Методическая статья

Закупка и перфузионно-децеллюляризация васкуляризованных лоскутов свиней в индивидуальном перфузионном биореакторе

DOI:

10.3791/64068

⸱

1 августа 2022 г.

 ,  ,  , 
1Latner Thoracic Surgery Research Laboratories, Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 2Institute of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Division of Thoracic Surgery, Department of Surgery, University of Toronto, 4Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, University of Toronto

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол описывает хирургическую закупку и последующую децеллюляризацию васкуляризированных лоскутов свиней путем перфузии моющего средства додецилсульфата натрия через сосудистую ткань лоскута в индивидуальном перфузионном биореакторе.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дефекты мягких тканей большого объема приводят к функциональному дефициту и могут сильно повлиять на качество жизни пациента. Хотя хирургическая реконструкция может быть выполнена с использованием аутологичного переноса свободного лоскута или васкуляризированной композитной аллотрансплантации (VCA), такие методы также имеют недостатки. Такие проблемы, как заболеваемость донорского участка и доступность тканей, ограничивают аутологичный свободный перенос лоскута, в то время как иммуносупрессия является значительным ограничением VCA. Инженерные ткани в реконструктивной хирургии с использованием методов децеллюляризации/ рецеллюляризации представляют собой возможное решение. Децеллюляризированные ткани генерируются с использованием методов, которые удаляют нативный клеточный материал, сохраняя при этом базовую микроархитектуру внеклеточного матрикса (ECM). Эти бесклеточные каркасы затем могут быть впоследствии рецеллюляризированы с помощью клеток, специфичных для реципиента.

Этот протокол подробно описывает методы закупок и децеллюляризации, используемые для достижения бесклеточных каркасов в модели свиньи. Кроме того, он также предоставляет описание конструкции и установки перфузионного биореактора. Лоскуты включают свиной сальник, тензорную фасцию лата и радиальное предплечье. Децеллюляризация проводится с помощью перфузии ex vivo моющего средства додецилсульфата натрия (SDS) с последующей обработкой ферментами ДНКазы и стерилизацией перуксусной кислоты в индивидуальном перфузионном биореакторе.

Успешная децеллюляризация тканей характеризуется бело-непрозрачным появлением лоскутов макроскопически. Бесклеточные лоскуты показывают отсутствие ядер на гистологическом окрашивании и значительное снижение содержания ДНК. Этот протокол может быть эффективно использован для создания децеллюляризованных каркасов мягких тканей с сохраненной ECM и микроархитектурой сосудов. Такие каркасы могут быть использованы в последующих исследованиях рецеллюляризации и имеют потенциал для клинической трансляции в реконструктивной хирургии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Травматическое повреждение и удаление опухоли могут привести к большим и сложным дефектам мягких тканей. Эти дефекты могут ухудшить качество жизни пациента, вызвать потерю функции и привести к постоянной инвалидности. В то время как такие методы, как аутологичный перенос лоскута тканей, широко практикуются, проблемы с доступностью лоскута и заболеваемостью донорским участком являются основными ограничениями 1,2,3. Васкуляризированная композитная аллотрансплантация (VCA) является перспективной альтернативой, которая передает композитные ткани, например, мышцы, кожу, сосудистую систему, как единое целое реципиентам. Однако VCA требует длительной иммуносупрессии, что приводит к лекарственной токсичности, оппортунистическим инфекциям и злокачественным новообразованиям 4,5,6.

