Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Облегчение церебральной органоидной культуры с помощью бокового мягкого светового освещения

2.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63989

⸱

6 июня 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Key Laboratory of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes, 3School of Biotechnology and Health Sciences, Wuyi University

В этой статье

Краткое содержание

Церебральные органоиды предоставляют беспрецедентные возможности для изучения развития органов и патологии заболеваний человека. Хотя большие успехи были достигнуты с системами церебральных органоидных культур, все еще существуют операционные трудности в применении этой технологии. Настоящий протокол описывает церебральную органоидную процедуру, которая облегчает изменение среды и перенос органоидов.

Аннотация

В настоящее время технология церебральной органоидной культуры все еще сложна в эксплуатации и трудна для применения в больших масштабах. Необходимо найти простое и практичное решение. Поэтому в настоящем исследовании предлагается более осуществимый церебральный органоидный протокол. Чтобы решить неизбежные неудобства в изменении среды и переносе органоидов на ранней стадии, текущие исследования оптимизируют технологию работы, применяя инженерный принцип. Для бокового освещения образцов эмбриоидного тела (EB) была принята лампа мягкого света, позволяющая ЭБ быть видимыми невооруженным глазом через усиленный эффект диффузного отражения. Используя принцип вторичного потока, генерируемого вращением, органоиды собираются к центру скважины, что облегчает операцию изменения среды или переноса органоидов. По сравнению с дисперсной клеткой, эмбриональное тело быстрее оседает в пипетке. Используя это явление, большинство свободных клеток и фрагментов мертвых клеток могут быть эффективно удалены простым способом, предотвращая повреждение ЭБ от центрифугирования. Это исследование облегчает работу мозговой органоидной культуры и способствует применению органоидов головного мозга.

Введение

По сравнению с двумерными (2D) системами культур, трехмерные (3D) системы культур имеют ряд преимуществ, включая подлинную репликацию и эффективное воспроизведение сложных структур определенных органов1. Поэтому церебральные органоиды являются одним из важных вспомогательных методов для исследований в области развития мозга человека и болезни2, скрининга лекарств и клеточной терапии.

Культивирование церебральных органоидов методом вращающейся суспензии способствует их развитию и созреванию3. Хотя системы церебральных органоидных культур достигли больших успехов, они по-прежнему сталкиваются с критическими проблемами, которые ограничивают их применение. Например, ручное выращивание включает в себя сложные этапы манипуляции и создает препятствия для достижения крупномасштабных применений. Дополнительно на каждом этапе развития в культуре церебральных органоидов необходимы изменения в различных средах и цитокинах4. Однако на ранней стадии органоиды или ЭБ имеют крошечные размеры (примерно от 200 мкм до 300 мкм) и почти визуально недоступны без соответствующего аппарата. Неизбежно, определенное количество драгоценных образцов органоидов вымывается при изменении среды. Было изучено много методов преодоления этого в других видах органоидных культур, и некоторые примеры включают погружение целых органоидных чипов в культуральную среду в течение 3 дней без вмешательства5; добавление свежей среды через крышку после поглощения старой среды с использованием абсорбирующей бумаги5; или применение сложных микрофлюидных трубопроводов для жидкостообмена 6,7,8. Другим препятствием, встречающимся на ранней стадии культивирования органоидов, является трудность достижения прямых наблюдений невооруженным глазом, что может привести к плохим операциям, которые приводят к повреждению и потере органоидов во время этапов переноса органоидов. Поэтому необходимо установить более осуществимый протокол, который облегчает изменение среды и перенос органоидов для генерации органоидов.

