Методическая статья

Неразрушающая оценка плотности региональных клеток в опухолевых агрегатах после медикаментозного лечения

DOI:

10.3791/64030

⸱

21 июня 2022 г.

 ,  ,  , 
1Rensselaer Polytechnic Institute, 2Albany Medical College

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол разрабатывает основанный на изображениях метод быстрого, неразрушающего и безметочного измерения плотности и жизнеспособности региональных клеток в 3D-опухолевых агрегатах. Результаты показали градиент плотности клеток с более высокой плотностью клеток в основных областях, чем во внешних слоях в развивающихся агрегатах, и преимущественно периферической гибелью клеток в агрегатах HER2+, обработанных Трастузумабом.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модели многоклеточных сфероидов опухолей (MCTS) продемонстрировали растущую полезность для изучения in vitro прогрессирования рака и открытия лекарств. Эти относительно простые аваскулярные конструкции имитируют ключевые аспекты опухолей in vivo , такие как 3D-структура и патофизиологические градиенты. Модели MCTSs могут дать представление о поведении раковых клеток во время развития сфероидов и в ответ на лекарства; однако их необходимый размер резко ограничивает инструменты, используемые для неразрушающей оценки. Структурная визуализация оптической когерентной томографии и программное обеспечение для 3D-анализа Imaris исследуются для быстрого, неразрушающего и безметочного измерения плотности региональных клеток в MCTS. Этот подход используется для оценки MCTS в течение 4-дневного периода созревания и в течение длительного 5-дневного лечения Трастузумабом, клинически значимым анти-HER2 препаратом. Вкратце, MCTS рака молочной железы AU565 HER2+ были созданы с помощью жидкого наложения с добавлением matrigel или без добавления Matrigel (базальная мембранная матрица) для изучения агрегатов различных морфологий (более толстые, дископодобные 2.5D агрегаты или плоские 2D-агрегаты, соответственно). Плотность клеток во внешней области, переходной области и внутреннем ядре характеризовалась в зрелых MCTS, выявляя градиент плотности клеток с более высокой плотностью клеток в основных областях по сравнению с внешними слоями. Добавление матрицы перераспределяло плотность клеток и усиливало этот градиент, уменьшая плотность внешней зоны и увеличивая уплотнение клеток в ядрах. Плотность клеток количественно определяли после лечения препаратом (0 ч, 24 ч, 5 дней) в прогрессивно более глубоких 100 мкм зонах для оценки потенциальных региональных различий в лекарственном ответе. К конечной временной точке почти вся гибель клеток, по-видимому, была ограничена внешними 200 мкм каждой совокупности, в то время как клетки, более глубокие в совокупности, оказались в значительной степени незатронутыми, что иллюстрирует региональные различия в ответе на лекарство, возможно, из-за ограничений в проникновении лекарств. Текущий протокол предоставляет уникальную технику для неразрушающей количественной оценки плотности региональных клеток в плотных клеточных тканях и измерения ее продольно.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследователи в значительной степени обратились к настольным системам 3D-культур in vitro для изучения некоторых ключевых особенностей прогрессирования опухоли. Большая часть этих исследований была проведена повторным появлением многоклеточных сфероидов опухолей (MCTS) и более сложных органоидов 1,2. Хотя эти модели являются аваскулярными, они обеспечивают мощный инструмент для рекапитуляции физиологических и патологических процессов, которые происходят in vivo 3,4,5. В частности, модели среднего размера (диаметр 300-500 мкм) могут имитировать ключевые особенности опухоли, такие как 3D-структура, патофизиологические градиенты и метастатическая сигнализация из-за гипоксии в ядре. Хорошо задокументировано, что эти модели отображают характерные концентрические слои, наблюдаемые в васкуляризованных опухолях in vivo, а именно внешний слой пролиферативных клеток, переходный слой стареющих/покоящихся клеток и клетки, испытывающие гипоксию в ядре 3,6,7,8,9 . Уникальное понимание может быть получено из этих моделей, характеризуя поведение клеток в этих слоях, во время разработки и в ответ на препарат. Однако необходимый размер MCTS, необходимый для разработки градиентов, которые делают их такими мощными моделями in vitro, резко ограничивает инструменты, используемые для неразрушающей оценки. Действительно, одной из самых больших проблем с неразрушающим анализом MTCS является количественная оценка деталей клеточного масштаба. Ярко-полевая и фазово-контрастная микроскопия обычно используются для неразрушающей оценки роста и развития 3D-MCTS. Однако эти модальности ограничены 2D-проекциями, не имея возможности визуализировать важнейшую 3D-структуру этих моделей 10,11,12,13. Информация о цитотоксичности и пролиферации клеток обычно собирается с помощью флуоресцентной визуализации (т.е. микроскопии светового листа, конфокальной микроскопии) или иммуногистологического окрашивания ex vivo 14,15,16. Хотя эти подходы предоставляют ценную информацию с высоким разрешением о структуре ткани, клеточной плотности и клеточной функции, они часто требуют подготовки образцов, такой как оптическая очистка, фиксация / окрашивание или встраивание, которое предотвращает продольный анализ.

