Методическая статья

Трехмерное окрашивание цельной почки с помощью CUBIC

4.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63986

⸱

18 июля 2022 г.

 , 
1Division of Nephrology and Endocrinology, The University of Tokyo

В этой статье

Краткое содержание

Настоящий протокол описывает метод очистки тканей и полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание для трехмерной (3D) визуализации почек. Этот метод может предложить макроскопические перспективы в патологии почек, что приводит к новым биологическим открытиям.

Аннотация

Хотя обычная патология предоставляла многочисленные сведения о микроструктуре почек, было трудно узнать точную структуру кровеносных сосудов, проксимальных канальцев, собирающих протоков, клубочков и симпатических нервов в почках из-за отсутствия трехмерной (3D) информации. Оптическая очистка является хорошей стратегией для преодоления этого большого препятствия. Несколько клеток в целом органе могут быть проанализированы с одноклеточным разрешением, сочетая очистку тканей и технику 3D-визуализации. Тем не менее, методы маркировки клеток для визуализации всего органа остаются недостаточно развитыми. В частности, окрашивание целых органов является сложной задачей из-за сложности проникновения антител. Настоящий протокол разработал окрашивание почек мыши для 3D-визуализации с помощью метода очистки тканей CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis). Протокол позволил визуализировать почечную симпатическую денервацию после ишемии-реперфузионного повреждения и гломеруломегалию на ранней стадии диабетической болезни почек с комплексной точки зрения. Таким образом, этот метод может привести к новым открытиям в исследованиях почек, обеспечивая макроскопическую перспективу.

Введение

Почка состоит из различных клеточных популяций. Хотя обычная патология дает нам много информации о микроокружении почек, трехмерная (3D) визуализация необходима для точного понимания межклеточных перекрестных помех во время прогрессирования заболевания почек. В прошлом для 3D-визуализации всего органа1 требовалось выполнить огромное количество серийных секций и реконструкций изображений. Однако этот метод требовал слишком больших усилий и имел проблемы с точки зрения воспроизводимости.

Оптический клиринг является хорошей стратегией для преодоления этого препятствия 2,3. Помутнение тканей в основном связано с рассеянием и поглощением света, потому что каждый орган состоит из различных веществ, включая воду, белок и липиды. Таким образом, основной стратегией очистки тканей является замена воды и липидов в тканях реагентами, соответствующими показателю преломления (RI), которые обладают теми же оптическими свойствами, что и белки4. Для того чтобы наблюдать прозрачный образец, полезна световая листовая флуоресцентная микроскопия5. Световые листы освещают прозрачный образец сбоку, а сигналы возбуждения принимаются через объектив, расположенный в вертикальном положении6. Эта микроскопия получает информацию о поперечном сечении за один развертку, которая отличается от конфокальной или многофотонной флуоресцентной микроскопии. Таким образом, он может быстро получать z-стековые изображения с низким уровнем фотоотбеливания.

Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) является одним из методов очистки тканей, который позволяет визуализировать весь орган с помощью флуоресцентной микроскопиисветового листа 2,7,8. CUBIC и цельное иммунофлуоресцентное окрашивание оптимизированы в настоящем исследовании для визуализации 3D-структур почек мыши 9,10,11. С помощью этого цельно-монтажного метода окрашивания визуализируется изменение почечных симпатических нервов после ишемии-реперфузионного повреждения 9,10 и клубомерулегалии на ранней стадии диабетической болезни почек11, а также кровеносных сосудов, проксимальных канальцев и собирающих протоков во всей почке9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты были одобрены Советом по институциональному обзору Токийского университета. Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения. Для настоящего исследования использовались самцы мышей C57BL/6NJcl в возрасте 8 недель. Мыши были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов).

1. Подготовка животных и фиксация почек

  1. Выполните фиксацию перфузии, выполнив следующие действия.
    1. Обезболивают мышь путем вдыхания изофлурана (3%, 2,0 л/мин) и внутрибрюшинного введения медетомидина гидрохлорида (0,3 мг/кг), тартрата буторфанола (5 мг/кг) и мидазолама (4 мг/кг) (см. Таблицу материалов).
    2. Перфузируйте животное 20 мл PBS (рН 7,4) и 30 мл 4% PFA в фосфатном буфере (PB) через левый желудочек сердца12.
  2. Выполните фиксацию погружения сразу после фиксации перфузии и забора проб почек9.
    1. Погрузите почку в 4% PFA при 4 °C еще на 16 ч, затем промыть ее PBS в течение 2 ч (три раза)9 (рисунок 1).
      ВНИМАНИЕ: Формальдегид и параформальдегид являются токсичными раздражителями. Обращайтесь с реагентами в вытяжном шкафу с соответствующими средствами индивидуальной защиты.