Тканеинженерные бесклеточные каркасы являются потенциальным решением этих ограничений7. Каркасы бесклеточной ткани могут быть получены с использованием методов децеллюляризации, которые удаляют клеточный материал из нативных тканей с сохранением лежащей в основе микроархитектуры внеклеточного матрикса (ECM). В отличие от использования синтетических материалов в тканевой инженерии, использование биологически полученных каркасов предлагает биомиметический СУБСТРАТ ECM, который обеспечивает биосовместимость и потенциал для клинической трансляции8. После децеллюляризации последующая рецеллюляризация каркасов с реципиент-специфическими клетками может затем генерировать функциональные, васкуляризированные ткани практически без иммуногенности 9,10,11. Разрабатывая эффективный протокол для получения бесклеточных тканей с использованием методов перфузионной децеллюляризации, можно спроектировать широкий спектр типов тканей. В свою очередь, построение на этой методике позволяет наносить на более сложные ткани. На сегодняшний день перфузионная децеллюляризация васкуляризированных мягких тканей была исследована с использованием простых васкуляризированных тканей, таких как фасциокожный лоскут полной толщины у грызунов12,свиней 13 и человеческих моделей14, а также скелетной мышцы грудной части животасвиней 15. Кроме того, сложные васкуляризированные ткани также были децеллюляризированы перфузией, как показано на моделях свиньих и человеческих ушей 16,17 и моделях полнолицего трансплантата человека18.

Здесь протокол описывает децеллюляризацию васкуляризированных свободных лоскутов с использованием биологически полученных каркасов ECM. Мы представляем децеллюляризацию трех клинически значимых лоскутов: 1) сальника, 2) тензорной фасции лата и 3) радиального предплечья, все из которых являются репрезентативными лоскутами рабочей лошадки, регулярно используемыми в реконструктивной хирургии и ранее не исследовались в исследованиях на животных в контексте децеллюляризации тканей. Эти биоинженерные клапаны предлагают универсальную и легкодоступную платформу, которая имеет потенциал для клинических применений для использования в области восстановления и реконструкции больших дефектов мягких тканей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры, связанные с животными, были одобрены Университетским комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) и выполняются в соответствии с протоколом и процедурами Центра ресурсов животных Университетской сети здравоохранения и Руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными. Пять йоркширских свиней (35-50 кг; возраст около 12 недель) использовались для всех экспериментов.

1. Изготовление перфузионного биореактора

  1. См. рисунок 1 для всех компонентов, используемых в перфузионном биореакторе. Для изготовления тканевой камеры используйте коммерчески доступные полипропиленовые защелкивающиеся контейнеры с водонепроницаемыми и герметичными крышками, содержащими силиконовую уплотнительную подкладку. Убедитесь, что контейнеры совместимы с автоклавом.
  2. Просверлите два 1/4 отверстия по бокам контейнера и проденьте короткий сегмент силиконовой трубки с платиновым покрытием L/S-16. Одна трубка будет нести приток перфусата, а другая - для оттока.
  3. Для приточной трубки прикрепите мужской соединитель Luer во внутренней части, который будет использоваться для соединения с тканевой канюлей. Прикрепите гнездовой разъем Luer на внешнем конце приточной трубки, который будет использоваться для подключения к трехстороннему запорному крану.
  4. Просверлите одно отверстие 1/4 в крышке камеры и проденьте еще один короткий сегмент силиконовой трубки с платиновым покрытием L/S-16. Эта трубка будет служить вентиляционным отверстием.
  5. Сделайте трубку для притока и оттока, измерив приблизительно 50 см силиконовых труб с платиновым покрытием L/S-16. Подключите один конец к желтой трехступенчатой насосной трубке, а другой конец к стерильной серологической пипетке объемом 2 мл для переноса перфусата из резервуаров моющего средства в камеру биореактора.
  6. Автоклав всех компонентов (камеры и трубки) в индивидуально упакованной стерильной упаковке.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Изготовление перфузионного биореактора. Перфузионный биореактор состоит из (А) пластиковой полипропиленовой тканевой камеры (В) с боковыми отверстиями, просверленными для размещения перфузионных труб с воздухонепроницаемой и водонепроницаемой крышкой. (C) Запорные краны прикреплены к трубам, чтобы обеспечить возможность крепления перфузионной трубки, которая переносит децеллюляризирующие агенты из резервуара моющего средства в отходы одним проходным способом. (D) Совместимые кассеты насоса используются для подключения трехступенчатой трубки к перистальтическому насосу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Приготовление растворов для децеллюляризации