Оптическая когерентная томография (ОКТ) является неразрушающей структурной визуализацией, которая может преодолеть некоторые из проблем, упомянутых выше. Он может похвастаться сотовым разрешением и достаточно широким полем зрения (до 10 мм х 10 мм), способным визуализировать целые многоклеточные агрегаты 17,18,19. Важно отметить, что из-за видимого характера используемого света эта техника полностью неразрушающая и без меток17. Кроме того, образцы могут быть визуализированы in situ без необходимости пробоподготовки, так что образцы могут быть взяты прямо из инкубатора, быстро отсканированы с помощью OCT (продолжительность сканирования ~ 5-10 мин), а затем возвращены в инкубатор, что позволяет продольную характеристику. В последнее время появилось много исследований, направленных на использование ОКТ для анализа поведения сфероидов опухоли. В одной из самых захватывающих демонстраций Huang et al. использовали OCT для неразрушающего обнаружения некротических ядер в больших опухолевых сфероидных моделях, отметив, что области живых и мертвых клеток обладают заметными различиями в оптическом затухании, которые могут быть использованы для мониторинга жизнеспособности без меток20. Аналогичным образом, Hari et al. провели измерения показателя преломления (RI) сфероидов рака толстой кишки человека (HCT116), изображенных с помощью OCT, для изучения наличия гипоксии в образцах21. Их измерений было недостаточно для прямых выводов, хотя они наблюдали более низкий RI в местах, которые коррелировали с участком, хотя и не размером, некротических ядер, позже идентифицированных с помощью конфокальной микроскопии. Abd El-Sadek et al. использовали OCT для визуализации и количественной оценки региональной тканевой жизнеспособности моделей опухолей рака молочной железы22. Они сообщили о двух методах визуализации динамики тканей на основе OCT и показали умеренную корреляцию между различиями в этих показателях и идентифицированными микроскопией областями живых / мертвых клеток.

Наша опубликованная работа с использованием OCT основана на этой предыдущей литературе, чтобы установить количественный, неразрушающий подход к измерению морфологии 3D и количества клеток в моделях рака молочной железы MCTS во время разработки10,23. Используя программное обеспечение для анализа изображений Imaris 3D для подсчета количества объектов размером с клетку (т. Е. Пятен), изображенных в рамках сканирования объема OCT, количество клеток было неразрушающе измерено в MCTS, которые были статистически аналогичны тем, которые были определены с помощью гемоцитометра при совокупной диссоциации. Однако из-за структурной природы ОКТ клеточные мембраны, все еще присутствующие после гибели клеток в результате некроза, могут ошибочно считаться живыми клетками. Кроме того, эта характеристика была расширена для неразрушающего отслеживания жизнеспособности клеток в отдельных агрегатах, подвергшихся лекарственному режиму с многообещающим успехом10. Важно отметить, что аналогичная жизнеспособность клеток была сообщена из нашего подхода OCT-Imaris с тем, что было бенчмаркировано в этих образцах при диссоциации. Этот неразрушающий и безметочный подход к ячейкам позволяет подсчитывать ячейки в рамках 3D-конструкций и плотных агрегатов продольно без ущерба для конструкции / агрегатной структуры.

