирован, чтобы лучше предсказать, как JBNm будет взаимодействовать с тканью in vivo . Были измерены три группы: матрилин-3 в одиночку, матрилин-3 с TGF-β1 и полный слой за слоем JBNm.

  1. Для группы матрилина-3 добавляют 160 мкл 10 мг/мл матрилина-3 до 640 мклH2O, чтобы получить раствор 800 мкл.
  2. Для соединения матрилин-3/TGF-β1 добавляют 160 мкл матрилина-3 до 40 мкг/мл 10 мкг/мл TGF-β1. Пипетка многократно для обеспечения должной однородности. Затем добавляют его к 600 мклH2O, в результате чего получается раствор 800 мкл.
  3. Для группы JBNm добавьте 160 мкл из 10 мкг/мл матрилина-3 в 40 мкл 10 мкг/мл TGF-β1. Пипетка несколько раз для смешивания белков. Затем добавьте 20 мкл 1 мг/мл JBNts к раствору и пипетке для обеспечения однородности. Наконец, добавляют раствор JBNm к 580 мклH2Oдля получения раствора 800 мкл.
  4. Измерьте значения дзета-потенциала для трех групп.

5. Подготовка наноматрики JBNt/matrilin-3 для просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Характеристика ТЕА выполняется для характеристики морфологии JBNts и JBNm.

  1. Вставьте две сетки в плазменный очиститель для правильной очистки сеток перед отрицательным окрашиванием JBNts и JBNm в соответствии с опубликованными протоколами и протоколамипроизводителя 12.
  2. Создают раствор JBNt 200 мкг/мл, смешивая 10 мкл 1 мг/мл JBNts с 40 мкл дистиллированной воды.
  3. Смешайте 30 мкл 100 мкг/мл матрилина-3 с 20 мкл 100 мкг/мл TGF-β1 и пипетку несколько раз. Добавьте 10 мкл 1 мг/мл JBNts в смесь матрилин-3/TGF-β1 для приготовления образца JBNm. Опять же, пипетка неоднократно.
  4. Добавить 3 мкл раствора JBNt (200 мкг/мл) и 3 мкл раствора JBNm на отдельные сетки и оставить их на 2 мин.
  5. Каждую сетку промыть 100 мкл раствора уранилацетата (0,5%). Используйте фильтровальную бумагу, чтобы удалить лишний раствор и дать сеткам высохнуть на воздухе.
  6. Используйте просвечивающий электронный микроскоп для правильного наблюдения и характеристики образцов, как опубликовано ранее11,12.

6. Измерение спектров поглощения флуоресцентно меченых белков

ПРИМЕЧАНИЕ: Структура JBNm проверяется путем наблюдения за структурами JBNm с помощью абсорбционного спектрального анализа.

  1. Маркируйте TGF-β1 с помощью набора для маркировки белка в соответствии с инструкциями производителя. Добавьте 20 мкл 20 мкг/мл с маркировкой TGF-β1 до 25 мклH2O, чтобы получить тестовый раствор 8,9 мкг/мл.
  2. Маркируйте матрилин-3 с помощью отдельного набора этикетирования. Добавьте 20 мкл 80 мкг/мл меченого матрилина-3 до 25 мклH2O, чтобы получить тестовый раствор 36 мкг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка флуоресцентным красителем TGF-β1 привела к конечной концентрации 20 мкг/мл, в то время как маркировка матрилина-3 привела к конечной концентрации 80 мкг/мл.
  3. Смешайте 20 мкл 80 мкг/мл меченого матрилина-3 с 20 мкл 20 мкг/мл, меченым TGF-β1, и 5 мклH2O, в результате чего получится меченое соединение TGF-β1/матрилин-3. Пипетку смесь несколько раз перемешать.
  4. Добавьте 5 мкл 1 мг/мл JBNts к 40 мклH2O, в результате чего получится раствор 111 мкг/мл.
  5. Добавьте 20 мкл 20 мкг/мл с маркировкой TGF-β1 до 20 мкл 80 мкг/мл с маркировкой матрилин-3 и пипетку несколько раз. Добавьте 5 мкл 1 мг/мл JBNts к меченому раствору TGF-β1/матрилин-3 и пипетку многократно, чтобы правильно перемешать соединение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечные концентрации образцов JBNt, помеченных TGF-β1, и матрилина-3, составляли соответственно 111 мкг/мл, 8,9 мкг/мл и 36 мкг/мл.
  6. Перенесите каждую группу образцов (т.е. меченую TGF-β1 (стадия 6.1), меченую матрилин-3 (стадия 6.2), меченую TGF-β1/матрилин-3 (стадия 6.3), JBNts (стадия 6.4), JBNm (стадия 6.5)) в свой собственный колодец из черной 384-луночной пластины.
  7. Загрузите черную 384-луночную пластину в многорежимный считыватель микропластин и выполните измерения на длинах волн возбуждения 488 нм и 555 нм в соответствии с протоколом производителя.