2. Обесцвечивание и делипидирование

  1. Готовят CUBIC-L для обесцвечивания и делипидирования, состоящие из 10 мас.% тритона X-100 и 10 мас.% N-бутгилдиэтаноламина (см. Таблицу материалов), следуя ранее опубликованным отчетам 4,8,9.
  2. Выполните обесцвечивание и делипидацию CUBIC-L, выполнив следующие действия.
    1. Погрузить неподвижную почку в 7 мл 50% (v/v) CUBIC-L (смесь воды 1:1 и CUBIC-L) в трубку круглого дна объемом 14 мл (см. Таблицу материалов) с легким встряхиванием при комнатной температуре в течение 6 ч (рисунок 2A). Затем погрузите его в 7 мл CUBIC-L в трубку круглого дна объемом 14 мл с легким встряхиванием при 37 °C в течение 5 дней.
    2. Обновляйте CUBIC-L каждый день во время этого процесса. После процесса обесцвечивания и делипидации промыть почки ПБС комнатной температурой в течение 2 ч (трижды)9 (фиг.1). Используйте дозирующую ложку для обработки проб (рисунок 2B).

3. Цельное иммунофлуоресцентное окрашивание

  1. Подготовьте буферы окрашивания.
    1. Подготовьте окрашивающий буфер для первичных антител путем смешивания 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,5% казеина в PBS и 0,05% азида натрия9.
    2. Подготовьте буфер окрашивания для вторичных антител путем смешивания 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,1% казеина в PBS и 0,05% азида натрия9.
  2. Выполняют окрашивание первичными антителами.
    1. Иммуноокрашить делипидированную почку первичными антителами (1:100 или 1:200, см. Таблицу материалов) в окрашивающем буфере при 37 °C с легким встряхиванием в течение 7 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество окрашивающего буфера, необходимого для одной почки, составляет 500-600 мкл (рисунок 2C).
    2. Промыть почки 0,5% (v/v) Тритон Х-100 в PBS (PBST) при комнатной температуре в течение 1 дня9 (Фиг.1).
  3. Выполняют окрашивание вторичными антителами.
    1. Иммуноокрашить почку вторичными антителами (1:100 или 1:200, см. Таблицу материалов) в окрашивающем буфере при 37 °C с легким встряхиванием в течение 7 дней. Промыть почки ПБСТ при комнатной температуре в течение 1 дня9 (рисунок 1).
    2. После фиксации9 погружают почку в 1% формальдегид в ПБ (смесь 1:36 37% формальдегида и ПБ) в течение 3 ч, и промывают ее ПБС при комнатной температуре в течение 6 ч (рисунок 1).

4. Сопоставление показателя преломления (RI)

  1. Приготовьте CUBIC-R+.
    1. Получают CUBIC-R путем смешивания 45 мас.% 2,3-диметил-1-фенил-5-пиразолона/антипирина и 30 мас.% никотинамида (см. Таблицу материалов).
    2. Подготовьте CUBIC-R+ для сопоставления показателя преломления (RI), добавив 0,5 V% N-бутилдиэтаноламина в CUBIC-R после ранее опубликованных отчетов 4,8,9.
  2. Выполните сопоставление RI.
    1. Погрузить почку в 7 мл 50% (v/v) CUBIC-R+ (смесь воды 1:1 и CUBIC-R+) в трубку круглого дна объемом 14 мл с легким встряхиванием при комнатной температуре в течение 1 дня. Затем погрузите его в 7 мл CUBIC-R+ в 14 мл круглодонной трубки с легким встряхиванием при комнатной температуре в течение 2 дней9 (рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя почка плавает в 50% CUBIC-R+ в начале сопоставления RI, она опускается и становится прозрачной в CUBIC-R+ в конце процесса (рисунок 2D).