В настоящей работе сообщается об улучшенном подходе к непосредственной количественной оценке региональной плотности клеток в плотных агрегатах путем использования способности OCT-Imaris измерять как 3D-агрегированную морфологию, так и количество клеток. Это методологическое достижение обеспечивает более подробную картину пространственного распределения и пролиферации клеток в характерных концентрических слоях моделей MCTS. Вместо того, чтобы просто вычислять общую среднюю совокупную плотность клеток, такие локальные измерения плотности могут выявить градиенты плотности клеток, такие как те, которые связаны с уплотнением. Эта региональная оценка также применяется к агрегатам, получавшим химиотерапевтическое средство, для оценки регионального лекарственного ответа, измеряемого изменениями местной плотности клеток. Эта комбинация OCT и передовых методов анализа изображений обеспечивает количественную оценку жизнеспособности региональных клеток, которая может быть использована для изучения проникновения лекарств на основе того, какие области испытывают снижение плотности клеток. Это первый отчет, в котором неразрушающе количественно оценивается плотность и жизнеспособность региональных клеток в ответ на препарат в плотных клеточных тканях и измеряется его продольно. Такая характеристика трехмерной плотности клеток и пространственного распределения по всем MCTS может помочь оптимизировать доставку лекарств при лечении рака и улучшить понимание прогрессирования модели рака.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для настоящего исследования использовались клеточные линии рака молочной железы AU565 (HER2+) и MDA-MB-231 (см. Таблицу материалов).

1. Подготовка опухолевых агрегатов

  1. Приготовьте AU565 (HER2+) среду роста клеток рака молочной железы с использованием базальной среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (+) в L-глютамине, дополненном 10% (v/v) фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллином/стрептомицином (см. Таблицу материалов).
  2. Приготовьте MDA-MB-231 тройную негативную среду роста клеток рака молочной железы с использованием модифицированной среды Орла (DMEM) от Dulbecco, дополненной 10% (v/v) фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина и 2 мМ L-глутамина (см. Таблицу материалов).
  3. Готовят 70%-90% сливающихся клеточных культур обеих клеточных линий (~3-4 дня приготовления) в стандартных условиях (37 °C, 5% CO2, 95% относительной влажности). Отделяйте клеточные монослои от колб для культивирования стандартным методом трипсинизации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предотвращать чрезмерное воздействие клеток на трипсин, влияя на их жизнеспособность.
    1. Для ячеек AU565 аспирировать клеточные среды из колбы с помощью пипетки (или, при наличии, с помощью вакуумного насоса, подключенного через трубку к наконечнику автоклавной стеклянной пипетки) и заменить 2 мл трипсина-ЭДТА. Оставьте колбу на 3 мин при комнатной температуре, а затем переместите в инкубатор еще на 4 минуты. После этого добавьте 6 мл питательной среды в колбу, чтобы нейтрализовать трипсин.
    2. Для клеток MDA-MB-231 аспирируют клеточные среды из колбы таким же образом, как это выполнено на этапе 1.3.1, и заменяют 1,5 мл трипсина-ЭДТА. После 7 мин инкубации добавьте в колбу 8,5 мл питательной среды, чтобы нейтрализовать трипсин.
  4. Добавляют 10 мкл клеточной суспензии к гемоцитометру для определения количества клеток в суспензии24. Повторное суспендирование клеток в средах при желаемой концентрации 2,5 × 105 клеток/мл.
  5. Дозируйте 50 мкл клеточной суспензии в каждую лунку круглодонной, неадгезионной, 96-луночной пластины. Для суспензий, приготовленных без Матригеля (матрица базальной мембраны, см. Таблицу материалов), добавляют 50 мкл простой среды роста в каждую лунку.
    1. Для суспензий, приготовленных с помощью матрицы базальной мембраны, извлеките флакон с матрицы из хранилища при температуре -20 °C и поместите его в холодильник для размораживания на ночь. Подготовьте контейнер со питательной средой и поставьте в холодильник на 10 минут до охлаждения.
    2. Используя замороженный наконечник пипетки, добавьте матрицу в охлажденную среду таким образом, чтобы конечная концентрация этого раствора составляла 5%. Добавьте 50 мкл этой среды в каждую скважину, чтобы конечная концентрация матрицы в этих скважинах составляла 2,5%3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В предыдущей работе агрегированная морфология была оценена для этих клеточных линий10,25 и обнаружено, что агрегаты MDA-MB-231 образуют сфероиды с добавлением мембранной матрицы, в то время как культуры MDA-MB-231 без матрицы и AU565+/- матрицы образуют дискообразные агрегаты. Количественная сферичность >0,8 по шкале от 0 (плоскость) - 1,0 (идеальная сфера) использовалась для идентификации достаточно сферических агрегатов и, таким образом, ожидалось, что она будет иметь необходимое отношение поверхности к объему для in vivo-подобного поведения26,27.
  6. Центрифугируйте пластины при 123 х г в течение 10 мин при комнатной температуре сразу после посева, чтобы обеспечить сбор ячейки гранулы на дне каждой скважины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен происходить как можно быстрее после посева. Авторы отметили, что слишком много времени между этими этапами позволяет клеткам оседать по дну и сторонам каждой скважины, подавляя их способность собирать и агрегировать на дне скважины.
  7. Инкубируйте пластины в течение 4 дней, после чего клеточные агрегаты считаются зрелыми.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Агрегаты AU565, приготовленные с базальной мембранной матрицей, требуют дополнительного 5-дневного периода культивирования для исследования лекарственного ответа (всего 9 дней, изменение среды на 4-й день).