7. Анализ биологической функции in vitro

  1. Испытание на адгезию ячеек на камерах с предварительным покрытием
    1. Подготовьте два камерных покровных стекла с пятью группами образцов, так как для каждого типа клеток используется одно покровное стекло.
    2. Добавьте 1,25 мкл 1 мг/мл JBNts к 198,75 мкл дистиллированной воды, в результате чего получится раствор 6,25 мкг/мл.
    3. Добавьте 10 мкл матрилина-3 до 190 мкл дистиллированной воды, в результате чего получится растворение 0,5 мкг/мл.
    4. Добавьте 2,5 мкл 10 мкг/мл TGF-β1 к 197,5 мкг/мЛоф дистиллированной воды, в результате чего получится растворение 0,125 мкг/мл.
    5. Для группы JBNm добавьте 10 мкл с 10 мкг/мл матрилина-3 до 2,5 мкл 10 мкг/mLTGF-β1 и пипетку повторно. Добавьте 1,25 мкл JBNts с концентрацией 1 мг/мл к раствору смеси и пипетке. Наконец, добавьте 186,25 мкл дистиллированной воды, чтобы получить раствор JBNm 200 мкл.
      1. Для контрольной группы используйте 200 мкл дистиллированной воды.
    6. Добавьте каждую группу образцов в свой собственный колодец из камерного покровного стекла No 1,5. Поместите покровное стекло в морозильную камеру с температурой -80 °C на 1 ч, а затем высушите его сублиматором с помощью инструмента лиофилизатора.
    7. Посейте мезенхимальные стволовые клетки человека (hMSCs) и клетки хондроцитов человека (10 000 клеток на лунку) в каждую лунку подготовленных камерных покровных стекол.
    8. Инкубируйте две защитные очки в течение 4 ч в инкубаторе при температуре 37 °C. Затем аспирируйте питательную среду клеток и дважды промойте PBS.
    9. Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом в течение 5 мин, а затем удалите и промойте образцы PBS. Промыть образец во второй раз, чтобы полностью удалить 4% параформальдегида.
    10. Инкубировать клетки со 100 мкл 0,1% Тритона-Х в течение 10 мин и промыть PBS. Добавьте 100 мкл 0,165 мкМ родамина-фаллоидина в каждую лунку. Подождите 30 минут, а затем снова помойте PBS.
    11. Добавьте 0,1 мкг/мл DAPI к каждой лунке, чтобы окрасить ядра. Подождите 5 минут и дважды промойте колодцы PBS.
    12. Используйте спектральный конфокальный микроскоп для наблюдения за морфологией клеток и захвата флуоресцентных изображений.
    13. Затем проанализируйте количество клеток и морфологию с помощью программного обеспечения для обработки изображений. Откройте программное обеспечение и загрузите изображения. Добавьте шкалу и откалибруйте программное обеспечение. Подсчитайте количество ячеек в заданной области для каждого образца. Затем используйте измерительный инструмент для сбора данных о морфологии клеток для каждого образца.
  2. Пролиферация клеток
    1. Подготовьте три необработанные 96-луночные пластины, добавив к каждой по пять групп образцов.
      1. Для группы JBNt добавьте 3,75 мкл 1 мг/мл JBNts к 596,25 мкл дистиллированной воды, в результате чего получится раствор JBNt объемом 600 мкл с концентрацией 6,25 мкг/мл.
      2. Для группы TGF-β1 добавляют 7,5 мкл с 10 мкг/мл TGF-β1 до 592,5 мкл дистиллированной воды, в результате чего получается тестовый раствор 0,125 мкг/мл.
      3. Для группы матрилина-3 добавляют 30 мкл с 10 мкг/мл матрилина-3 до 570 мкл дистиллированной воды, в результате чего получается тестовый раствор 0,5 мкг/мл.
      4. Для группы JBNm смешайте 7,5 мкл 10 мкг/мл TGF-β1 с 30 мкл 10 мкг/мл матрилина-3 и пипетки несколько раз, а затем добавляйте в раствор 3,75 мкл 1 мг/мл JBNts.
      5. Разбавляют раствор JBNm 558,75 мкл дистиллированной воды для получения конечных концентраций 6,25 мкг/мл, 0,125 мкг/мл и 0,5 мкг/мл, соответственно, для образцов JBNt, TGF-β1 и матрилина-3.
      6. Для контрольной группы используют 600 мкл дистиллированной воды.
    2. Разделите каждую группу образцов на шесть скважин (100 мкл пробы на скважину).
    3. Поместите три пластины, содержащие все образцы, в морозильную камеру при температуре -80 °C в течение 1 часа, а затем высушите лиофилизирующим инструментом.
    4. Посейте гМСК на эти пластины, каждая из которых получает 100 мкл клеточной суспензии (на лунку), содержащую 5000 клеток. Инкубируйте три пластины при 37 °C в течение 1 дня, 3 дней или 5 дней при 5% CO2.
    5. Добавляют 10 мкл раствора CCK-8 в каждую лунку с клетками и инкубируют при 37 °C еще 2 ч.
    6. Измерьте значения поглощения каждой скважины с помощью многомодовых микропластинчатых считывателей при 450 нм.
    7. Посейте известный градиент гМСК на 96-луночную пластину и инкубируйте в течение 4 ч. Используйте анализ CCK-8 для измерения значений поглощения известного числа ячеек и создания стандартной кривой.
