Методическая статья

Высокоскоростное сечение височной кости человека для оценки COVID-19-ассоциированной патологии среднего уха

DOI:

10.3791/64012

⸱

18 мая 2022 г.

 ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology - Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 3Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается метод быстрого среза височной кости человека, который использует микропилу с двумя алмазными лезвиями для создания тонких срезов для быстрой декальцинации и анализа иммуногистохимии височной кости.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гистопатологический анализ височных костных отделов человека является фундаментальной методикой изучения патологии внутреннего и среднего уха. Срезы височной кости получают путем посмертного забора височной кости, фиксации, декальцификации, встраивания и окрашивания. Из-за плотности височной кости декальцинация является трудоемким и ресурсоемким процессом; полная подготовка тканей может занять в среднем 9-10 месяцев. Это замедляет исследования отопатологии и препятствует чувствительным ко времени исследованиям, таким как те, которые имеют отношение к пандемии COVID-19. В данной работе описывается методика быстрой подготовки и декальцификации височных костных срезов для ускорения обработки тканей.

Височные кости были собраны посмертно с использованием стандартных методов и зафиксированы в 10% формалине. Прецизионная микропила со сдвоенными алмазными лезвиями использовалась для резки каждой секции на три толстых участка. Толстые висовидные участки кости затем декальцифицировали в декальцифицирующем растворе в течение 7-10 дней, прежде чем были встроены в парафин, разделены на тонкие (10 мкм) участки с использованием криотома и установлены на незаряженных слайдах. Затем образцы тканей депарафинизировали и регидратировали для окрашивания антителами (ACE2, TMPRSS2, Furin) и визуализировали. Эта методика сократила время от сбора урожая до анализа тканей с 9-10 месяцев до 10-14 дней. Высокоскоростное срезание височной кости может увеличить скорость исследований отопатологии и уменьшить ресурсы, необходимые для подготовки тканей, а также облегчить чувствительные ко времени исследования, такие как те, которые связаны с COVID-19.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование височной кости человека предоставляет бесценный ресурс для изучения патологии и патофизиологии внутреннего и среднего уха. До 19-го века мало что было известно об отологических заболеваниях 1,2,3. Чтобы лучше понять отологические заболевания и «спасение слуховой хирургии от рук шарлатанов», Джозеф Тойнби (1815-1866) разработал методы изучения гистологических участков височной кости человека3. Эта работа была продолжена Адамом Политцером (1835-1920) в Вене и других странах Европы в течение оставшейся части 19-го века, который использовал срезы височной кости для описания гистопатологии многих распространенных состояний, влияющих на ухо 2,3,4.

Первая лаборатория височной кости человека в США была открыта в 1927 году в больнице Джона Хопкинса, где Стейси Гильд (1890-1966) разработала методыразрезания височной кости 5,6. Методы, разработанные Гильдией, состояли из 9-10-месячного процесса, который включал в себя посмертный сбор, фиксацию, декальцинацию в азотной кислоте, обезвоживание в этаноле, встраивание целлоидина, секционирование, окрашивание и монтаж. Модификации этой техники были позже сделаны Гарольдом Шукнехтом (1917-1996)7; однако основные компоненты этого процесса остаются практически неизменными.

Значительные ресурсы, необходимые для поддержания лаборатории височной кости, представляли собой проблему для исследования височной кости и, вероятно, способствовали снижению ее популярности за последние 30 лет 4,8. Значительная часть лабораторных ресурсов височной кости должна быть направлена на 9-10-месячный процесс подготовки височной кости. Одним из самых трудоемких этапов подготовки является декальцификация височной кости, которая является самой плотной костью в организме человека. Декальцинация обычно выполняется в азотной кислоте или этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА) и занимает от нескольких недель до нескольких месяцев, требуя частой смены растворов 7,9. Кроме того, чувствительные ко времени исследования человеческого уха, такие как те, которые связаны с пандемией COVID-19, могут быть затруднены этим медленным процессом подготовки. В этой статье описывается метод высокоскоростного сечения височной кости, который использует алмазную микропилу для создания толстых участков, которые позволяют быстро декальцинировать и анализировать ткани в течение 10-14 дней после сбора височной кости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был разработан с одобрения IRB (IRB00250002) и в соответствии с институциональной политикой по использованию тканей человека и инфекционных материалов. Каждый донор височной кости предоставил письменное согласие перед смертью, или согласие было получено посмертно от семьи донора. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе.