Для преодоления этих проблем предлагается соответствующая оптимизированная операция, основанная на инженерных принципах, что значительно и удобно облегчает многие органоидные процедуры. В природе, когда солнце светит в дом через оконную щель, невооруженным глазом можно увидеть пыль, танцующую в луче света. Из-за диффузного отражения солнечного света на пыли часть света преломляется в глазное яблоко для получения визуального изображения. Вдохновленный принципом этого явления 9,10, это исследование сделало лампу мягкого света и осветило ЭБ сбоку. Было обнаружено, что ЭБ могут быть визуально чистыми, не влияя на область просмотра. Вторичный поток, указывающий на центр, генерируется в жидкости путем вращения культуральной пластины за счет вихревых токов11. Первоначально дисперсные ЭБ накапливаются в центре пластины. Исходя из этого, а также явления, что скорость осаждения органоидов быстрее, чем у клеток, предложен простой в эксплуатации метод изменения среды и переноса органоидов без центрифугирования. Органоиды в культуральной среде могут быть эффективно отделены от свободных клеток и фрагментов мертвых клеток с помощью этой операции переноса.

Здесь предлагается протокол, который прост в эксплуатации, для генерации церебральных органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека. Технология работы была оптимизирована за счет применения инженерного принципа, что делает операции в 3D-культуре такими же простыми и осуществимыми, как и в 2D-культуре. Улучшенный метод обмена жидкости и операция переноса органоидов также полезны для других типов органоидных культур и конструкции автоматических культуральных машин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол был составлен после Хельсинкской декларации. Одобрение было предоставлено Комитетом по этике Третьей аффилированной больницы Медицинского университета Гуанчжоу (Медицинский и этический обзор [2021] No 022). Перед экспериментом каждую среду готовили по формуле12 Юргена А. Кноблиха (дополнительные таблицы 1-4) или использовали коммерчески доступный церебральный органоидный набор (см. Таблицу материалов). IPSCs, используемые в этом исследовании, были ранее установлены нашей лабораторией и получили обоснованное исключение. SCA3-iPSCs были получены от 31-летней пациентки со спиноцеребеллярной атаксией типа 3 (SCA3), генотипированной как содержащая 26/78 ЦАГ-повторов в гене ATXN313 (дополнительный рисунок 1A). Нормальные человеческие IPSCs, упомянутые в предыдущей статье, были выбраны как NC-iPSCs14, а ген ATXN3 был идентифицирован как имеющий 14/14 ЦАГ-повторов (дополнительный рисунок 1B).

1. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)

  1. Собирают 3 мл периферической крови методом венипункции с информированного согласия добровольцев и пациентов.
  2. Выделяют мононуклеарные клетки периферической крови по методу Фиколла-Паке15.
  3. Установить ИПСК в соответствии с протоколом Набора перепрограммирования Сендая (см. Таблицу материалов).
    1. Культивируйте ИПСК со средой mTeSR1 в 35 мм чашках Петри, покрытых Матригелем (базальная мембранная матрица, см. Таблицу материалов). Меняйте среду каждый день. Плотность роста iPSC не должна превышать 75%.
    2. Переваривать клетки раствором диссоциации ПСК (см. Таблицу материалов) и субкультурировать их в соотношении 1:5 каждые 3-5 дней.
      ВНИМАНИЕ: Здесь используется вирус Сендай. Он должен эксплуатироваться в кабинете биобезопасности, и должны быть приняты меры самозащиты. Должно быть ясно, можно ли легально использовать его в местной стране. Местные законы и правила в области биобезопасности должны строго соблюдаться при использовании.

2. Подготовка EB (дни 0-1)