    8. Рассчитайте пролиферацию клеток, используя стандартную кривую поглощения.
  3. Тест на стабильность
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения процентного высвобождения TGF-β1 из JBNm в гидрогеле агарозы использовался человеческий целевой набор TGF-β1.
    1. Приготовьте 2% агарозы, добавив 400 мг порошка агарозы к 20 мл PBS и нагревая его до 100 °C для полного растворения порошка агарозы.
    2. Приготовьте JBNm внутри охлажденного 2% агарозного гидрогеля.
      1. Смешайте 10 мкл 10 мкг/мл TGF-β1, 40 мкл 10 мкг/мл матрилина-3, 5 мкл 1 мг/мл JBNts и 195 мкл PBS. Смешайте этот раствор с 250 мкл 2% агарозы, создав гидрогель JBNm.
    3. Добавьте 500 мкл PBS, используя его в качестве релизного раствора, и убедитесь, что вы меняете его каждые 3 дня. Сохраните каждый выпущенный раствор и оставьте образец на 15 дней.
    4. Используйте комплект ИФА для тестирования каждого из захваченных решений, следуя инструкциям производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вычитая количество TGF-β1, высвобождаемого в PBS, из теоретического значения нагрузки 100%, можно определить оставшееся количество TGF-β1.
  4. Анализ дифференцировки клеток с помощью ПЦР26.
    1. Подготовьте семь групп образцов с каждым образцом, содержащим 20 мкл клеточной суспензии (4 х 104 клетки), 30 мкл конкретного раствора (или PBS, в зависимости от группы образцов) и 50 мкл 2 мас.% агарозы.
      1. Для группы TGF-β1 добавляют 5 мкл от 10 мкг/мл TGF-β1 до 25 мкл PBS, в результате чего получается раствор 1,6 мкг/мл.
      2. Для группы матрилина-3 добавляют 20 мкл с 10 мкг/мл матрилина-3 до 10 мкл PBS, в результате чего получается раствор 6,7 мкг/мл.
      3. Для группы JBNt добавьте 2,5 мкл 1 мг/мл JBNts к 27,5 мкл PBS, в результате чего получится раствор 83,3 мкг/мл.
      4. Для группы J/T/M JBNm добавляют 10 мкл матрилина-3-5 мкг/мл TGF-β1 и пипетку вверх и вниз для смешивания раствора. Затем добавьте 2,5 мкл 1 мг/мл JBNts и пипетку снова. Наконец, разбавить 2,5 мкл PBS.
      5. Для каждой контрольной группы используйте 30 мкл PBS в качестве образца.
    2. Добавляйте 0,5 мл клеточной культуральной среды в каждую лунку, обязательно заменяя ее каждые 3 дня.
      1. Для положительной контрольной группы используют коммерчески доступную хондрогенную среду hMSC, содержащую добавленный TGF-β1. Этот дополнительный TGF-β1 равен количеству как в TGF-β1, так и в J/T/M JBNm группах.
      2. Для одной из отрицательных контрольных групп используют коммерческую хондрогенную среду hMSC, которая не содержит TGF-β1. Для другой отрицательной контрольной группы используйте среду для культивирования клеток DMEM, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
      3. Для каждой второй группы используйте коммерческую хондрогенную среду для культивирования клеток hMSC без TGF-β1.
    3. Культивируйте образцы в течение 15 дней.
    4. Извлеките РНК образцов и выполните ПЦР для изучения дифференцировки образцов, как описано ранее26.
  5. Иммуноокрашивание для анализа экспрессии коллагена типа X
    1. Подготовьте семь образцов на основе агарозы таким же образом, как дифференцировку клеток с помощью раздела метода ПЦР (этап 7.4).
    2. Культивируйте образцы в течение 15 дней.
    3. Зафиксируйте образцы с 4% формальдегидом в течение 1 дня, замочите в 30% растворе сахарозы на ночь, а затем заморозьте на ночь при -80 °C жидким азотом. Зафиксируйте образцы с помощью реагента с оптимальной температурой резания (OCT), смеси водорастворимых гликолей и смол, при -10 °C.
    4. Управляйте микротомом криостата для получения замороженных участков каждого образца толщиной 20 мкм.
    5. Окрашивают каждую секцию антителом Anti-Collagen X с разбавлением 1:800 и флуоресцентным маркировкой вторичным антителом, разбавленным PBS, в соответствии с протоколами производителя.
    6. Наблюдайте за каждым участком с помощью конфокального микроскопа, используя возбуждение 488 нм и увеличение в 40 раз на окуляре.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следуя протоколу, JBNt были успешно синтезированы и охарактеризованы поглощением UV-Vis и TEM. JBNm представляет собой инъекционный твердый каркас, который подвергается быстрому биомиметическому процессу. После того, как JBNts добавляли к смеси раствора TGF-β1/матрилин-3 в физиологической среде, образовывался твердый каркас из белой сетки, указывающий на успешную сборку JBNm, как показано на рисунке 1. Это было продемонстрировано в методах характеризации.