2. Введение Трастузумаба (TZM) в клеточные агрегаты AU565

  1. Приготовьте 500 мкг/мл раствора TZM (см. Таблицу материалов) в питательных средах AU565. На 4-й день добавьте 10 мкл этого раствора в каждую лунку, чтобы конечная концентрация в каждой скважине составляла 50 мкг/мл.
  2. Культура агрегируется в течение 5 дополнительных дней после добавления TZM и оценивается в ключевые моменты времени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования для анализа препарата использовались временные точки 0 ч (непосредственно перед введением препарата), 24 ч и 120 ч после приема препарата.

3. Оптическая когерентная томография

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы в настоящем описании визуализировали с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ) в течение каждого дня созревания (1-4), а затем снова на 5-й день (24 ч после добавления препарата) и 9-й день (120 ч после добавления препарата) для выбранных лекарственных агрегатов. Для текущего исследования была использована коммерческая система спектрально-доменной оптической когерентной томографии (SDOCT, см. Таблицу материалов) для визуализации OCT. Хотя этот подход подходит практически для любой системы OCT, и процедура, применяемая в целом, будет одинаковой между различными системами, некоторые из последующих подробных шагов специфичны для настоящего оборудования.

  1. Используйте систему OCT для структурной визуализации. Установите скорость A-сканирования на 5,5 кГц для сбора изображений с высоким разрешением. Установите показатель преломления равным 1,33 для образцов в жидкой среде. Установите размер вокселя равным 1,10 x 1,10 x 2,58 мкм3.
  2. В окне Параметры изображения в правой части экрана задайте поле зрения (FOV), введя значения X, Y и Z (в мм) таким образом, чтобы образец находился в этой интересующей области.
    ПРИМЕЧАНИЕ: FOV для этих исследований обычно устанавливался на 1,5 x 1,5 x 0,5 мм3. Убедитесь, что образец помещается в эту область, чередуя входные данные «Угол» от 0 до 90 градусов и выполняя визуальное подтверждение.
  3. Выберите Режим 3D-сбора, а затем нажмите кнопку «Запись », чтобы собрать 3D-сканирование тома образца.