  1. Извлеките среду mTeSR1 из iPSCs с помощью пипетки и промыть ее 2x с 1 мл 1x PBS.
  2. Удаляют PBS пипеткой и добавляют 300 мкл раствора для отсоединения клеток (см. Таблицу материалов) для переваривания ИПСК в отдельные клетки в течение 3-4 мин при 37 °C.
  3. Повторно суспендируют клетки в 2 мл EB-пластовой среды (дополнительная таблица 1) и затем центрифугируют образец в течение 5 мин при 300 х г (комнатная температура).
  4. Предварительно обработать специализированную 24-луночную пластину антиадгезионным раствором (500 мкл/лунку) в течение 5 мин (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Антиадгезивный промывочный раствор необходим для оптимального образования ЭБ и сфероидов.
  5. Повторно суспендируют клетки в EB-пластовой среде, содержащей Y-27632 (конечная концентрация, 10 мкМ, см. Таблицу материалов), с плотностью клеток 1,5 х 106 клеток/мл.
  6. Удалите антиадгезивный промывочный раствор и промыть каждую лунку 2 мл EB-пластовой среды.
  7. Добавьте ячейки к специализированным 24-луночным пластинам с плотностью 3 х 106 ячеек/лунка (рисунок 1А, слева).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, в каждой скважине можно приготовить 300 ЭБ. Этот метод позволяет получать большие количества ЭБ одинакового размера.
  8. Центрифугировать пластину при 100 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Равномерно распределите ячейки в каждой камере в нижней части пластины (рисунок 1А, справа).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если нет подходящей центрифуги, пластина также может быть непосредственно помещена в инкубатор для статической культуры, но время образования шарика EB будет на несколько часов позже, чем при обычном центрифугировании.
  9. Инкубировать образцы при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 ч. Если центрифугирование не применялось на предыдущей стадии, инкубируют в течение 36 ч. Держите образец устойчивым и не вынимайте его из инкубатора в течение этого периода.

3. Подготовка лампы мягкого света (день 1)

  1. Используйте прозрачную акриловую доску толщиной 0,3-0,5 см размером с бумагу формата А5. Наклейте белые подушечки на переднюю и заднюю части акриловой пластины.
    1. Установите ряд светодиодных белых огней на край пластины, чтобы огни могли входить со стороны акриловой пластины, а затем стрелять параллельно (дополнительный рисунок 2A-F, рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку диаметры ЭБ на ранней стадии составляют приблизительно от 200 мкм до 300 мкм, трудно четко наблюдать их невооруженным глазом под люминесцентной лампой чистых скамеек. Напротив, благодаря усилению диффузного отражения мы можем четко обнаружить ЭБ с помощью мягкого света с боковой подсветкой (рисунок 1B, C). 6-луночная пластина рекомендуется для EB культур в последующих экспериментах. Однако, чтобы лучше показать визуальный эффект мягкого света, посуда иногда используется для съемки и видео в этом исследовании вместо тарелок, поэтому, пожалуйста, не поймите неправильно. Лампа мягкого света с боковым освещением также может быть использована для 6-луночной пластины.

4. Перенос EB и замена среды (дни 2-5)

  1. Подготовьте новую 6-луночную пластину с низкой адгезией и добавьте 2 мл EB-пластовой среды в каждую скважину.
  2. Удалите ЭБ вместе со средой с помощью широкопроходного наконечника пипетки объемом 1000 мкл (см. Таблицу материалов) и перенесите их на пластину с низкой адгезией с 6 лунками (~100 ЭБ/лунка).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе эксплуатации используется лампа мягкого света (упомянутая на шаге 3.), чтобы облегчить наблюдение за ЭБ. Выключите другие внутренние источники света, чтобы получить визуальный эффект мягкого света лучше.
  3. Заменяйте одним и тем же объемом свежую EB-пластовую среду каждый день. Используйте вторичный поток, чтобы собрать ЭБ в центр и изменить среду.
    1. Аспирируйте старую среду, медленно пипетируя до края лунки. Не сосите слишком сильно; в противном случае ЭБ будут удалены вместе. Затем добавьте свежую среду, чтобы повторно использовать EB.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Принцип вторичного потока (рисунок 1D). Индуцируйте поток вихря, вращая тарелку по круговой орбите. Из-за вихревого потока индуцируется вторичный поток, направленный к центру. ЭБ или органоиды сходятся к центру скважины из-за вторичного потока, генерируемого вращением, после чего может быть легко выполнено изменение среды или перенос эмбрионов.

5. Проверка плюрипотентности путем маркировки маркером плюрипотентности OCT4 (день 4)

ПРИМЕЧАНИЕ: Когда диаметр ЭБ превышает 300 мкм, возьмите несколько ЭБ для окрашивания маркером иммунофлуоресценции OCT4, чтобы обнаружить их плюрипотентность.

