Изготовление и характеристика наноматрики на основе Януса слой за слоем для содействия регенерации хряща

Краткое содержание

Этот протокол описывает сборку послойного наноматричного каркаса основания Janus (JBNm) путем последовательного добавления базовых нанотрубок Janus (JBNts), матрилина-3 и трансформирующего фактора роста Beta-1 (TGF-β1). JBNm был сфабрикован и охарактеризован; кроме того, он демонстрировал отличную биологическую активность, стимулируя функции клеток, такие как адгезия, пролиферация и дифференцировка.

Аннотация

Были разработаны различные каркасы биоматериала для управления клеточной адгезией и пролиферацией в надежде способствовать выполнению конкретных функций для использования in vitro и in vivo . Добавление факторов роста в эти каркасы биоматериала обычно делается для обеспечения оптимальной среды клеточной культуры, опосредующей дифференцировку клеток и ее последующие функции. Тем не менее, факторы роста в обычном каркасе биоматериала обычно предназначены для высвобождения при имплантации, что может привести к непреднамеренным побочным эффектам на окружающие ткани или клетки. Здесь основанная на ДНК наноматрица Януса (JBNm) успешно достигла высоко локализованного микроокружения с послойной структурой для самоустойчивых конструкций хрящевой ткани. JBNms самособираются из базовых нанотрубок Janus (JBNts), матрилина-3 и трансформирующего фактора роста бета-1 (TGF-β1) посредством биоаффина. JBNm был собран в соотношении TGF-β1:матрилин-3:JBNt 1:4:10, поскольку это было определенное соотношение, при котором могла происходить правильная сборка в послойную структуру. Сначала к раствору матрилина-3 добавляли раствор TGF-β1. Затем эту смесь несколько раз пипетировали для обеспечения достаточной однородности перед добавлением раствора JBNt. Это образовало слой за слоем JBNm, после повторной пипетки несколько раз. Были проведены различные эксперименты, чтобы охарактеризовать послойную структуру JBNm, только JBNts, только матрилин-3 и только TGF-β1. Образование JBNm изучали с помощью спектров поглощения UV-Vis, а структуру JBNm наблюдали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ). Поскольку инновационный каркас JBNm, находящийся послойно, формируется в молекулярном масштабе, можно наблюдать флуоресцентный краситель, меченый JBNm. TGF-β1 ограничен внутренним слоем инъекционного JBNm, который может предотвратить высвобождение факторов роста в окружающие области, способствовать локализованному хондрогенезу и способствовать антигипертрофному микроокружению.

Введение

Каркасы в тканевой инженерии играют жизненно важную роль в обеспечении структурной поддержки прикрепления клеток и последующего развития тканей¹. Как правило, обычные тканевые конструкции без каких-либо строительных лесов полагаются на среду клеточной культуры и добавляют факторы роста для опосредования дифференцировки клеток. Кроме того, это добавление биологически активных молекул в каркасы часто является предпочтительным подходом в руководстве дифференцировкой клеток и функцией ^2,3. Некоторые каркасы могут имитировать биохимическое микроокружение нативных тканей независимо друг от др....

Протокол

1. Синтез JBNts

1. Получают мономер JBNt с использованием ранее опубликованных способов, включающих синтез различных соединений¹².
2. Очищают сырой мономер JBNt после того, как он был синтезирован с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием колонны обратной фазы. Используйте растворитель А: 100% вода, растворитель В: 100% ацетонитрил и растворитель С: HCl водный раствор с рН = 1. Используйте расход 3 мл/мин. Собирают наибольший пик, полученный в ВЭЖХ за 7,2 мин.

2. Изготовление для JBNt/Matn1/TGF-β1 (Видео 1)

Результаты

Следуя протоколу, JBNt были успешно синтезированы и охарактеризованы поглощением UV-Vis и TEM. JBNm представляет собой инъекционный твердый каркас, который подвергается быстрому биомиметическому процессу. После того, как JBNts добавляли к смеси раствора TGF-β1/матрилин-3 в физиологической среде, образовывался твердый каркас из белой сетки, указывающий на успешную сборку JBNm, как показано на рисунке 1. Это было продемонстрировано в методах характеризации.

В физиол.......