4. Анализ изображений

  1. Экспортируйте файл OCT в формат программного обеспечения (Imaris, см. Таблицу материалов).
    1. Откройте файл центра развертывания Office в пакете средств разработки программного обеспечения. Нажмите «Экспорт», установите тип файла .jpg и экспортируйте изображения в пустую папку.
    2. Откройте программное обеспечение для обработки изображений (FIJI, см. Таблица материалов) и импортируйте последовательность изображений из папки, в которой хранятся экспортированные JPEG-файлы. Используйте программное обеспечение для сшивания последовательности изображений, а затем сохраните этот файл как изображение TIFF.
  2. Создайте реконструкцию тома, выполнив следующие действия.
    1. Откройте Imaris и перейдите к преобразованному файлу TIFF в Arena. Перейдите в раздел Редактирование > Свойства изображения и введите размер вокселя (в мкм) из изображения центра развертывания Office в соответствующие поля XYZ. Затем нажмите OK.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В дереве образцов объектов в левой части экрана снимите флажок Громкость , чтобы предотвратить задержку программного обеспечения.
    2. Нажмите кнопку Добавить новые поверхности над деревом объектов. В меню под деревом нажмите Пропустить автоматическое создание и отредактируйте вручную. В окне Настройка дисплея вручную сдвиньте красные и черные стрелки, чтобы повысить контраст между образцом и фоном и улучшить визуализацию образца.
    3. Отрегулируйте положение «Среза» на срез на одном краю образца, т. е. там, где впервые появляется сигнал образца. С помощью клавиши escape переключите мышь из режима навигации в режим Выбора, а затем нажмите кнопку Нарисовать. Вручную проследите контур области, отображающей сигнал.
    4. Переместите положение фрагмента, введя следующую позицию в поле ввода. Эта следующая позиция должна быть ≤100 кусочков дальше в образец, чем предыдущая. Вручную отследите область, отображающую сигнал.
    5. Повторяйте этап 4.2.4 по толщине образца до тех пор, пока не будет достигнут противоположный край образца. Затем нажмите «Создать поверхность» в меню слева, чтобы сшить эти фрагменты вместе и завершить реконструкцию тома.
    6. Нажмите «Редактировать», а затем выберите «Выбор маски». При этом в окне Настройка дисплея будет создан новый канал, содержащий только изолированный образец. Морфологические характеристики выборки теперь можно найти во вкладке Статистика > Подробно .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот подход использовался для определения сфер и объемов, о которых сообщалось в рамках настоящего исследования.
  3. Получите общую плотность клеток образца, выполнив следующие действия.
    1. Над деревом объектов выберите Добавить новые пятна. В меню Параметры алгоритма снимите флажки со всех полей. Нажмите на синюю стрелку , чтобы перейти на экран Исходного канала.
      1. В появившемся раскрывающемся меню выберите замаскированный канал, созданный на шаге 5.2.8, обычно называемый каналом 2. Введите средний диаметр ячейки для образца в поле диаметра XY. Убедитесь, что установлен флажок Фоновое вычитание .
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой работы с ячейками AU565 и MDA-MB-231 диаметр был установлен на 10 мкм. Этот выбор основан на размере ячейки (описано в разделе Обсуждение).
    2. Нажмите на синюю стрелку , чтобы перейти на экран Классификация пятен . На графике в нижней части меню щелкните и перетащите левый край желтого порога к левому краю графика, чтобы все объекты были включены в желтый затененный порог. Затем нажмите на зеленую стрелку , чтобы завершить создание пятна.
    3. Получите количество идентифицированных объектов (т. Е. Количество ячеек выборки), щелкнув Статистика > Общее > Общее количество мест.
    4. Чтобы определить среднюю плотность клеток агрегата, разделите количество ячеек агрегата (измеренное на этапе 4.3.3) на совокупный объем (определенный на этапе 4.2.6).
  4. Оценка региональной плотности в концентрических слоях сферических агрегатов (Рисунок 1А).
    1. После морфологического анализа и анализа плотности клеток оценивают региональную плотность. Щелкните поверхность, созданную на шаге 4.2.5, и перейдите на вкладку Стиль/Качество поверхностей . Измените выделение на Центральную точку и измените ширину пикселя на ≤20 для лучшей видимости. Перейдите в раздел Статистика > Подробные > Положение и запишите местоположение центрального места.