  1. Фиксируйте ЭБ в 4% параформальдегиде при 4 °C в течение 30 мин, затем промывая в 1x PBS 3x в течение 10 мин каждый раз.
  2. Переводят ЭБ при комнатной температуре PBS, содержащей 0,3% Triton X-100 и 3% BSA в течение 2 ч, с последующей промывкой в PBS 3x в течение 10 мин каждый раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После обработкиtriton X-100 ЭБ плавают на поверхности жидкости и могут легко всасываться вместе с жидкостью во время очистки. Рекомендуется операция под стереомикроскопом.
  3. Разбавляют первичное антитело OCT4 (см. Таблицу материалов) 1 мл 1x PBS, содержащим 1% BSA в соотношении 1:200, и добавляют к EBs для инкубации при 4 °C на ночь, затем промывают pBS 3x в течение 10 мин каждый раз.
  4. Разбавьте соответствующее вторичное антитело (см. Таблицу материалов) 1x PBS при 1:500 и добавьте 1 мл к ЭБ.
  5. После инкубации при комнатной температуре в течение 2 ч промывайте клетки в 1x PBS 3x в течение 10 мин каждый раз.
  6. Удалите PBS, добавьте 2 мл 1x раствора PBS, содержащего 1 мкг/мл DAPI, инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем промывайте в PBS 3x в течение 10 мин каждый раз.
  7. Переместите ЭБ, содержащий небольшое количество жидкости, на затвор, запечатайте затвор покровным стеклом, покрытым коммерчески доступным вазелином (см. Таблицу материалов) по краю, а затем наблюдайте и собирайте изображение под флуоресцентным конфокальным микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выражение OCT4 представляет плюрипотентность EB12. Если выражение OCT4 составляет менее 90%, ЭБ следует отбросить, а ЭБ подготовить заново.

6. Нейронная индукция (дни 5-7)

  1. Подготовьте новую 6-луночную пластину с низкой адгезией и добавьте в каждую скважину 3 мл нейронной индукционной среды (дополнительная таблица 2).
  2. Включите боковой мягкий свет (упомянутый в шаге 3.) и выключите другие внутренние источники света.
  3. Перенесите ЭБ на 6-луночную пластину с добавлением нейронной индукционной среды (~100 ЭБ/лунка). Добавьте как можно меньше исходной среды в новую лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Введите простые навыки переносаорганоидов. Естественно, под действием силы тяжести и с относительно более высокой плотностью, чем среда, повторно суспендированные ЭБ будут постепенно опускаться, применяя операцию, показанную на рисунке 1E. Следовательно, ЭБ могут быть удобно переданы. Поскольку, по сравнению с ЭБ, свободные клетки и фрагменты мертвых клеток опускаются медленнее, большинство свободных клеток и фрагментов мертвых клеток, таким образом, могут быть удалены с помощью этого метода осаждения (рисунок 1F).
  4. Инкубировать образцы при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Под микроскопом диаметр ЭБ составлял примерно 500 мкм, а край был полупрозрачным, что указывает на то, что образовался нейроэпителиальный слой.
  5. Перейдите к следующему шагу.

7. Встраивание в матрицу базальной мембраны (7-10 дней)

