Методическая статья

Получение частиц ядра нуклеосом в комплексе с факторами репарации ДНК для определения структуры криоэлектронной микроскопии

DOI:

10.3791/64061

⸱

17 августа 2022 г.

 ,  ,  ,  , 
1Genome Integrity and Structural Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем протоколе подробно описывается подготовка нуклеосомных комплексов с использованием двух методов пробоподготовки для замораживания сеток ПЭМ.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Репарация ДНК в контексте хроматина плохо изучена. Биохимические исследования с использованием частиц ядра нуклеосом, фундаментальной повторяющейся единицы хроматина, показывают, что большинство ферментов репарации ДНК удаляют повреждение ДНК с меньшей скоростью по сравнению со свободной ДНК. Молекулярные детали того, как ферменты эксцизионной репарации оснований (BER) распознают и удаляют повреждения ДНК в нуклеосомах, не были выяснены. Однако биохимические данные BER нуклеосомных субстратов свидетельствуют о том, что нуклеосома представляет различные структурные барьеры в зависимости от местоположения поражения ДНК и фермента. Это указывает на то, что механизмы, используемые этими ферментами для удаления повреждений ДНК в свободной ДНК, могут отличаться от тех, которые используются в нуклеосомах. Учитывая, что большая часть геномной ДНК собрана в нуклеосомы, необходима структурная информация этих комплексов. На сегодняшний день научному сообществу не хватает подробных протоколов для выполнения технически осуществимых структурных исследований этих комплексов. Здесь мы предлагаем два метода получения комплекса из двух генетически слитых ферментов BER (полимераза β и эндонуклеаза AP1), связанных с однонуклеотидным промежутком вблизи входа-выхода нуклеосомы для структурного определения с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ). Оба метода пробоподготовки совместимы для остекловывания качественных решеток методом погружной заморозки. Этот протокол может быть использован в качестве отправной точки для получения других нуклеосомных комплексов с различными факторами BER, пионерными факторами транскрипции и ферментами, модифицирующими хроматин.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эукариотическая ДНК организована и уплотнена гистоновыми белками, образуя хроматин. Ядро нуклеосомы (NCP) представляет собой фундаментальную повторяющуюся единицу хроматина, которая регулирует доступность ДНК-связывающих белков для репарации ДНК, транскрипции и репликации1. Хотя первая рентгеновская кристаллическая структура NCP была впервые решена более двух десятилетий назад2 и многие другие структуры NCP были опубликованы с 3,4,5,6, механизмы репарации ДНК в нуклеосомных субстратах еще не очерчены. Раскрытие молекулярных деталей, лежащих в основе репарации ДНК в хроматине, потребует структурной характеристики участвующих компонентов, чтобы понять, как локальные структурные особенности NCP регулируют активность репарации ДНК. Это особенно важно в контексте эксцизионной репарации оснований (BER), учитывая, что биохимические исследования с ферментами BER предполагают уникальные механизмы репарации ДНК в нуклеосомах, которые зависят от специфических для фермента структурных требований для катализа и структурного положения поражения ДНК в нуклеосоме 7,8,9,10,11,12,13 . Учитывая, что BER является жизненно важным процессом репарации ДНК, существует значительный интерес к заполнению этих пробелов, а также к созданию отправной точки, с которой могут быть проведены другие технически осуществимые структурные исследования с участием соответствующих нуклеосомных комплексов.

Крио-ЭМ быстро становится предпочтительным методом для решения трехмерной (3D) структуры комплексов, крупномасштабная подготовка которых однородного образца является сложной задачей. Несмотря на то, что проектирование и очистка NCP в комплексе с фактором репарации ДНК (NCP-DRF), вероятно, потребует индивидуальной оптимизации, представленная здесь процедура создания и замораживания стабильного комплекса NCP-DRF предоставляет подробную информацию о том, как оптимизировать подготовку образца и крио-ЭМ-сетки. Два рабочих процесса (не взаимоисключающие), показанные на рисунке 1, и конкретные детали в протоколе определяют критические шаги и предоставляют стратегии для их оптимизации. Эта работа продвинет область репарации хроматина и ДНК в направлении, где дополнение биохимических исследований структурными исследованиями станет технически возможным для лучшего понимания молекулярных механизмов нуклеосомной репарации ДНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Соберите частицы ядра нуклеосомы с помощью солевого диализа.

ПРИМЕЧАНИЕ: Получение частиц ядра нуклеосом с использованием рекомбинантных гистоновых белков для структурных исследований было подробно описано другими14,15,16. После очистки рекомбинантных гистонов X. laevis и сборки октамера гистонов, описанной другими14,15, и соберите нуклеосомный субстрат, как описано ниже.