1. Зажим височной кости

  1. Получить одобрение местного институционального наблюдательного совета (IRB), пересмотреть институциональную политику в отношении использования человеческого и инфекционного материала и получить согласие на донорство тканей до использования этого протокола.
  2. Наденьте надлежащие средства индивидуальной защиты (СИЗ) перед работой с тканями от COVID-19-положительных доноров височной кости. Убедитесь, что СИЗ состоят из респиратора N-95 и лицевого щитка (или, в качестве альтернативы, системы очистки воздуха под положительным давлением), халата и двух пар перчаток. Просмотрите методы правильного ношения и снятия СИЗ перед началом работы с этим протоколом10.
  3. Собирают височную костную ткань в течение 12-24 ч после смерти донора. Если тело не охлаждено, убедитесь, что сбор урожая происходит в течение 8 часов после смерти.
    1. Сбор височных костей во время вскрытия с использованием метода с четырьмя разрезами, блокированием по остеотому7.
      1. После трепанации черепа удалите мозг и резко разделите черепные нервы на внутренний слуховой проход.
      2. Сделайте первый костный разрез с остеотомом параллельно и просто медиально плоской части височной кости.
      3. Выполняют второй костный разрез параллельно первому на медиальной границе височной кости.
      4. Затем делают третий разрез на 3-4 см спереди и параллельно петроусскому гребню.
      5. Сделайте четвертый разрез примерно параллельно третьему, на 2 см сзади от петрового гребня.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все разрезы проходят через основание черепа.
      6. Затем удалите височную кость, используя острое рассечение, чтобы освободить прикрепление мягких тканей вдоль нижнего края образца. Если бальзамирование должно быть выполнено после забора височной кости, завяжите культю сонной артерии.

2. Фиксация тканей, декальцинация и сечение

  1. Немедленно поместите ткань в 200-300 мл 10% буферизованного формалина (формальдегида) так, чтобы ткань была полностью погружена. Оставьте ткань в формальдегиде минимум на 72 ч при комнатной температуре, ежедневно меняя растворы. Храните ткань в герметичном контейнере и вносите изменения раствора под вытяжным капюшоном, нося соответствующие СИЗ для предотвращения распространения вируса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После 72-часового периода фиксации образцы больше не нужно считать инфекционными.
  2. Используйте прецизионную микропилу с двумя алмазными лезвиями, чтобы разрезать каждый образец на три «толстых» участка, чтобы обеспечить более быстрое декальцификацию тканей. Установите двойные алмазные лезвия на расстояние 5 мм, чтобы центральное сечение височной кости имело толщину 5 мм. Убедитесь, что участки ткани на обоих концах имеют толщину 3-5 мм.
  3. Поместите толстые срезы в 200-300 мл 23% мас./мас., декальцинирующего раствор муравьиной кислоты, на 7-10 дней при комнатной температуре, пока ткань не станет достаточно мягкой для встраивания парафина. Меняйте решения ежедневно. Проверьте адекватность декальцификации тканей, пальпируя образец, который должен чувствовать себя мягким.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Декальцинация также может быть проверена рентгеновским снимком.
  4. Промойте образцы в проточной водопроводной воде в течение 24 часов, поместив их в большой стакан под работающим краном.
  5. Обезвоживают ткани в серии спиртов повышенной концентрации7. Погружают ткань в 100-200 мл 70% этанола в течение 1,5 ч с последующим тремя промывками в 95% и 100% этаноле по 1,5 ч соответственно. Далее промыть ткань 3 х 1,5 ч в ксилоле.
  6. Вставьте толстые срезы в парафин, с четырьмя процедурами по 45 минут каждая.
  7. Используйте криотом, чтобы разрезать тонкие (10 мкм) участки. Расположите ткань так, чтобы ткань разрезалась в осевой плоскости. При желании нарежьте более толстые (20 мкм) участки.