  1. Поместите мембранную матрицу в холодильник с температурой 4 °C за 60 мин до растворения. Заранее рассчитайте сумму необходимой матрицы. Приблизительно 100 ЭБ были встроены в 1,5 мл мембранной матрицы.
  2. Включите боковой мягкий свет и выключите источник света в верхней части консоли.
  3. Держите мембранную матрицу на льду, чтобы предотвратить затвердевание.
  4. Каждый раз перекладывайте небольшое количество ЭБ в 60-миллиметровую посуду, содержащую свежую расширительную среду (дополнительная таблица 3). Уменьшите количество ЭБ, чтобы упростить удаление одного ЭБ.
  5. Затем используйте новую 6-луночную пластину с низкой адгезией. Каждый раз всасывайте один ЭБ (содержащий приблизительно 10 мкл среды) с широкопроходным наконечником пипетки объемом 200 мкл (см. Таблицу материалов), а затем добавляйте его на дно 6-луночной пластины, чтобы сделать капли. Используйте по пять капель на лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ключ состоит в том, чтобы отрегулировать диапазон пипетки до 50 мкл и высосать EB, а затем обратиться к операции на рисунке 1E. Когда EB оседает в отверстии наконечника пипетки, наконечник быстро касается дна пластины колодца и выталкивает примерно 10 мкл жидкости с образованием капли.
  6. Добавьте 15 мкл мембранной матрицы к каждой капле, содержащей EB, и быстро перемешайте ее. Вставьте шарик EB в центр капли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ЭБ не должны быть аспирированы стандартным наконечником пипетки, который повреждает ЭБ. Вместо этого необходимо использовать широкопроходный наконечник пипетки объемом 200 мкл.
  7. Поместите 6-луночную пластину в инкубатор с температурой 37 °C на 30 минут и затвердите капли мембранной матрицы, содержащие ЭБ.
  8. Добавьте 3 мл среды расширения к каждой скважине и осторожно взорвите встроенные в матрицу ЭБ, чтобы приостановить их.
  9. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение 3 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если наблюдается почкование на поверхности ЭБ, это означает, что образовался расширенный нейроэпителий16.

8. Созревание органоидов (10-40 дней)

  1. Аккуратно удалите исходную среду и добавьте 3 мл среды созревания (дополнительная таблица 4) в каждую лунку.
  2. Поместите органоидную пластину на горизонтальный шейкер в инкубаторе при температуре 37 °C.
  3. Продолжайте поворачивать язык и региональные параметры по горизонтали. Установите шейкер на соответствующую скорость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При культивировании церебральных органоидов на 6-луночной пластине более уместна относительная центробежная сила (RCF) 0,11808 х г, по словам производителя горизонтального шейкера (см. Таблицу материалов). В соответствии с преобразованием между относительной центробежной силой и скоростью вращения17,18, RCF = 1,118 x 10−5 × R × об/мин2, где RCF = относительная центробежная сила (g), rpm = обороты в минуту (r/min) и R = радиус вращения (см), также известный как бросок встряхивания. Параметры встряхивания разных шейкеров могут быть разными. Таким образом, можно оценить, что скорость вращения составляет rpm = 299 x (RCF/R)1/2.
  4. Меняйте свежую среду созревания каждые 2-3 дня.
  5. Через 20-30 дней постепенно культивируют церебральные органоиды до зрелости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого периода органоиды могут быть использованы для экспериментов и обнаружения, таких как обнаружение нейронных маркеров и секвенирование транскриптома 19,20,21.

9. Замороженные срезы и иммунофлуоресценция церебральных органоидов

  1. Зафиксируйте органоиды в 4% параформальдегиде при 4 °C в течение 16 ч, а затем промывайте их 3 раза с 1x PBS в течение 10 мин каждый раз.
  2. Удалите PBS и погрузите органоиды в 30% сахарозы при 4 °C в течение ночи.
  3. Встраивают органоиды в 10%/7,5% желатин/сахароза при 37 °C в течение 1 ч, а затем быстро переносят их во встраиваемую форму.
  4. Добавьте сухой лед к 100% этанолу, чтобы приготовить суспензию сухого льда / этанола, и поместите в него образцы органоидов для быстрой заморозки.
  5. Храните замороженные образцы в морозильной камере при температуре −80 °C. При необходимости делают замороженные срезы толщиной 20 мкм.
  6. Обратитесь к шагам 5.3.-5.5. для иммунофлуоресценции. Используйте антитело PAX6 для маркировки апикальных клеток-предшественников, антитело TUJ1 (см. Таблицу материалов) для маркировки нейронных клеток 22,23,24 и DAPI для окрашивания ядерной ДНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Настоящее исследование индуцировало ИПСК (Рисунок 2В) в церебральные органоиды (Рисунок 2С). ЭБ, культивируемые на ранней стадии, выражали маркер OCT4 (рисунок 2A), который указывал на хорошую плюрипотентность. На более поздней стадии ЭБ развились в зрелые церебральные органоиды (рисунок 2D). Исследование культивировало иПСК от нормальных здоровых людей и пациентов с SCA3 в церебральные органоиды (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Церебральные органоиды открывают новые возможности для медицинских исследований. Многие полезные применения этой технологии только начинают изучаться28. Это исследование показало, что результаты секвенирования транскриптома генетически больных церебральных органоидов и нормальных церебральных органоидов могут отражать различия между болезнью и здоровьем. Например, результаты анализа данных RNA-seq (рисунок 3B) согласуются со многими зарегистрированными исследованиями ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Фондом естественных наук провинции Гуандун (грант No 2020A0505100062), Проектом по ключевым темам науки и техники города Гуанчжоу (грант No 201904020025), Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 31872800, 32070582, 82101937) и проектом постдокторских исследований города Гуанчжоу (Бангчжу Чену).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 μ m ФильтрNEST Biotechnology, Китай331001
1000 μ L наконечник для дозатора с широким проходомThermo Fisher Scientific, США9405163
200 г; L широкий наконечник для пипеткиThermo Fisher Scientific, США9405020
2-меркаптоэтанолMerck, Германия8057400005
4% параформальдегидаServicebio, КитайG1101
6-луночная пластина с низкой адгезиейNEST Biotechnology, Китай703011Используется для суспензий БЭ
Раствор для отслойки клетокSTEMCELL Technologies, Канада07920Используется для расщепления иПСК в одиночных клетках.
AggreWell800 24-луночный STEMCELLTechnologies, Канада34811Микропористый культуральный планшет для получения БЭ.
Антиадгезионный промывочный растворSTEMCELL Technologies, Канада07010Промывочный раствор для культуральной посуды для предотвращения адгезии
клеток B27-vit. ДобавкаThermo Fisher Scientific, США12587010
bFGFPeprotech, СШАGMP100-18B
BSABeyotime Biotechnology, ChinaST025
CentrifugeEppendorf, Germany5810 RОна может использоваться для центрифугирования различных типов центрифужных пробирок, флаконов с реагентами и рабочих пластин.
Защитное стеклоShitai Laboratory Equipment, Китай10212020C
DAPIBeyotime Biotechnology, КитайC1002Используется для ядерного окрашивания. После объединения DAPI с двухцепочечной ДНК максимальная длина волны возбуждения составила 364 нм, а максимальная длина волны излучения — 454 нм.
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific, США11330032
ES-качество FBSThermo Fisher Scientific, США10270106
Ficoll PaqueGeneral Electric Company, США17-5442-02Изолируйте мононуклеарные клетки периферической крови по методу Фиколла-Паке.
ЖелатинSangon Bioteach, КитайA609764
добавка GlutamaxThermo Fisher Scientific, США35050061
добавка GlutamaxThermo Fisher Scientific, США17504044
Goat anti-Chicken IgY  вторичное антителоAbcam, UKab150171Goat anti-Chicken IgG. Конъюгация: Alexa Fluor 647. Пример: 652 нм, Эм: 668 нм. Используйте при разведении 1:500.
Вторичное антитело Goat anti-Mouse IgGAbcam, UKab150120Goat anti-Mouse IgG. Конъюгация: Alexa Fluor 594. Пример: 590 нм, Em: 617 нм. Используйте при разведении 1:500.
Вторичное антитело Abcam против кроликаAbcam, Великобританияab150077Козье антитело против кролика IgG. Конъюгация: Alexa Fluor 488. Пример: 495 нм, Em: 519 нм. Используйте при разведении 1:500.
HeparinMerck, ГерманияH3149
Горизонтальный шейкерServicebio, КитайDS-H200Относительная центробежная сила (RCF) 0,11808 x g является более подходящей, по мнению производителя INFORS HT (Швейцария).
ИнсулинMerck, ГерманияI9278-5ML
KOSRThermo Fisher Scientific, США10828028