  1. Приобретите три олигонуклеотида (перечисленные в таблице 1) в указанном масштабе: UND-197mer, 161mer, 35mer.
    1. PAGE очищает ультрамеры (197mer и 161mer), как описано17.
      1. Эквимолярные количества олигонуклеотидов при отжиге в 1x буфере для отжига (10 мМ Tris-Cl, pH 8,0, 50 мМ NaCl). Например, смешайте 40 мкл 161-мера [166,7 мкМ]; 8 мкл 35-мера [292,4 мкМ]; 16,8 мкл 197-мерной комп-нити [408,2 мкМ]; 10 мкл 10-кратного буфера для отжига и 10,9 мкл dH2O.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно контролировать реакцию отжига с температурным градиентом. Подробную информацию о температурном градиенте см. в таблице 2 .
  2. Выполните мелкомасштабное восстановление (масштаб в 1/57 от примера, показанного ниже для конечного объема 50 мкл), чтобы определить отношение ДНК к октамеру гистонов (типичные начальные соотношения ДНК:октамер следующие: 1:0,9, 1:1,1, 1:1,2, 1:2; показано на рисунке 2A); Крайне важно определить это соотношение эмпирически при небольших реконструкциях.
    1. После того, как это соотношение будет определено, подготовьте масштабное восстановление. Например, смешайте 32,9 мкл ДНК-197.н. [99,4 мкМ]; 1647,1 мкл TE (1x); 1120 мкл 5 М NaCl и 62,3 мкл октамера гистонов WT [2,56 мкМ].
  3. Сделайте диализные буферы: RBнизкий иRB высокий , как описано в таблице 3 и таблице 4 соответственно; Настройте реконструкции, как описано выше14.
    1. Перелейте диализную трубку в стакан свысоким RB и дайте продолжить диализ при осторожном перемешивании в течение 16 часов или до тех пор, пока 2 лRB low не будет перенесен в стакан для отходов.
  4. Перенесите диализную пробирку в стакан объемом 1 л, содержащий буфер RB50 мМ (таблица 5), и дайте образцу диализироваться в течение не менее 3 часов или в течение ночи.
    1. Оцените эффективность восстановления на 6% полиакриламидном неденатурирующем геле, убедившись, что в нем менее 10% свободной ДНК и одна полоса NCP; хранить NCP при температуре 4 °C. См. Рисунок 2A (полоса 5) и Рисунок 2B для репрезентативных оптимальных результатов восстановления.

2. Подготовьте комплекс факторов репарации НКП-ДНК (NCP-DRF)

