В этой рукописи мы демонстрируем экспериментальные методы инкапсулирования F-актинового цитоскелета в гигантские одноламеллярные липидные везикулы (также называемые липосомами) и метод формирования биомимикирующего коры F-актинового слоя на внутреннем листке липосомной мембраны.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В пробирке Восстановление актин-цитоскелета внутри гигантских одноцветных везикул
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Актиновый цитоскелет, главный механический механизм в клетке, опосредует многочисленные важные физические клеточные действия, включая клеточную деформацию, деление, миграцию и адгезию. Однако изучение динамики и структуры актиновой сети in vivo осложняется биохимической и генетической регуляцией внутри живых клеток. Чтобы построить минимальную модель, лишенную внутриклеточной биохимической регуляции, актин инкапсулируется внутри гигантских одноламеллярных везикул (ГУВ, также называемых липосомами). Биомиметические липосомы имеют размер клетки и облегчают количественное понимание механических и динамических свойств сети цитоскелетов, открывая жизнеспособный путь для синтетической биологии снизу вверх. Для получения липосом для инкапсуляции используется метод инвертированной эмульсии (также называемый методом переноса эмульсии), который является одним из наиболее успешных методов инкапсуляции сложных растворов в липосомы для подготовки различных систем, имитирующих клетки. С помощью этого способа во внутренний буфер добавляют интересующую смесь белков, которую позже эмульгируют в фосфолипидсодержащем растворе минерального масла с образованием монослойных липидных капель. Желаемые липосомы образуются из монослойных липидных капель, пересекающих липидно-масляно-водный интерфейс. Этот метод позволяет инкапсуляцию концентрированных актиновых полимеров в липосомы с желаемыми липидными компонентами, прокладывая путь для восстановления in vitro биомикирующей цитоскелетной сети.
Введение
Актиновый цитоскелет играет фундаментальную роль в построении внутриклеточной архитектуры клетки путем координации сократимости на молекулярном уровне и генерации силы 1,2,3. В результате он опосредует многочисленные важные клеточные активности, включая клеточную деформацию 4,5, деление6, миграцию 7,8 и адгезию9. Восстановление актиновых сетей in vitro привлекло огромное внимание в последние годы
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Приготовление буферов и белковых растворов
- Готовят водный буфер внутренней неполимеризации (INP) в общем объеме 5 мл путем смешивания 0,1 мМCaCl2, 10 мМ HEPES (рН 7,5), 1 мМ DTT, 0,5 мМ Dabco, 320 мМ сахарозы и 0,2 мМ АТФ.
- Приготовьте белковую смесь (PM), добавив белки в буфер INP при 4 °C со следующими концентрациями: 11,2 мкМ нефлуоресцентный G-актин, 2,8 мкМ флуоресцентно меченый актин и 0,24 мкМ Arp2/3 (Таблица материалов). Чтобы сформировать слой F-актина, добавьте к PM 100 нМ гельсолина, 4 мкМ кофилина и 2,2 мкМ VCA-His. В качестве контрольного эксперимента замените ТЧ флуоресцентным красителем ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Получение липосом на основе метода инвертированной эмульсии проиллюстрировано графически и схематично на фиг.1.
Во-первых, были получены пустые (голые) липосомы (~5-50 мкм в диаметре), которые состояли из фосфолипида (EPC) и флуоресцентного липида (DHPE). Яркий, далеко красный флуоресцентный краситель был инкапсулирован в голые липосомы в качестве контрольного эксперимента. Успешно ли липидный монослой сформировался в периферической части капли, можно определить, .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Несколько ключевых шагов определяют успешность высокого выхода липосом в процессе приготовления. Чтобы полностью растворить липидную пленку в масле, образец необходимо обрабатывать ультразвуком до тех пор, пока липидная пленка на дне стеклянного флакона полностью не исчезнет. После обработки ультразвуком липидно-масляную смесь необходимо хранить в течение ночи при комнатной температуре в темных условиях, чтобы молекулы липидов рассеялись дальше29. Смесь можно хранить при температуре 4 °C до недели.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Мы признаем финансирование ARO MURI W911NF-14-1-0403 для M.P.M., Национальных институтов здравоохранения (NIH) R01 1R01GM126256 для M.P.M., Национальных институтов здравоохранения (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 и Human Frontiers Science Program (HFSP) номер гранта RGY0073/2018 для M.P.M. Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, принадлежат авторам (авторам) и не обязательно отражают взгляды ARO, NIH или HFSP. С.К. отмечает плодотворные беседы с В. Ядавом, К. Муресаном, С. Амири.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1,2-диолеол-sn-глицеро-3-{[n(5-амино-1-карбоксипентил)иминодиуксусная кислота]сукцинил} никелевая соль (DOGS-NTA-Ni) | Avanti Polar Lipids Inc. | 231615773 | Никелевый липид |
| 1,4-диазабицикло[2.2.2]октановое число | Sigma | D27802-25G | DABCO |
| Actin белок (>99% чистоты): скелетные мышцы кролика | Cytoskeleton, Inc | AKL99-D | нефлуоресцентный G-актин |
| Актин белок (родамин): скелетные мышцы кролика | Cytoskeleton, Inc | AR05 | флуоресцентно меченный актин |
| Аденозин 5′-трифосфат Гидрат соли динатрия | Sigma | A2383-10G | ATP |
| Alexa Fluor 647 краситель | Флуоресцентный краситель | ThermoFisher | |
| Andor iQ3 | Andor Technologies | программное обеспечение для управления и сбора данных для конфокального микроскопа | |
| Arp2/3 Белковый комплекс: Porcine Brain | Cytoskeleton, Inc | RP01P-A | Arp 2/3 |
| Дигидрат хлорида кальция | Sigma | 10035048 | CaCl2 |
| Chamlide Chambers (4-луночный для круглого покровного стекла 12 мм) | Quorum Technologies | инкубационная камера | |
| Cofilin белок: человеческий рекомбинантный | цитоскелет, Inc | CF01-C | кофилиновый |
| конфокальный микроскоп (63&кратный масляный иммерсионный объектив) | Andor Technologies | LEICA DMi8 | |
| D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA | Sigma | G7528 | глюкоза |
| Дитиотреитол | DOT Scientific | DSD11000-10 | |
| DTT Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant | Cytoskeleton, Inc | HPG6 | gelsolin |
| Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 &; L, цементированная игла, 22 г, 2" конический наконечник | Cole-Parmer | UX-07940-53 | стеклянный шприц |
| HEPES | AmericanBio | 7365-45-9 | |
| ImageJ/Fiji | https://imagej.net/tutorials/ | ||
| L-альфа-фосфатидилхолин | Avanti Polar Lipids Inc. | 97281442 | EPC |
| Магния хлорид | Sigma | 7786303 | MgCl2 |
| Mineral oil, BioReagent, для молекулярной биологии, легкое масло | Sigma | 8042475 | минеральное масло |
| N-WASP fragment WWA (aa400– 501, VCA-His) | VCA-His очищается с использованием лабораторного протокола. Протокол может быть предоставлен по обоснованным запросам | ||
| Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoil-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) | Thermo Fisher | O12650 | DHPE |
| Potassium chloride | Sigma | 7447407 | KCl |
| Sucrose | Sigma | 57-50-1 | сахароза |
| бета;-казеин из коровьего молока | Sigma | C6905-250MG |
Ссылки
- Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 486-498 (2015).
- Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Jour....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