  1. Готовят гепаринизированный обычный физиологический раствор (15 МЕ/мл) путем разбавления 1,5 мл 1000 МЕ/мл раствора гепарина в 100 мл обычного физиологического раствора.
  2. Готовят 0,05% мас./об.раствор додецилсульфата натрия (SDS), медленно добавляя 9 г порошка SDS в 18 л автоклавной дистиллированно-деионизированной воды. Используйте полипропиленовый (PP) карбой большого объема для размещения раствора SDS. Раствор готов к употреблению при полном растворении. Хранить при комнатной температуре.
  3. Подготовьте ДНК I рабочим раствором. Во-первых, восстанавливают лиофилизированную ДНКазу I до исходной концентрации 10 мг/мл с 5 мМCaCl2 в стерильном dH2O. Храните восстановленный запас раствора ДНКазы I в виде аликвот в морозильной камере −20 °C до готовности к использованию. В день применения разбавляют ДНКазу I в запасе 1:100 Mg++ (1,29 мМ) и Ca++ (1,98 мМ) в стерильном dH2Oдо конечной концентрации 0,1 мг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Активность DNase будет ухудшаться, если ее не хранить в замороженном виде. Только свежий рабочий раствор ДНКазы следует использовать для ферментативного переваривания ДНК при комнатной температуре.
  4. Приготовьте 1 раствор PBS, разбавив 10x PBS 1:10 стерильной автоклавной водой в конечном объеме 5 л в PP carboy. Хранить при комнатной температуре.
  5. Приготовьте 1% антибиотиков/антимикотиков (А/А) в ПБС. Развести 100x антибиотиков/антимикотиков 1:100 стерильным 1x PBS раствором до конечного объема 1 л. Хранить при комнатной температуре.
  6. Приготовьте 0,1% (v/v) перуксусной кислоты (PAA)/4% (v/v) этанола (EtOH), добавив 3,13 мл PAA + 40 мл 100% этанола + 956 мл стерильного dH2O. Доведите конечный объем до 1000 мл и храните при комнатной температуре.

3. Закупка свиных лоскутов

ПРИМЕЧАНИЕ: Это терминальная процедура. Одна свинья использовалась для закупки всех трех закрылков. Гуманно усыпляют животное после заготовки всех закрылков.