  1. Очистка препаративно-гельным электрофорезом
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод является наиболее трудоемким (из двух описанных), и хотя он эффективен при удалении высокомолекулярных (HMW) видов (Рисунок 6А) из-за высокого коэффициента разбавления это может привести к некоторой разборке, как показано на рисунке Рисунок 7А (NCP prep cell out lane), высвобождая ДНК. Тем не менее, до 25% свободной ДНК по-прежнему совместимы с крио-ЭМ-исследованиями. Из-за высокого разбавления используйте этот метод для очистки только NCP, а не всего комплекса.
    1. Приготовьте 70 мл 6% неденатурирующего раствора полиакриламидного геля в 0,2x TBE, используя раствор полиакриламидного геля 37,5: 1, акриламид: бисакриламид. Налейте цилиндрический гель с внешним радиусом 28 мм и полимеризуйте в течение ночи.
    2. Соберите аппарат для работы препаративного геля, используя диализную мембрану с отсечкой МВт 6-8 кДа. Используйте 0,25x TBE в качестве рабочего буфера и 1x буфер элюирования (50 мМ KCl, 10 мМ HEPES, pH 7,5). Предварительно запустите цилиндрический гель при постоянной давлении 12 Вт в течение 1 ч и соберите фракции, запускаемые перистальтическим насосом, с расходом примерно 1 мл / мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если УФ-детектор недоступен для идентификации фракций, содержащих ДНК, можно провести скрининговый эксперимент с 32P-NCP для идентификации интересующих фракций. Сохраняя все условия одинаковыми, немаркированные NCP могут быть очищены без УФ-детектора.
    3. Сконцентрируйте 2,8 мл NCP до 250 мкл с помощью центробежного фильтра (пороговое значение MW 30 кДа) и загрузите на препаративный гель и электрофорез в общей сложности в течение 6 часов. Через 2 часа, когда ксилол-цианол закончится из геля, приступают к сбору фракций по 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Через 2,5 часа фракции будут очищены от ксилолцианола; ДНК (197mer) элюируется примерно через 3-3,5 часа, а NCP, как ожидается, будет элюировать через 4,5-5 часов.
    4. Проанализируйте интересующие фракции на 6% неденатурирующем полиакриламидном геле. Фракции, содержащие NCP, сразу же концентрируют с помощью центробежного фильтра (отсечка MW 30 кДа) до 1 мг/мл. На следующий день оцените качество NCP на 6% полиакриламидном неденатурирующем геле перед комплексообразованием с интересующим фактором репарации ДНК (DRF).
    5. Инкубируйте NCP и DRF на льду в течение 15 минут, используя оптимальный буфер для конкретного комплекса. Например, смешайте 1,000 мкл NCP [1.2 мкМ]; 260 мкл 5-кратного связывающего буфера (250 мМ HEPES, pH 8, 500 мМ KCl, 25 мМ MgCl2), 22 мкл 3 М KCl и 18 мкл MBP-Pol β-APE1 [338 мкМ].
      ПРИМЕЧАНИЕ: Температура и ионная сила, при которых изготовлен комплекс, могут нуждаться в оптимизации для различных комплексов.
    6. Добавить глутаровый альдегид (только что вскрытый; ЭМ) до конечной концентрации 0,005%. Следовательно, к этой реакции добавляют 26,8 мкл 0,25% глутарового альдегида с 13,2 мкл dH2O. Хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 13 мин.
    7. Закалка 1 М Tris-Cl, рН 7,5, до конечной концентрации 20 мМ Tris-Cl, рН 7,5. Сконцентрируйте до ~50 мкл и замените буфер на 1x буфер для замораживания: 50 мМ KCl, 10 мМ HEPES, pH 7,5 с помощью обессоливающей колонны.
      ВНИМАНИЕ: Глутаровый альдегид может вызвать серьезные ожоги кожи и повреждение глаз; Он вреден при проглатывании и токсичен при вдыхании. Наденьте лабораторный халат, защитные очки, перчатки и работайте с глутаровым альдегидом в вытяжном шкафу и наденьте маску.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно проводить реакцию сшивания в большом объеме с NCP при этой более низкой концентрации. Предыдущие попытки сшивания, даже при такой концентрации глутарового альдегида, но при 10-кратно более высокой концентрации NCP, приводили к агрегации образца и чрезмерному сшиванию, как указано SDS PAGE и эксклюзионной хроматографией. В этих сетках не было различимых частиц, только сгустки (рис. 5D, E).
    8. Определите коэффициент поглощения при OD 280 и OD 260 и при необходимости сконцентрируйте дальше, чтобы достичь 1,3-3 мг/мл на основе OD 280 (типичное соотношение OD260 / OD 280 = 1,7-2 дает хорошие частицы). Для этого небольшого объема в 50 мкл лучшим методом уменьшения потерь образца является изготовление диализной кнопки с крышкой из пробирки объемом 1,7 мл, покрытой диализной мембраной (отсечка 6-8 кДа МВт), разрезав нижнюю часть пробирки и используя край пробирки для герметизации мембраны в верхней части крышки.
    9. Поместите кнопку диализа, содержащую образец, на верхнюю часть слоя полиэтиленгликоля мембраной вниз (проверяйте прогресс каждые 2 минуты). Этот метод предпочтителен в тех случаях, когда требуемая концентрация меньше или равна 2,5-кратной, чтобы избежать разбавления или потери образца в концентраторе. После этого этапа очень важно сразу подготовить крио-ЭМ решетки комплекса.
  2. Очистка методом эксклюзионной хроматографии
    1. За день до замораживания промойте и уравновесьте колонку исключения размера 60 мл dH2O, а затем 80 мл буфера для замораживания (50 мМ KCl, 10 мМ HEPES, pH 8) в течение ночи со скоростью 0,4 мл / мин. Используя NCP сразу после восстановления, приготовьте тот же комплекс, используя в 2,5 раза больше количеств, следующим образом: смешайте 2,500 мкл NCP [1.2 мкМ]; 650 мкл 5-кратного связывающего буфера; 45 мкл MBP-Pol β-APE1 [338 мкМ] и 55 мкл 3M KCl.
    2. Инкубируйте смесь на льду без сшивающего агента в течение 15 минут. Затем добавляют глутаровый альдегид до конечной концентрации 0,005%, как описано в методе препаративного геля. В этом случае, однако, концентратируют комплекс в предварительно уравновешенном (с замораживающим буфером) центробежном фильтре примерно до 120 мкл.
    3. Немедленно проанализируйте пиковые фракции и сконцентрируйте те фракции, которые содержат гистоны и MBP-Pol β-APE1, как указано ранее. На рисунке 5A, B, C показаны успешные результаты с использованием метода исключения размера, а на рисунке 7 - оба метода.