MatrigelCorning, США354277Matrigel затвердевает в окружающей среде выше 4 °°; C, поэтому его следует упаковывать при низкой температуре.
MEM-NEAAThermo Fisher Scientific, США11140050
mTeSR1STEMCELL Technologies, Канада85850iPSC питательная среда
N2 добавкаThermo Fisher Scientific, США 17502048
NeurobasalThermo Fisher Scientific, США21103049
OCT4 первичное антителоAbcam, Великобританияab19857Хозяин: Кролик. Растворить с помощью 500 L PBS. Используйте при разведении 1:200.
Патологический замороженный слайсерLeica,Германия Leica CM1860
PAX6 первичное антителоAbcam, Великобританияab78545Хозяин: мышь. Используйте в разведении 1:100.
PBSSTEMCELL Technologies, Канада37350
Пенициллин-стрептомицинThermo Fisher Scientific, США15140122
раствор для диссоциации ПСКBeijing Saibei Biotechnology, КитайCA3001500Раствор для диссоциации без ферментов может быть использован для расщепления и прохождения иПСК.
Комплект для перепрограммирования в СендаеThermo Fisher Scientific, СШАA16518Установите iPSC в соответствии с протоколом Sendai Reprogramming Kit.
Слайдовое стеклоShitai Laboratory Equipment, Китай188105W
Лампа мягкого светаNUTNUT Простоесамодельное устройство, см. дополнительный рисунок 2 для приготовления.
Набор церебральных органоидов STEMdiff STEMCELLTechnologies, Канада8570содержит: 1. среду для образования ЭБ; 2. Индукционная среда; 3. Расширяющая среда; 4. Среда созревания.
STEMdiff Набор для созревания церебральных органоидовSTEMCELL Technologies, Канада8571Среда созревания
СахарозаSangon Bioteach, КитайA502792
Triton X-100Merck, ГерманияX100
TUJ1 первичное антителоAbcam, Великобританияab41489Хозяин: Курица. Используйте при разведении 1:1000.
ВазелинСангон Bioteach, КитайA510146
Y-27632STEMCELL Technologies, Канада72302Приготовьте стоковый раствор 5 мМ в PBS, ресуспендируйте 1 мг в 624 &; L из PBS.
Weblink
Необработанные данные секвенированияАрхив последовательностей генома (Genomics, Proteomics & Биоинформатика 2021) в Национальном центре данных по геномике (Nucleic Acids Res 2022), Китайский национальный центр биоинформации / Пекинский институт геномики, Китайская академия наукGSA-Human:HRA002430 https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/

Ссылки

  1. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
  2. Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  5. Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581(2021).
  6. Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
  7. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
  8. Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876(2018).
  9. Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268(2021).
  10. Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
  11. Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827(2020).
  12. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  13. Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
  14. Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288(2020).
  15. Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7.1 (2001).
  16. Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549(2018).
  17. Rieder, H. L., Smithwick, R. W. RPM or RCF. The American Review of Respiratory Disease. 132 (6), 1371(1985).
  18. Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
  19. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  20. Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
  21. Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
  22. Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  23. Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
  24. Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763(2021).
  25. Costa, M., Paulson, H. L. Toward understanding Machado-Joseph disease. Progress in Neurobiology. 97 (2), 239-257 (2012).
  26. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
  27. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550(2014).
  28. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  29. Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
  30. Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
  31. Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, Pt 11 3221-3237 (2015).
  32. Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
  33. Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985(2021).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Camp, J. G., Treutlein, B. Human development: Advances in mini-brain technology. Nature. 545 (7652), 39-40 (2017).
  36. Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
  37. Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
  38. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  39. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Формирование эмбриоидных телецперенос органоидовсмена средынейральная индукцияматрикс базальной мембранымаркеры плюрипотентностисозревание органоидоввторичный поток
Облегчение церебральной органоидной культуры с помощью бокового мягкого светового освещения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.