Обсуждение

Целью этого исследования является разработка платформы биомиметических каркасов, JBNm, для преодоления ограничений обычных тканевых конструкций, которые полагаются на среду клеточной культуры для опосредования дифференцировки клеток. JBNm представляет собой каркас послойной структуры для самоустойчивой конструкции хрящевой ткани. Инновационный дизайн основан на новых наноматериалах, вдохновленных ДНК, JBNts. JBNm, состоящий из JBNts³⁰, TGF-β1 и матрилина-3, собран с помощью новой послойной техники.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10 % сыворотка от нормальной козы	Thermo Fisher	50062Z	Агент используется для блокирования неспецифических действий связывания антител во время окрашивания.
24-луночный планшет	Corning	07-200-740	24-луночный планшет используется для сравнительной клеточной культуры.
384-луночная черная необработанная пластина	Thermo Fisher	262260	384-луночная пластина используется для измерений абсорбции.
8-луночный камерный покровный стекло	Thermo Fisher	155409PK	8-луночный покровный стекло используется для сравнительного культивирования клеток.
96-луночный плоскодонный	Corning	07-200-91	96-луночный планшет используется для сравнительной клеточной культуры.
96-луночный планшет необработанный	Thermo Fisher	260895	96-луночный планшет, используемый для сравнительного культивирования и анализа клеток.
Агарозный гель	Sigma-Aldrich	A9539	Гидрогель используется для клеточной культуры.
Агарозный гель	Sigma Aldrich	A9539	Hydrogel используется в качестве среды для культивирования клеток.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit Thermo	Fisher	A30006 (488) и A30007 (555)	Флуоресцентный краситель, используемый для мечения белков.
Anti-Collagen X Antibody	Thermo Fisher	41-9771-82	Антитело, используемое для окрашивания коллагена-X.
Bio-Rad PCR Equipment	Bio-Rad		Equipment, используемое для проведения ПЦР на образцах.
C28/I2 Клетки хондроцитарной клеточной линии			, используемые для анализа пролиферативных способностей различных образцов.
Набор для подсчета клеток 8	Milipore Sigma	96992	Анализ пролиферации клеток.
Программное обеспечение Института		Броуда	используется для анализа изображений клеток.
Оборудование для микротомов			Cryostat используется для производства тонких сегментов образцов для использования в окрашивании и микроскопии.
DAPI	Invitrogen	D1306	Синий флуоресцентный краситель, который связывается с участками ДНК аденин-тимина.
Одноразовые кюветы	FISHER Scientific	14-955-128	Контейнер для спектрофотометрии.
DMEM Cell Culture Medium Thermo	Fisher	10566032	среды, используемые для поддержки клеточного роста.
Фетальная бычья сыворотка	GIBCO	A4766801	сыворотка, используемая в среде для клеточных культур для поддержки роста клеток.
Fluoromount-G Монтажная среда	Thermo Fisher	00-4958-02	Раствор, используемый для крепления предметных стекол для иммуноокрашивания.
Соединение формальдегида			используется для фиксации образцов перед микротомингом.
Козий антикроличий IgG (H+L) Высокоадсорбированное вторичное антитело	Thermo Fisher	A16110	Антитело, используемое для окрашивания белков.
Мезенхимальные стволовые клетки человека	LONZA	PT-2501	Cells используются для анализа дифференцировочных способностей различных образцов.
Человеческая мезенхимальная стволовая хондрогенная среда	LONZA	PT-3003	Клеточная среда, используемая для стимулирования хондрогенной дифференцировки.
ImageJ	Национальный институт здравоохранения		Программное обеспечение для анализа изображений, используемое в сочетании с микроскопией.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	Kit используется для ПЦР.
Нанотрубки на основе януса (JBNts)	Нанотрубки, изготовленные из синтетических нуклеотидных оснований и выступающие в качестве инструмента для создания клеточных каркасов.
LaB6 20-120 кВ Передающий электронный микроскоп	Tecnai		Оборудование, используемое для проведения просвечивающей электронной микроскопии образца.
MATLAB	MathWorks		Статистическое программное обеспечение, используемое для моделирования и анализа данных.
Matrilin-3	Fisher Scientific	3017MN050	Структурный белок, используемый в качестве сайтов адгезии для хондроцитов.
Спектрофотометр NanoDrop	Thermo Fisher		Оборудование, используемое для измерения значений поглощения образца.
Спектральный конфокальный микроскоп Nikon A1R		HD25	Конфокальный микроскоп используется для анализа образцов.
Номер 1.5 Камерное защитное стекло	Thermo Fisher	152250	Среда для стерильной клеточной культуры и визуализации.
Компаунд для оптимальной температуры резки Реагентный			компаунд, используемый для встраивания ячеек перед микротомингом.
Параформальдегид	Thermo Scientific	AAJ19943K2	Соединение, используемое для фиксации клеток.
Плазменный очиститель PDC-32G	Плазменный		очиститель Harrick используется для подготовки сеток перед просвечивающей электронной микроскопией.
пенициллин-стрептомицин	GIBCO	15-140-148	Антибиотическое средство, используемое для предотвращения роста бактерий во время культивирования клеток.
Фосфатно-солевой буферный	Thermo Fisher	10010023	используется для промывания клеточной среды и действует как буфер во время экспериментов.
Родамин-фаллоидин	Инвитроген	R415	F-Актин красный флуоресцентный краситель.
Rneasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904	Набор используется для фильтрации и гомогенизации образцов во время экстракции РНК.
		сахарозы	, используемый для обработки образцов перед микротомингом.
TGF beta-1 Human ELISA Kit	Invitrogen	BMS249-4	Набор для определения наличия TGF-β 1 в образце.
TGF-β 1	PEPROTECH	100-21C	Фактор роста используется для стимуляции хондрогенной дифференцировки и пролиферации.
Triton-X	Invitrogen	HFH10	Соединение используется для лизирования клеток, не зафиксированных в процессе окрашивания.
Реагент TRIzol	Thermo Fisher	15596026	Реагент, используемый для выделения РНК.
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		Equipment, используемый для измерения значений дзета-потенциала образца.

раствор Раствор