  1. Предоперационный уход
    1. Быстрые свиньи не менее чем за 12 ч до операции. Успокаивайте животных кетамином (20 мг/кг внутримышечно, в/м), атропином (0,04 мг/кг в/м) и мидазоламом (0,3 мг/кг в/м).
    2. Индуцируют анестезию путем вдыхания 5% изофлурана через маску со скоростью потока 22-44 мл/кг/мин для введения периферической линии и интубации. Поддерживать анестезию 0,5%-2% изофлураном при 22-44 мл/кг/мин. Обеспечьте адекватную глубину анестезии, проверив гемодинамическую стабильность и отметив отсутствие рефлексов снятия пальпебрального / педального нервов или мышечного тонуса челюсти, чтобы обозначить соответствующий уровень вводимого анестетика. Вводят внутривенно ремифентанил (10-20 мкг/кг/ч) непрерывной скоростью инфузии во время операции по обезболиванию.
    3. Интубируйте свинью соответствующей эндотрахеальной трубкой (7-8 мм) и подключите трубку к вентилятору, установленному на приливный объем 8 мл/кг, PEEP 5 см H20, FiO2 0,5 и частоту дыхания 14.
    4. Вставьте ангиокатный катетер 22 Г в ушную вену. После получения внутривенного (IV) доступа вводят теплый 0,9% нормальный физиологический раствор при 5-10 мл / кг / ч на протяжении всей процедуры для поддержания среднего артериального давления между 60 мм рт.ст. и 90 мм рт.ст.
    5. Непрерывный мониторинг частоты сердечных сокращений, пульсоксиметрии и конечного прилива CO2. Оценивайте артериальное давление и температуру тела каждые 5 мин.
    6. Наносите глазную мазь для предотвращения сухости глаз под наркозом. Подготовьте все хирургическое поле повидоном-йодом. Задрапируйте хирургическое поле стерильными полотенцами.
  2. Клапан сальниковый
    1. Поместите свинью в положение лежа на спине и выполните ксифопумную лапаротомию.
    2. При входе в брюшную полость мобилизуйте цефаладу желудка, чтобы визуализировать большой сальник. Осторожно поместите сальник в операционное поле и определите желудочно-эпиплоические сосуды, идущие вдоль большей кривизны желудка (рисунок 2А).
    3. Начинаются с левого аспекта большего искривления, где левая гастроэпиплоическая артерия соединяется со селезеночной артерией. Используя прямые ножницы для тенотомии Стивенса, скелетируют как левую гастроэпиплоическую артерию, так и вену. Затем Лигате разделите оба по отдельности с помощью хирургических стяжек или зажимов.
    4. Идите по большему искривлению желудка слева направо. Разложить и разделить короткие сосудистые ветви, возникающие из сальника, обеспечивая большую кривизну желудка. Позаботьтесь о том, чтобы не травмировать главную гастроэпиплоическую ножку сальника во время этого шага.
    5. Продолжайте мобилизацию большого сальника до тех пор, пока не встретится соединение правых гастроэпиплоических сосудов и гастродуоденальной артерии. С помощью зажимов или завязок, а затем разделите правую гастроэпиплоидную артерию и вены отдельно, чтобы освободить сальниковый лоскут.
    6. После освобождения сальник может быть разделен посередине на две половины, причем каждая половина сопровождается соответствующей гастроэпиплоической артерией и веной. Это позволяет закупать два безальмарных клапана от одной операции с животными. Индивидуально канюлировать желудочно-эпиплоические сосуды канюлей 20-22 Г, а затем закрепить с помощью 3-0 шелковых завязок.
    7. Промывайте гепаринизированный физиологический раствор (15 МЕ/мл) в гастроэпиплоическую артериальную канюлю до тех пор, пока не будет наблюдаться явный венозный отток.
  3. Тензорная фасция лата лоскут
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол основан на предыдущем описании лоскута тензорной фасции свиньи Haughey et al.19. Модификация производится для выделения только фасциальной части тензорной фасции лата лоскута.
    1. Поместите свинью в боковое пролежнее положение и побрейте всю верхнюю заднюю конечность двусторонне. Подготовьте и задрапируйте с помощью обычных стерильных процедур.
    2. Обозначьте переднюю границу лоскута линией, простирающейся от переднего верхнего подвздошного отдела позвоночника (ASIS) к боковой надколеннике. Расположение ножки примерно в 6-8 см от АСИС вдоль этой линии.
    3. Отметьте параллельную заднюю линию примерно на расстоянии от 8 см до 10 см от переднего разреза вдоль оси бедренной кости, чтобы включить ширину лоскута. Отметьте дистальный край лоскута на боковой надколеннике.
    4. Начинают рассечение дистального края на коленной чашечке с резкого разреза кожи с помощью скальпеля. Углубляйте разрез кожи прижиганием через подкожную клетчатку до тех пор, пока не встретится фасция, покрывающая прямую кость плода.
    5. Продолжайте разрезы кожи в направлении ASIS вдоль отмеченных передней и задней границ, описанных выше. Чтобы изолировать только фасциальный лоскут, удалите вышележащий компонент кожи из нижележащего фасциального слоя. Прижигайте или прижигайте любые мелкие перфораторные сосуды к коже.