    2. Выберите «Добавить новую систему отсчета» в меню над деревом объектов. Установите флажки Видимый и Исправить рядом с XY в меню. Щелкните и перетащите центр значка системы отсчета так, чтобы он находился на одной линии с центральным пятном. Снимите флажки XY Visible и Fix и выберите их для XZ.
      1. Еще раз щелкните и перетащите центр значка системы отсчета так, чтобы он находился на одной линии с центральным пятном. Наконец, повторите это для плоскости YZ, чередуя эти три фиксированные плоскости до тех пор, пока система отсчета идеально не выровняется с центральным пятном. Дважды щелкните систему отсчета в дереве объектов и переименуйте ее в Центральную или Аналогичную.
    3. Нажмите на пятна, созданные на шаге 4.3, и перейдите в раздел Статистика > Подробная > система отсчета позиций. Нажимайте на Позицию X Система отсчета , пока она не отобразится от самого высокого до самого низкого значения. Запишите наибольшее значение - это указывает на самый дальний край образца, т.е. радиус выборки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку образцы, используемые здесь, являются круговыми в плоскости XY, вычисления могут быть выполнены вдоль оси X или Y с аналогичными результатами. Для образцов, которые не проявляют X-Y симметрии (асимметричная, эллипсоидная, неправильная геометрия и т.д.), рекомендуется выполнять эти анализы по нескольким осям.
    4. Перейдите в раздел Статистика. В правом нижнем углу меню нажмите «Экспортировать всю статистику в файл» и сохраните данные в электронную таблицу.
    5. Выполняйте ручные вычисления для идентификации концентрических слоев вдоль оси X.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы, использованные в данном исследовании, имели диаметр приблизительно 500 мкм; таким образом, существуют две внешние концентрические зоны толщиной 200 мкм и одна внутренняя центральная зона толщиной 100 мкм. Рекомендуется поддерживать зоны толщиной 200 мкм, поскольку ожидается, что поведение диффузии изменится на этом расстоянии 7,28,29,30. В соответствии с этим рассуждением также рекомендуется использовать больше концентрических зон для больших образцов и наоборот для меньших образцов.
    6. Установите область внешнего слоя 200 мкм, вычитая 200 мкм из внешнего радиуса, найденного на шаге 4.4.3. Таким образом, внешняя область будет охватывать пятна с X-позициями междурадиусом X и Xвнешним, внутренним краем (рисунок 1A, оранжевая область).
    7. Установите переходную область, вычитая 200 мкм из Xвнешнего, внутреннего края. Переходная область будет охватывать пятна с X-позициями между Xвнешним, внутренним краем и Xпереходным, внутренним краем (рисунок 1A, розовая область).
    8. Установите центральную область ядра, охватывающую оставшиеся пятна между центром выборки иX переходным, внутренним краем (рисунок 1A, синяя область).
    9. Откройте сохраненный файл электронной таблицы, созданный на шаге 4.4.4. Перейдите на вкладку Расстояние от исходной опорной системы.
    10. Рассчитайте количество пятен в основной области с помощью функции ' COUNTIF (Столбецx, "< Xпереходный, внутренний край"), где Столбецx - это столбец 'Расстояние от исходной системы отсчета'. Результирующее значение представляет собой номер ячейки в этой области. Разделите это значение на объем области, чтобы получить плотность ячейки.
    11. Аналогичным образом вычислите количество ячеек в переходной области, используя 'COUNTIF (Столбецx, "< Xвнешний,внутренний край") - COUNTIF(Столбецx, "> Xпереходный,внутренний край").
    12. Рассчитайте количество ячеек во внешней области, используя 'COUNTIF (столбецx,"> Xпереходный,внутренний край").
  5. Оцените плотность региональных клеток в несферических образцах с помощью «региональных пробок» (рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для несферических образцов, не имеющих концентрических слоев, разработан метод "Regional Plug" для отбора проб локальной плотности клеток на различных радиальных глубинах по всему агрегату.
    1. Повторите шаги 4.4.1-4.4.3, чтобы установить центральную систему отсчета (рисунок 1B, центральный желтый круг) и получить общий радиус выборки.
    2. Выполните ручные расчеты для определения размещения систем отсчета в пределах переходной и внешней областей таким образом, чтобы плотность клеток могла быть оценена в образце в этих местах.