3. Заморозить нуклеосомный комплекс

  1. Включив погружную морозильную камеру и наполнив увлажнитель 50 мл dH2O, установите температуру камеры на 22 °C и HR (влажность) на 98%. Поместите чашку этана и чашку с жидким азотом (содержащую помеченную решетку) в соответствующие держатели.
  2. Накройте чашку этана дозатором с этановой крышкой и осторожно залейте ее жидким азотом (LN2), а также наполните чашку LN 2 LN2. Когда уровень LN2 стабилизируется и достигнет 100% и температуры -180 °C, осторожно откройте клапан этана и заполните чашку этана до образования пузырьков на прозрачной крышке. Снимите дозатор этана.
  3. Поместите две фильтровальные бумаги на промокательное устройство и закрепите их металлическим кольцом. Переходим к настройке и используем следующие параметры для блоттинга: 0 пре-блоттинг, 3 с-блоттинг, 0 постблоттинг; выберите A-plunge и нажмите OK.
  4. На главном экране нажмите « Загрузить щипцы» и загрузите их сеткой стороной углерода/аппликации влево (подготовлено, как и раньше). Откалибруйте щипцы, отрегулировав ось Z, чтобы обеспечить сплошное пятно. Нажмите на нижнюю камеру и нанесите 3 мкл комплекса (1,3-3 мг/мл; ОД280). Нажмите на Blot/A-plunge. Это повернет сетку, чтобы промокнуть спереди, и погрузит ее в заморозку.
  5. Перенесите и храните сетку в сетчатой коробке в камере LN2 . Когда все четыре решетки замерзнут и помещены в сетчатую коробку, поверните крышку в нейтральное положение, где все решетки будут закрыты крышкой, и затяните винт. Сетки могут храниться в LN2 до тех пор, пока не начнется просеивание.

4. Сетки экрана

  1. Перед загрузкой образцов в микроскоп поместите остеклованные сетки на кольцо и закрепите их с помощью С-образного зажима. Выполняйте этот процесс клипсования под LN2 в помещении с контролируемой влажностью, чтобы избежать загрязнения льдом.
  2. При загрузке микроскопа вставьте сетки в кассету с 12 слотами. Переместите кассету в капсулу nanocab и загрузите ее в автомат заряжания. Роботизированный механизм автозагрузчика инициирует процесс.
  3. Перенесите сетку с кассеты на столик микроскопа. Отрегулируйте ступень на эуцентрическую высоту, раскачивая сцену на 10° и одновременно перемещая высоту по оси Z до тех пор, пока на изображениях не будет наблюдаться минимальное плоское смещение.
  4. Как только эуцентрическая высота будет достигнута, начните визуализацию. Во-первых, получите атлас, сделав монтажное изображение сетки размером 3 x 3, в котором каждый монтаж сделан с 62-кратным увеличением. Выберите три квадрата разного размера; Возьмите эуцентрическую высоту, а затем изображение с 210-кратным увеличением.
  5. После того, как квадрат изображен, выберите по одному отверстию от края, центра и между ними внутри квадратов. Изображение каждого отверстия с 2600-кратным увеличением.
  6. Перед съемкой этого изображения с большим увеличением автофокусировка происходит со смещением области изображения. Сделайте изображение с большим увеличением от центра отверстия с 36 000-кратным увеличением и временем экспозиции 7,1 с, 60 кадрами, размером 1,18 пикселя и расфокусировкой 3 мкм. Смотрите репрезентативные изображения скрининга на рисунках 5, 6 и 7.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Правильно собранные NCP (рис. 2) были использованы для создания комплекса с рекомбинантным слитым белком MBP-Polβ-APE1 (рис. 3). Для определения соотношения NCP к MBP-Polβ-APE1 с образованием стабильного комплекса были проведены электрофоретические анализы сдвига подвижности (EMSA) (рис. 4), которые показали одиночно смещенную полосу NCP с 5-кратным молярным избытком MBP-Polβ-APE1. Во время оптимизации создания этого комплекса сшива...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конкретный протокол очистки фактора репарации ДНК будет зависеть от интересующего фермента. Тем не менее, существуют некоторые общие рекомендации, включая использование рекомбинантных методов экспрессии и очистки белка18; если интересующий белок слишком мал (<50 кДа), определение структуры с помощью крио-ЭМ было практически невозможно до недавнего времени с помощью системслияния 19, каркасов, связывающих нанотела,20 и оптимизации стратегий