В физиол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью этого исследования является разработка платформы биомиметических каркасов, JBNm, для преодоления ограничений обычных тканевых конструкций, которые полагаются на среду клеточной культуры для опосредования дифференцировки клеток. JBNm представляет собой каркас послойной структуры для самоустойчивой конструкции хрящевой ткани. Инновационный дизайн основан на новых наноматериалах, вдохновленных ДНК, JBNts. JBNm, состоящий из JBNts30, TGF-β1 и матрилина-3, собран с помощью новой послойной техники...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Доктор Юпенг Чен является соучредителем Eascra Biotech, Inc. и NanoDe Therapeutics, Inc.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа поддерживается грантами NIH 7R01AR072027 и 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 и Университетом Коннектикута. Эта работа также частично поддерживается грантом NIH S10OD016435.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10 % сыворотка от нормальной козыThermo Fisher50062ZАгент используется для блокирования неспецифических действий связывания антител во время окрашивания.
24-луночный планшетCorning07-200-74024-луночный планшет используется для сравнительной клеточной культуры.
384-луночная черная необработанная пластинаThermo Fisher262260384-луночная пластина используется для измерений абсорбции.
8-луночный камерный покровный стеклоThermo Fisher155409PK8-луночный покровный стекло используется для сравнительного культивирования клеток.
96-луночный плоскодонныйCorning07-200-9196-луночный планшет используется для сравнительной клеточной культуры.
96-луночный планшет необработанныйThermo Fisher26089596-луночный планшет, используемый для сравнительного культивирования и анализа клеток.
Агарозный гельSigma-AldrichA9539Гидрогель используется для клеточной культуры.
Агарозный гельSigma AldrichA9539Hydrogel используется в качестве среды для культивирования клеток.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit ThermoFisherA30006 (488) и A30007 (555)Флуоресцентный краситель, используемый для мечения белков.
Anti-Collagen X AntibodyThermo Fisher41-9771-82Антитело, используемое для окрашивания коллагена-X.
Bio-Rad PCR EquipmentBio-RadEquipment, используемое для проведения ПЦР на образцах.
C28/I2 Клетки хондроцитарной клеточной линии, используемые для анализа пролиферативных способностей различных образцов.
Набор для подсчета клеток 8Milipore Sigma96992Анализ пролиферации клеток.
Программное обеспечение ИнститутаБроудаиспользуется для анализа изображений клеток.
Оборудование для микротомовCryostat используется для производства тонких сегментов образцов для использования в окрашивании и микроскопии.
DAPIInvitrogenD1306Синий флуоресцентный краситель, который связывается с участками ДНК аденин-тимина.
Одноразовые кюветыFISHER Scientific14-955-128Контейнер для спектрофотометрии.
DMEM Cell Culture Medium ThermoFisher10566032среды, используемые для поддержки клеточного роста.
Фетальная бычья сывороткаGIBCOA4766801сыворотка, используемая в среде для клеточных культур для поддержки роста клеток.
Fluoromount-G Монтажная средаThermo Fisher00-4958-02Раствор, используемый для крепления предметных стекол для иммуноокрашивания.
Соединение формальдегидаиспользуется для фиксации образцов перед микротомингом.
Козий антикроличий IgG (H+L) Высокоадсорбированное вторичное антителоThermo FisherA16110Антитело, используемое для окрашивания белков.
Мезенхимальные стволовые клетки человекаLONZAPT-2501Cells используются для анализа дифференцировочных способностей различных образцов.
Человеческая мезенхимальная стволовая хондрогенная средаLONZAPT-3003Клеточная среда, используемая для стимулирования хондрогенной дифференцировки.
ImageJНациональный институт здравоохраненияПрограммное обеспечение для анализа изображений, используемое в сочетании с микроскопией.
itaq Universal SYBR Green One-Step KitBioRad1725150Kit используется для ПЦР.
Нанотрубки на основе януса (JBNts)Нанотрубки, изготовленные из синтетических нуклеотидных оснований и выступающие в качестве инструмента для создания клеточных каркасов.
LaB6 20-120 кВ Передающий электронный микроскопTecnaiОборудование, используемое для проведения просвечивающей электронной микроскопии образца.