    6. Вернитесь к дистальной границе лоскута и разрезайте глубокую фасцию, чтобы обеспечить мобилизацию лежащей в основе мышцы vastus lateralis. Мобилизуйте фасцию в сторону ASIS.
    7. Во время мобилизации определите сосудистую ножку, возникающую между мышцами vastus lateralis и rectus femoris (рисунок 2B). Позаботьтесь о том, чтобы избежать чрезмерного вытяжения, чтобы не травмировать сосуды ножки.
    8. Рассекните проксимальный аспект от ASIS, защищая сосудистую ножку. Рассекайте до тех пор, пока лоскут не будет достаточно мобилизован вокруг своей ножки.
    9. Проследите ножку по направлению к глубоким бедренным сосудам. Скелетонизируют как боковую циркумфлексную бедренную артерию, так и вену, снабжающую фасциальный лоскут. Затем Лигат разделяет оба сосуда проксимально, где они присоединяются к глубоким бедренным сосудам.
    10. Соедините сосуды ножки по отдельности с ангиокатетерами от 20 г до 24 Г, закрепленными 3-0 шелковыми завязками. Промывайте гепаринизированный физиологический раствор (15 МЕ/мл) в лоскутную артериальную канюлю до тех пор, пока не будет наблюдаться явный венозный отток.
  4. Радиальный клапан предплечья
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный ниже протокол основан на опубликованном описании модели радиального клапана предплечья свиней Хачатряном и др.20.
    1. Поместите свинью на операционный стол в боковое пролежневое положение. Расположите зависимую переднюю конечность в операционном поле.
    2. Отметьте приблизительный квадрат кожного лоскута размером 3 см х 3 см на радиальном предплечье. Проведите линию между средней точкой проксимального края лоскута и антекубитальной ямкой, чтобы обозначить приблизительное течение ножки лучевой артерии. Подтверждают артериальное течение пальпацией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В свиной модели радиальные сосуды расположены относительно глубже, чем у человека. Их расположение находится между сгибателем carpi radialis и brachioradialis.
    3. Разрезайте кожу с помощью скальпеля в дистальном аспекте с глубиной до антебрахиальной фасции. Тупое рассечение тенотомическими ножницами до тех пор, пока не встретится дистальная лучевая артерия и две ее вены. Обжигайте артерии и вены хирургическими связями по отдельности и делитесь.
    4. Продолжайте разрезы кожи на лучевом и локтевом краях отмеченного квадрата кожи. Мобилизуйте лоскут от подлежащей лучевой кости хирургическим лезвием, идущим от радиального к локтевому направлению, а также поднимая кожный лоскут проксимально к антекубитальной ямке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте субфасциальную плоскость рассечения, чтобы гарантировать, что ножка радиальной артерии остается связанной с вышележащим кожным слоем.
    5. На проксимальном краю втягиваем пространство между плечевой артерией и сгибателем carpi radialis с помощью самоудерживающегося втягивающего устройства, чтобы обнажить проксимальную лучевую артерию и ее вены комитанты (рисунок 2C).
    6. Используя ножницы для тенотомии, скелетируют лучевую артерию и вены comitantes проксимально в антекубитальной ямке, где они соединяют плечевую артерию и вены соответственно. Рассекайте сосуды от окружающих фиброзно-жировиковых тканей для достижения достаточной длины ножки примерно 5-6 см. Разложить и разделить артерию и вены отдельно, чтобы освободить лучевой лоскут предплечья.
    7. Соедините сосуды ножки с ангиокатетерами от 20 г до 24 г, закрепленные 3-0 шелковыми завязками. Промывайте гепаринизированный физиологический раствор (15 МЕ/мл) в лоскутную артериальную канюлю до тех пор, пока не будет наблюдаться явный венозный отток.
    8. После закупорки лоскутки хранят в холодном физиологическом растворе при 4 °C до готовности к децеллюляризации. Под глубокой изофлурановой анестезией усыпляют животных внутривенной инъекцией хлорида калия (100 мг/кг в/в). Подтверждают смерть отсутствием жизненно важных показателей.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Заготовка трех васкуляризированных лоскутов свиней. (А) Сальник. Правая (i) и левая (ii) гастроэпиплоические артерии канюлируются в сальниковом лоскуте (iii). (B) Тензорная фасция лата. Ножка лоскута (iv) является восходящей ветвью боковой бедренной циркумфлексной артерии (v). (C) Радиальный клапан предплечья. Закупорка лучевого лоскута предплечья (vi) основана на лучевой артерии и вене comitantes (vii) в качестве сосудистой ножки (ПРИМЕЧАНИЕ: Шторы были опущены в демонстрационных целях). Шкала: 3 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Настройка системы децеллюляризации