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Марио Боргнию из крио-ЭМ-ядра Национального института наук об окружающей среде и доктора Джошуа Штрауса из Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл за их наставничество и обучение подготовке крио-ЭМ-сетки. Мы также благодарим д-ра Джулиану Мелло да Фонсеку Резенде за техническую помощь на начальных этапах этого проекта. Мы высоко ценим ключевой вклад и поддержку покойного доктора Сэмюэля Х. Уилсона и членов его лаборатории, особенно доктора Раджендры Прасада и доктора Йоонаса Джамсена в очистке генетически слитого комплекса APE1-Polβ. Исследования были поддержаны Программой внутренних исследований Национальных институтов здравоохранения, Национального института наук об окружающей среде [номера грантов Z01ES050158, Z01ES050159 и K99ES031662-01].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 М HEPES; pH 7,5Thermo Fisher Scientific15630080
1 М MgCl2Thermo Fisher ScientificAM9530G
10x TBEBio-rad1610733
25% глутаральдегидаFisher Scientific50-262-23
3 M KClThermo Fisher Scientific043398.K2
491 ЦентробежныйBio-rad1702926
Amicon Ultra 15 (отсечка МВт 30 кДа)Millipore SigmaZ717185
Amicon Ultra 4 (отсечка МВт 30 кДа)Пинцет Millipore SigmaUFC8030
AutoGridTed Pella47000-600
Автоматическая морозильная камераLeicaLeica EM GP
C-1000 сенсорный амплификаторBio-rad1851148
C-образные зажимы и кольцаThermo Fisher6640--6640
Станция клипсированияSubAngostromSCT08
Диализная мембрана (MW cufoff 6-8 кДа)Fisher Scientific15370752
Алмазный пинцетTechni-Pro758TW0010
dsDNAIntegrated DNA технологии н/д
FEI Titan KriosThermo FisherKRIOSG4TEM
система очистки FPLCAKTA Pure29018224
Сборник фракций Модель 2110Bio-rad7318122
Система очистки тлеющего разрядаTed Pella91000S
Grid BoxesSubAngostromPB-E
Набор аксессуаров для хранения сеткиSubAngostromGSAX
Жидкий этанН/Д/Д
Минипульс 3 перистальтический двухголовочный насосGilsonF155008
NanodropThermo Fisher ScientificND-2000
Novex 16%, Трицин, 1,0 мм, мини протеиновые гелиThermo НаучныйEC6695BOX
Фишера ПипетманГилсонFA10002M
Наконечники для пипеток (VWR) Low RetentionVWR76322-528
Раствор полиакриламидного геля (37,5:1)Bio-RAD1610158
полиэтиленгликоль (ПЭГ)Millipore SigmaP4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500Millipore Sigma
Очищенный рекомбинантный фактор репарации ДНКН/Д Н/Д
R 1,2/1,3 Cu 300 меш СеткиQuantifoilN1-C14nCu30-01
Рекомбинантный октамер гистоновН/ДН/Д
Пружинные инструменты для обрезкиSubAngostromCSA-01
Superdex 200 колонка 10/300Millipore SigmaGE28-9909-44
Просвечивающий электронный микроскопThermo FisherTalos Arctica 200 кВ
Пинцет в сборе для FEI Vitrobot Mark IV-ITed Pella47000-500
UltraPure GlycerinThermo Fisher Scientific15514011
VitrobotThermo FisherMark IV System
Ватман Фильтровальная бумага (55 мМ)Cytiva1005-055
КсилолцианолThermo Fisher Scientific440700500
Микроспиновые обессоливающие колонны Zeba, 7K MWCO, 75 &; LThermo Fisher Scientific89877
фильтр Центробежный фильтр Н Жидкий азот н/д PURX35050

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
  4. Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
  5. Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
  6. McGinty, R. K., Tan, S. Nucleosome structure and function. Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).
  7. Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
  8. Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
  9. Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).
  10. Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
  11. Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
  12. Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
  13. Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
  14. Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
  15. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
  16. McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
  17. Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
  18. Burgess, R. R. D., Murray, P. Guide to Protein Purification. 463, Academic Press. (2009).
  19. Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909(2016).
  20. Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118(2021).
  21. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032(2019).
  22. Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255(2018).
  23. Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи