Визуализация миелинизации является важной целью для многих исследователей, изучающих нервную систему. CARS - это метод, совместимый с иммунофлуоресценцией, который может нативно отображать липиды в ткани, такой как мозг, освещая специализированные структуры, такие как миелин.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Когерентная антистоковская рамановская спектроскопия (CARS) для визуализации миелинизации в срезах мозга
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Когерентная антистоковская рамановская спектроскопия (CARS) — это метод, классически используемый химиками и физиками для получения когерентного сигнала сигнатурных колебаний молекул. Тем не менее, эти вибрационные сигнатуры также характерны для молекул в анатомической ткани, такой как мозг, что делает его все более полезным и применимым для приложений нейробиологии. Например, CARS может измерять липиды, специфически возбуждая химические связи внутри этих молекул, что позволяет количественно оценивать различные аспекты ткани, такие как миелин, участвующий в нейротрансмиссии. Кроме того, по сравнению с другими методами, обычно используемыми для количественной оценки миелина, CARS также могут быть настроены на совместимость с иммунофлуоресцентными методами, что позволяет совместно маркировать с другими маркерами, такими как натриевые каналы или другие компоненты синаптической передачи. Изменения миелинизации являются по своей сути важным механизмом при демиелинизирующих заболеваниях, таких как рассеянный склероз или другие неврологические состояния, такие как синдром хрупкой Х или расстройства аутистического спектра. В заключение, CARS может быть использован инновационными способами, чтобы ответить на насущные вопросы в неврологии и предоставить доказательства основных механизмов, связанных со многими различными неврологическими состояниями.
Введение
Потенциалы действия являются основной единицей информации в мозге, а распространение потенциала действия через аксоны образует один столп обработки информации 1,2,3. Нейроны обычно получают афферентные входы от нескольких других нейронов и интегрируют эти входы в заданное узкое временноеокно 4,5. Поэтому механизмам распространения потенциала действия в аксонах было уделено значительное внимание со стороны исследователей.
При распространении через аксон потенциал действия многократно регенер....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты соответствовали всем применимым законам, руководящим принципам Национальных институтов здравоохранения и были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Колорадо Аншутц.
1. Животные
- Используйте C57BL/6J (stock #000664) мышей (Mus musculus), полученных из Лаборатории Джексона, или монгольских песчанок (Meriones unguiculatus), первоначально полученных из чарльз-Ривер.
2. Подготовка тканей
- Для транскардиальной перфузии передозировка грызунов представляет интерес с пентобарбиталом (120 мг/кг массы тел....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Одним из самых больших преимуществ микроскопии CARS перед другими методами является совместимость с флуоресцентной визуализацией23. На рисунке 1 показаны спектры CARS по сравнению с Nissl, помеченными иммунофлуоресцентным маркером, показывающим небольшое /нулевое перекрытие в спектрах. Рисунок 2 иллюстрирует лазер, установленный для CARS в сочетании с конфокальной микроскопией. На рисунке 3 показаны два репре.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Растущая литература подчеркивает роль миелина в функции мозга 13,16,21,28. Кроме того, мы знаем, что толщина миелинизации и картина миелинизации могут изменяться при нескольких неврологических состояниях, таких как рассеянный склероз (рассмотрен в29), старение (рассмотрено в30), аутизм20,31
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Поддерживается NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) и NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 и FRAXA (McCullagh). Визуализация CARS была выполнена в основной части Advanced Light Microscopy Центра нейротехнологий в Медицинском кампусе Университета Колорадо Аншутц при частичной поддержке NIH P30 NS048154 и NIH P30 DK116073.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Обезболивающее: | |||
| 1 мл одноразовый шприц с иглой 27 GA x 0,5" | Exel int | 260040 | |
| Fatal + | Vortech | ||
| Surgery: | |||
| Пружинные ножницы - 8 мм Режущие лезвия | Инструменты для тонкой науки | 15024-10 | |
| Стандартный пинцет | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Perfusion: | |||
| 4% Параформальдегид | Fisher Chemical | SF994 (CS) | |
| Тонкие ножницы - Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Гемостатики Келли | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2O | |||
| Наконечник иглы, 23 GA x 1" | BD прецизионный скольжение | 305193 | |
| фосфатный буферный раствор (PBS): | |||
| хлорид калия | Sigma | P9333 | |
| Монооснование фосфата калия | Sigma | P5655 | |
| насос с переменным расходом или эквивалент | |||
| Хлорид натрия | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Двухосновной фосфат натрия | Sigma | S7907 | |
| Dissection: | |||
| 50 мл флакон с 4% PFA | |||
| Bochem Chemical Spoon 180 мм | Bochem | 230331000 | |
| Тонкие ножницы - Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Пружинные ножницы Noyes | Инструменты для тонкой науки | 15011-12 | |
| Пара пинцетов тонкого (Graefe) | Инструменты для тонкой науки | 11050-10 | |
| Неглубокий стеклянный или пластиковый поднос, примерно 10" x 10" | |||
| Стандартный пинцет | Инструменты для тонкой науки | 11027-12 | |
| Хирургические ножницы - тупые | Fine Science Инструменты | 14000-20 | |
| Нарезка: | |||
| Agar, растение | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s скважинная | |
| пластина Alkali Sci. | TPN1048-NT | ||
| <сильно>Окрашивание: | |||
| AB Среда: | 1n 1,000 мл миллипоры H2O | ||
| Фосфат буферизованный (PB): | |||
| Монооснование фосфата калия | Sigma | P5655 | |
| Фосохат натрия | Диосновные Sigma | S7907 | |
| BSA (Бычий сывороточный альбумин) | Sigma life science | A2153-100g | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Triton X-100 | Sigma - Aldrich | x100-500ml | |
| Nissl 435/455 | Invitrogen | N21479 | |
| CARS: | |||
| APE пико-изумрудный лазер | Angewandte Physik & Электроник | ||
| Полосовой фильтр GmbH (420-520 нм) | Полосовой фильтр Chroma Technology | HQ470/100m-2P | |
| (500-530 нм) | Полосовой фильтр Chroma Technology | HQ515/30m-2P | |
| (640-680 нм) | Chroma Technology | HQ660/40m-2P | |
| Конфокальный микроскоп | Olympus | FV1000 | |
| Cut Transfer pipet | Fisher | 13-711-7M | |
| дихроичный длинный проход 565 нм | Технология Chroma | 565dcxr | |
| дихроичный длинный проход 585 нм | Технология Chroma | 585dcxr | |
| дихроичный проход 750 нм | Технология Chroma Technology | T750spxrxt | |
| чашка для культуры со стеклянным дном | MatTek | P35G-0-10-C | |
| стеклянная гиря (10 мм x 10 мм стержень боро) | Allen Scientific Стеклянный Inc | ||
| многофотонный короткочастотный эмиссионный фильтр 680 нм | Chroma Technology | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
Ссылки
- Cole, K., Curtis, H. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
- Cole, K. S., Curtis, H. J. Membrane potential of the squid giant axon during current flow. Journal of General P....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