  1. Соберите тканевую камеру с клапанами в стерильных условиях в ламинарный шкаф биобезопасности.
  2. Прикрепите трехсторонний запорный кран к входному и выходному портам биореактора. Прикрепите фильтр 0,2 мкм к вентиляционному отверстию на крышке тканевой камеры. Загрунтуйте приточную трубку стерильным гепаринизированным физиологическим раствором для устранения пузырьков воздуха.
  3. Поместите клапаны в камеру. Используя стерильные гемостаты, подключите заслонки к приточной трубке с помощью разъема Luer. Прикрутите соответствующую артериальную канюлю каждого лоскута к самцу Luer и обеспечьте плотное уплотнение.
  4. Промывайте гепаринизированный физиологический раствор через запорный кран, чтобы проверить, что соединение Luer не имеет утечек и что клапаны могут быть перфузированы с признаками венозного оттока. Закрыть тканевую камеру крышкой.
  5. Соедините приточную трубку с желтой трехступенчатой насосной трубкой с приточным запорным краном тканевой камеры. Кроме того, подключите встроенный датчик давления к трехходовому запорному крану, чтобы обеспечить контроль давления перфузии.
  6. Включите приточный перистальтический насос. На начальном экране перейдите к третьей вкладке с помощью клавиши со стрелкой, чтобы установить идентификатор трубки на 1,85 мм. Затем перейдите на вторую вкладку, чтобы установить скорость перфузии. Входная скорость как способ подачи и установлена на 2 мл/мин. Убедитесь, что направление потока правильное, как показано на экране. Загрузите трехступенчатую насосную трубку в перистальтический насос с помощью совместимой кассеты.
  7. Повторите процедуру для перистальтического насоса оттока аналогично описанной выше. Установите настройку оттокового насоса на скорость 4 мл/мин. Соедините отточную трубку с желтой трехступенчатой насосной трубкой с выходным запорным краном тканевой камеры. Загрузите трехступенчатую насосную трубку в перистальтический насос с помощью совместимой кассеты. Запустите поток для обоих насосов, нажав кнопку питания .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокая скорость оттока насоса является важнейшей мерой безопасности для предотвращения переполнения тканевой камеры, гарантируя, что отток камеры всегда превышает приток в ходе децеллюляризации. Вся собранная установка децеллюляризации показана на рисунке 3.