      1. Чтобы вычислить внешнее местоположение, вычтите 50 мкм из значения радиуса выборки из шага 4.5.1 и используйте это значение в качестве положения X.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одни и те же значения положения Y и Z, записанные на шаге 4.5.1 для всех вилок в данном образце, для измерения плотности ячеек вдоль оси X образца (рисунок 1B, крайний левый желтый круг).
      2. Над деревом объектов нажмите « Добавить новые пятна» и нажмите «Пропустить автоматическое создание», «Редактировать вручную». Наведя указатель в режиме «выбрать», удерживайте клавиши SHIFT+ЩЕЛЧОК, чтобы поместить место на экране. В меню слева введите значения позиции XYZ, рассчитанные выше. Отрегулируйте диаметры XY и Z до ≤20 для лучшей видимости.
      3. Повторите шаг 4.4.2, чтобы добавить систему отсчета в этом месте. Переименуйте эту систему отсчета во внешнем дереве объектов или аналогичном.
      4. Чтобы вычислить переходное (среднее) местоположение, найдите среднее значение значенияцентральной позиции X и значениявнешней позиции X. Используйте это значение в качестве позиции X для переходной системы отсчета. Как указано выше, используйте одни и те же значения Y и Z, записанные на шаге 4.5.1 для всех вилок в данном образце, чтобы измерить плотность ячеек вдоль оси X образца (рисунок 1B, средний желтый круг).
      5. Повторите шаг 4.4.2, чтобы поместить среднюю систему отсчета в это место, переименовав ее в «переходную» или аналогичную после создания.
    3. Нажмите на места, созданные на шаге 4.3, и перейдите в раздел Статистика. В правом нижнем углу меню нажмите «Экспортировать всю статистику в файл» и сохраните данные в электронную таблицу.
    4. Откройте электронную таблицу. Перейдите на вкладку Расстояние от исходной опорной системы. Расстояние каждого объекта до систем отсчета показано в столбце A, а группировка систем отсчета для каждого объекта показана в столбце G. Используйте функцию 'MOD' для численного присвоения каждого расстояния соответствующей системе отсчета, где 0 - центральная рамка, 1 - переходная, а 2 - внешняя.
    5. Отфильтруйте значения в этом столбце для работы с расстояниями в каждой системе отсчета. Для каждой из систем отсчета рассчитайте количество объектов в пределах 50 микрометров от кадра с помощью функции 'COUNTIF (Столбецx, "≤50"), где Столбецx — столбец 'Расстояние от исходной системы отсчета' для каждой группы. Результирующее значение соответствует количеству ячеек в этой региональной заглушке. Разделите это значение на объем 100-мкм пробки, чтобы получить плотность ячейки.
  6. Выполните метод пространственно-уточненной региональной вилки (рисунок 1С).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот подход был использован для оценки жизнеспособности региональных клеток в ответ на применение препарата. Включение большего количества систем отсчета улучшает разрешение плотностей ячеек, которые могут быть рассчитаны по всей толщине модели.
    1. Повторите шаги 4.4.1-4.4.3, чтобы установить центральную систему отсчета (рисунок 1С, центральный желтый круг) и получить радиус образца.
    2. Выполните ручные вычисления для определения дополнительных мест, представляющих интерес. Для этого добавьте 100 мкм кцентральному значению X, а затем используйте значения Y и Z центральной точки для определения первого местоположения вдоль центральной оси. Добавьте систему отсчета в это положение, как показано на шаге 4.4.2 (рисунок 1C, желтый круг, прилегающий к центральному кругу).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте меньше мкм на этом шаге, если вы ищете более высокое разрешение для отслеживания плотности.
    3. Повторите шаги 4.6.2, добавив 100 мкм (или желаемое число мкм) к каждому последовательному X-расположению, чтобы установить ось равноразмерных пробок через толщину образца. Поместите последнюю систему отсчета ≤50 мкм от внешнего радиуса образца (рисунок 1C, желтые круги).
    4. Повторите шаги 4.5.3-4.5.5, чтобы получить количество ячеек в каждой пробке диаметром 100 мкм. Разделите эти значения на объем каждой соответствующей пробки, чтобы получить локальную плотность ячеек.
    5. Повторите все шаги в этом разделе для данных OCT, собранных в каждой точке испытания препарата. Сравнение количества клеток в каждом месте через курс времени лечения должно выявить, где плотность клеток уменьшается (т. Е. Области, испытывающие гибель клеток) и, следовательно, насколько глубоко проникает препарат (т. Е. В каких слоях наблюдается падение плотности клеток по сравнению с теми, которые поддерживают или демонстрируют увеличение уровней плотности клеток).