MATLABMathWorksСтатистическое программное обеспечение, используемое для моделирования и анализа данных.
Matrilin-3Fisher Scientific3017MN050Структурный белок, используемый в качестве сайтов адгезии для хондроцитов.
Спектрофотометр NanoDropThermo FisherОборудование, используемое для измерения значений поглощения образца.
Спектральный конфокальный микроскоп Nikon A1RHD25Конфокальный микроскоп используется для анализа образцов.
Номер 1.5 Камерное защитное стеклоThermo Fisher152250Среда для стерильной клеточной культуры и визуализации.
Компаунд для оптимальной температуры резки Реагентныйкомпаунд, используемый для встраивания ячеек перед микротомингом.
ПараформальдегидThermo ScientificAAJ19943K2Соединение, используемое для фиксации клеток.
Плазменный очиститель PDC-32GПлазменныйочиститель Harrick используется для подготовки сеток перед просвечивающей электронной микроскопией.
пенициллин-стрептомицинGIBCO15-140-148Антибиотическое средство, используемое для предотвращения роста бактерий во время культивирования клеток.
Фосфатно-солевой буферныйThermo Fisher10010023используется для промывания клеточной среды и действует как буфер во время экспериментов.
Родамин-фаллоидинИнвитрогенR415F-Актин красный флуоресцентный краситель.
Rneasy Plant Mini KitQIAGEN74904Набор используется для фильтрации и гомогенизации образцов во время экстракции РНК.
сахарозы, используемый для обработки образцов перед микротомингом.
TGF beta-1 Human ELISA KitInvitrogenBMS249-4Набор для определения наличия TGF-β 1 в образце.
TGF-β 1PEPROTECH100-21CФактор роста используется для стимуляции хондрогенной дифференцировки и пролиферации.
Triton-XInvitrogenHFH10Соединение используется для лизирования клеток, не зафиксированных в процессе окрашивания.
Реагент TRIzolThermo Fisher15596026Реагент, используемый для выделения РНК.
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalEquipment, используемый для измерения значений дзета-потенциала образца.
раствор Раствор

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
  2. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  3. Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
  4. Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
  5. Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
  6. James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
  7. Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
  8. Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106(2012).
  9. Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
  10. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  11. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
  12. Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317(2020).
  13. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  14. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  15. Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
  16. Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590(2016).
  17. Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
  18. Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50(2021).
  19. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  20. Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
  21. Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823(2015).
  22. Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
  23. Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
  24. Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
  25. Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676(2016).
  26. Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
  27. Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
  28. Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
  29. Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
  30. Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670(2019).
  31. Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147(2019).
  32. Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
  33. Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
  34. Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
  35. Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
  36. Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
  37. Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
  38. Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
  39. Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3TGF 1

Похожие статьи