3. Иммуногистохимия и визуализация

  1. Если желательно традиционное окрашивание гематоксилином и эозином (не описано здесь), выполните окрашивание перед монтажом секций на стеклянных слайдах7.
  2. Установите секции на положительно заряженные стеклянные слайды.
  3. Выпекайте горки на конфорке при 60 °C в течение 20 минут.
  4. Поместите слайды в держатель и погрузите их в коммерческий раствор для предварительной обработки, содержащий органический растворитель (в данном случае диэтаноламин) и этанол для депарафинизации, регидратации и демаскации ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для достижения удовлетворительных результатов с помощью иммуногистохимии для формалин-фиксированной и парафин-внедренной ткани.
  5. Нагревайте слайды в скороварке на высоком давлении в течение 20 мин.
  6. Поместите слайды в увлажненную камеру и заблокируйте ткань коммерческим блокирующим раствором.
  7. Исследуйте участки тканей первичным антителом против ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2; 1:50), трансмембранной протеазы серин 2 (TMPRSS2, 1:1000) и протеазы Фурина (1:250).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела ACE2, TMPRSS2 и Furin используются, потому что эти белки, как полагают, играют роль в инфекционности SARS-CoV-211,12, и этот протокол направлен на исследование возможных механизмов, с помощью которых SARS-CoV-2 может инфицировать среднее ухо13.
  8. Лечить HRP-конъюгированным антизаглубийным вторичным антителом (ACE2, Furin; разведение 1:100) или антикоачьим (TMPRSS2, разведение 1:100) вторичным антителом.
  9. Увлажняйте горки 70% гематоксилина в воде.
  10. Получайте изображения на световой микроскоп с помощью установленной цифровой камеры. Получение изображений слизистой оболочки среднего уха и евстахиевой трубы при 20-кратном и 10-кратном увеличении соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Окрашивание гематоксилином и эозином слизистой оболочки среднего уха и евстахиевой трубы показало сохранение слизистой оболочки среднего уха и подслизистой ткани среднего уха после обработки (рисунок 1). Иммуногистохимические изображения показали экспрессию белков ACE2, TMPRSS2 и Furin в слизистой оболочке среднего уха и евстахиевой трубе (рисунок 1). Присутствие этих белков в среднем ухе обеспечивает возможный путь, по которому SARS-CoV-2 может инфицировать рес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование височной кости человека имеет решающее значение для изучения патологии внутреннего и среднего уха, но остается трудоемким и ресурсоемким делом. В этой статье описывается метод, который использует алмазную микропилу для создания толстых височных участков кости, которые могут быть быстро декальцинированы перед дальнейшим сечением, так что время от сбора ткани до исследования может быть сокращено с 9-10 месяцев до 10-14 дней. Этот метод может уменьшить ресурсы, необходимые для обработки височной кости, и облегч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Мохамеда Лехара за его помощь в этом проекте. Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения (T32DC000027, NSA).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антитело Anti-ACE-2 (разведение 1:50)Антитело против фурина Novus BiologicalsSN0754
(разведение 1:250)Антитело против TMPRSS2 AbcamEPR 14674
(разведение 1:1,000)Novus BiologicalsNBP1-20984
BX43 Ручная система МикроскопOlympus Life Science Solutions
CBN/Diamond Гибридные пластины BladePace TechnologiesWB-007GP
Collin Mallet - 8''SurgicalMartSM1517
DS-Fi3 Микроскоп ФотоаппаратNikon
Dual Endogenous Enzyme Block (коммерческое решение для блокировки)DakoS2003
Eaosin StainSigma-Aldrich548-24-3
Раствор формалина, нейтральный буферизованный 10%Sigma-AldrichHT501128
Murical-4 Decalcifier (раствор для декальцинации муравьиной кислоты)StatLab1214-1 GAL
Hematoxylin StainSigma-AldrichH9627
HRP-конъюгированное вторичное антитело против кролика (разведение 1:100)Leica BiosystemsPV6119
ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat IgG Detection Kit, пероксидаза (1:100 Vector LaboratoriesMP-7405
Lambotte Остеотомнаяхирургическая маркаSM1553
Металлографическая PICO 155P Прецизионная пилаPace TechnologiesPICO 155Pмикропила
NIS Elements Software Версия 4.6Nikon
Paraplast PlusSigma-AldrichP3683парафин
Положительно заряженные предметные стекла микроскопа с белым матовым концомWalter Products1140B15
Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat MicrotomeNew Life Scientific Inc.A78900104Cryotome
Triology Pretreatment Solution (коммерческий раствор для предварительной обработки)Sigma-Aldrich920P-05
XyleneSigma-Aldrich920P-05

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
  2. Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).
  3. Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
  4. Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
  5. Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480(1934).
  6. Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
  7. Schuknecht, H. Pathology of the Ear. , Lea and Febiger. Philadelphia, PA. (1993).
  8. Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science--and art--of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
  9. Nager, G. T. Pathology of the Ear and Temporal Bone. , Williams and Wilkins. Baltimore, MD. (1993).
  10. COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE). , Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022).
  11. Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822(2022).
  12. Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
  13. Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
  14. Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
  15. Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113(2021).
  16. McCall, A. A., et al. Extralabyrinthine manifestations of DFNA9. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).
  17. Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
  18. Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
  19. Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

COVID 19ACE2

Похожие статьи