5. Получение и реконструкция изображений

  1. Погружайте RI-согласованную почку в смесь кремниевого масла (RI = 1,555) и минерального масла (RI = 1,467) (55: 45) во время получения изображения (RI = 1,51)5 (Рисунок 3).
  2. Получайте 3D-изображения всей почки с помощью люминесцентного микроскопа на9 световых листов (см. Таблицу материалов). Соберите все необработанные данные изображения в 16-битном формате TIFF. Визуализируйте и захватывайте 3D-изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений (Imaris, см. Таблицу материалов).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя этот метод окрашивания, симпатические нервы [антитирозингидроксилазное (TH) антитело] и артерии [антитело против α гладкомышечных актинов (αSMA)] во всей почке (Рисунок 4A, B и Видео 1) были визуализированы9. Аномальные почечные симпатические нервы также визуализировались после ишемии/реперфузионного повреждения (IRI)9,10 (Рисунок 4C). Б...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Настоящий протокол позволял проводить 3D-визуализацию всей почки различных структур, таких как симпатические нервы, собирающие протоки, артерии, проксимальные канальцы и клубочки 9,10,11. Этот метод окрашивания предложил макроскопическое наблюдение и привел к новым биологическим открытиям, визуализируя изменение почечных симпатических нервов после ишемии-реперфузионного повреждения 9,10

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Часть этой работы была проведена в сотрудничестве с профессором Хироки Р. Уэда (Токийский университет), профессором Эцуо А. Сусаки (Университет Дзюнтендо), профессором Тецухиро Танака (Университет Тохоку), профессором Масафуми Фукагава, доктором Такехико Вада и доктором Хиротакой Комаба (Университет Токай).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
14 мл Пробирка из полипропилена с круглым дном высокой прозрачностиFalcon352059Очищение тканей, окрашивание, промывка
2,3-диметил-1-фенил-5-пиразолон/антипиринTokyo Chemical IndustryD1876CUBIC-R+
37%-раствор формальдегидаNacalai tesque16223-55После фиксации
4%-Параформальдегид фосфат буферный растворNacalai Tesque09154-85Фиксация почек
Alexa Flour 555-конъюгированное антитело IgG к овцеInvitrogenA-21436Вторичное антитело (1:100)
Alexa Flour 647-конъюгированное антитело против кролика IgG к ослуInvitrogenA-31573Вторичное антитело (1:200)
Антитело против аквапорина 2 (AQP2) Abcamab199975Первичное антитело (1:100)
Антитело против подоцинаSigma-AldrichP0372Первичное антитело (1:100)
Антитело против котранспортера глюкозы натрия 2 (SGLT2) Abcamab85626Первичное антитело (1:100)
Антитело против тирозингидроксилазы (TH)Abcamab113Первичное антитело (1:100)
Антитело против α-гладкомышечного актина (α-SMA)Abcamab5694Первичное антитело (1:200)
Блокатор казеина в PBSThermo Fisher Scientific37528Окрашивающий буфер
Буторфанол тартратMeiji005526Анестетик
C57BL/6NJclNippon Bio-Supp.CenterН/ДМышиный штамм
ImarisBitplaneN/AПрограммное обеспечение для анализа изображений
Макрозум-микроскопOLYMPUSMVX10Наблюдательный блок изготовленного на заказ микроскопа
Медетомидина гидрохлоридKyoritsu-Seiyaku008656Анестетик
МидазоламSANDOZ27803229Обезболивающее
минеральное маслоSigma-AldrichM8410Иммерсионное масло
N-бутилдитаноламинTokyo Chemical IndustryB0725CUBIC-L, CUBIC-R+
НикотинамидTokyo Химическая промышленностьN0078CUBIC-R +
Полиэтиленгликоль моно--изооктилфениловый эфир/Triton X-100Nacalai Tesque12967-45CUBIC-L, PBST
Силиконовое масло HIVAC-F4Shin-Etsu Химическое50449832Иммерсионное масло
Азид натрияWako195-11092Буфер для окрашивания

Ссылки

  1. Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  4. Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
  5. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  6. Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  7. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  8. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  9. Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
  10. Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
  11. Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  13. Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
  14. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  15. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  16. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
  17. Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CUBIC

Похожие статьи