figure-protocol-1
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация. (A) Концентрический слой (оболочки) для оценки плотности региональных клеток в сферических агрегатах. (B) Региональный метод пробки был разработан для оценки локальной плотности клеток в несферических агрегатах, где небольшие (диаметр 100 мкм) сферические пробки (показаны желтым цветом) используются в качестве индикаторов плотности в каждой зоне/толщине. (C) Для исследований проникновения наркотиков используется пространственно-уточненный региональный метод пробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В предыдущей публикации был установлен метод неразрушающего измерения глобальной плотности клеток в клеточных агрегатах с использованием OCT10. При этом этот метод расширен для оценки региональной плотности клеток развивающихся клеточных агрегатов. На рисунке 1 показана схема этого расширения, где плотность клеток может быть оценена в концентрических слоях сфероида или более локально, глядя вместо этого на небольшие (диаметром 100 мкм) сферические пробки, обозначенные...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Значение
Многоклеточные сфероиды опухолей (MCTS) являются мощными 3D-моделями in vitro для изучения прогрессирования опухоли и скрининга лекарств 1,2,3. Продвижение полезности этих относительно простых агрегированных моделей в значительной степени зависит от характеристики их ключевых особенностей, таких как морфология и плотность клеток, которые, как известно, влияют как на прогрессирование опухолев...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано NIH R01 BRG CA207725 (MB/DTC) и NIH R01 CA233188 (MB). Мы хотели бы поблагодарить AMC Pharmacy за Трастузумаб, предоставленный для этих экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
96 луночных планшетовGreiner Bio-One 650970CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0,25% трипсина, 2,21 мМ ЭДТАCorning25-053-CI
AU565 клетки рака молочной железыATCC
Dulbecco's Modified Eagle's MediumCorning10-013-CV
Фетальная сыворотка бычьего скотаATCC30-2020
Программное обеспечение Фиджиоткрытым исходным кодом(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3jЗагружено с https://imagej.net/software/fiji/
ГемоцитометрFisher Scientific0267151B
Программное обеспечение для анализа изображений ImarisBitplaneТекущая версия 9.8
L-глутаминLonza17-605E
MatrigelCorning354263
MDA-MB-231 клетки рака молочной железыATCC
МикроскопZeissZ1 AxioVision
Пеницилин стрептомицинCorning30-0002CI
Планшетная центрифугаEppendorf
RPMI среда 1640Gibco11875-085
Spectral Domain Оптический когерентный томографThorLabsTEL220C1
колбах для клеточных культур T75Greiner Bio-One 
В этом исследовании были использованы клинические образцы трастузумаба с остатками трастузумаба
с 658175, щедро подаренные аптекой Медицинского колледжа Олбани.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sutherland, R., JA, M., Inch, W. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).
  2. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  3. Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Analytical Biochemistry. 437 (1), 17-19 (2013).
  4. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
  5. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  6. Jiang, Y., Pjesivac-Grbovic, J., Cantrell, C., Freyer, J. P. A multiscale model for avascular tumor growth. Biophysical Journal. 89 (6), 3884-3894 (2005).
  7. Freyei, J. P., Sutherland, R. M. Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply. Cancer Research. 46 (7), 3504-3512 (1986).
  8. Desoize, B., Jardillier, J. C. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).
  9. Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs. British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).
  10. Roberge, C. L., et al. Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug. Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).
  11. Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).
  12. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  13. Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).
  14. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).
  15. Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).
  16. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  17. Huang, D., et al. Optical coherence tomography HHS public access. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  18. Zhong, H. Q., et al. Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography. Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).
  19. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), (2016).
  20. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).
  21. Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  22. El-Sadek, I. A., et al. Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation. Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844(2021).
  23. Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3D bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomateralia. 95, 357-370 (2019).
  24. Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  25. Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography. Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).
  26. Bellotti, C., Duchi, S., Bevilacqua, A., Lucarelli, E., Piccinini, F. Long term morphological characterization of mesenchymal stromal cells 3D spheroids built with a rapid method based on entry-level equipment. Cytotechnology. 68 (6), 2479-2490 (2016).
  27. Noto, A., et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 is a key factor for lung cancer-initiating cells. Cell Death & Disease. 4 (12), 947(2013).
  28. Riffle, S., Hegde, R. S. Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 36, 102(2017).
  29. Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11, 393-410 (2011).
  30. Grimes, D. R., Kelly, C., Bloch, K., Partridge, M. A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids. Journal of the Royal Society Interface. 11 (92), 20131124(2014).
  31. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  32. Pozzi, S., et al. Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760(2021).
  33. Nguyen, E. H., Daly, W. T., Belair, D. G., Le, N. N., Murphy, W. L. High throughput screening format identifies synthetic mimics of matrigel for tubulogenesis screening. , Available from: https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf (2015).
  34. Duchnowska, R., Szczylik, C. Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab. Cancer Treatment Reviews. 31 (4), 312-318 (2005).
  35. Zazo, S., et al. Generation, characterization, and maintenance of trastuzumab-resistant HER2+ breast cancer cell lines. American Journal of Cancer Research. 6 (11), 2661-2678 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D3D Imaris

Похожие статьи