figure-protocol-3
Рисунок 3: Собранная система перфузионной децеллюляризации. (А) Схема системы перфузионной децеллюляризации. Приточная трубка переносит перфусат из резервуара моющего средства в тканевую камеру в однопроходном режиме с контролем датчика давления. Трубка оттока активно удаляет перфусат из тканевой камеры в контейнер для отходов. Черные стрелки обозначают направление потока перфузии. Перистальтический насос используется с левым насосом для управления притоком. Отток активно удаляется с помощью второго перистальтического насоса через соответствующую трубку. Рисунок, созданный с помощью BioRender.com. (B) Фотография системы перфузионной децеллюляризации, собранной на столешнице с приточным перистальтическим насосом (i), соединенным с тканевыми камерами (ii), а затем перистальтическим насосом (iii). Давление перфузата в притоке контролируется с помощью встроенного датчика давления (iv) перед входом в тканевую камеру. Здесь три клапана децеллюляризируются параллельно. Как моющее средство, так и резервуары для отходов находятся под столешницей и не фотографируются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Децеллюляризация лоскутов свиней

  1. Выполните все следующие этапы перфузионной децеллюляризации при комнатной температуре. Краткую информацию о показателях и продолжительности перфузии см. в таблице 1. Начинают перфузию гепаринизированного физиологического раствора со скоростью 2 мл/мин с помощью перистальтического насоса и перфузируют лоскуты гепаринизированным физиологическим раствором в тканевой камере в течение 15 мин, чтобы удалить любые оставшиеся сгустки крови.
  2. По завершении перфузии гепаринизированного физиологического раствора, аспират остаточного физиологического раствора в тканевой камере. Заполните тканевую камеру примерно 500 мл раствора для децеллюляризации SDS, чтобы достаточно погрузить лоскут.
  3. Перенесите приточную трубку в раствор для децеллюляризации SDS и перфьюритизацию ткани со скоростью 2 мл/мин. Продолжительность перфузии варьируется в зависимости от лоскута; перфузируйте SDS в течение 2 дней для сальника, 3 дня для тензорной фасции и 5 дней для лучевого фасцио-кожного лоскута предплечья.
  4. По завершении децеллюляризации SDS аспирируют существующий перфусат SDS, содержащийся в тканевой камере. Переведите приточную трубку в 1-кратный раствор PBS и перфузируйте лоскуты в течение 1 дня со скоростью 2 мл/мин.
  5. Удалите предыдущий раствор PBS и перенесите приточную трубку в рабочий раствор DNase. Перфузия в течение 2 ч при 2 мл/мин. Удалите раствор ДНКазы из тканевой камеры и поместите приточную трубку в 1 раствор PBS. Погрузите ткани 1x раствором PBS в камеру и перфьминируйте 1x PBS раствор в течение 1 дня при 2 мл/мин.
  6. Стерилизуйте клапаны раствором PAA/EtOH. Перенесите приточную трубку в PAA/EtOH в растворе dH2Oи погрузите ткани в тот же раствор. Перфьюзия PAA/EtOH при 2 мл/мин в течение 3 ч. После завершения стерилизации PAA/EtOH отсоедините трубку от трехходовых запорных кранов.
  7. Удалите лоскуты с помощью асептической техники и поместите стерильные инструменты в PBS, содержащий 1% антибиотиков / антимикотиков (A / A). Погружайте клапаны с PBS + 1% A/A в течение 15 мин в двух отдельных промывках для полной нейтрализации остаточной кислоты. Держите лоскуты в PBS + 1% A/A при 4 °C до готовности к рецеллюляризации.
  8. Проверьте стерильность каркасов, выполнив посев тампона на агаровых пластинах и исследуя рост микробов. Прививайте агаровые пластины мазками, взятыми с поверхности каждого лоскута. Культивируйте агаровые пластины при 37 °C в течение 2 недель. Стерильность демонстрируется отсутствием роста микробной колонии.

Таблица 1: Сводка параметров протокола перфузионно-децеллюляризации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

6. Оценка децеллюляризации

  1. Используя пробивную биопсию, извлекайте образцы толщиной от 3 мм до 10 мм из лоскутов.
  2. Для гистологии фиксируют биопсию в гистологических кассетах в обычном буферизованном формалине в течение 24 ч при комнатной температуре.
  3. Вымойте кассеты с биопсией в воде или PBS в течение 15 минут, затем поместите их в 70% этанол до готовности к обработке тканей. Обрабатывайте кассеты в тканевом процессоре в соответствии со стандартными протоколами.
  4. Встраивают биопсию в парафин, позволяя воску затвердевать в течение 10-15 мин на холодной пластине. Сечение парафиновых блоков на микротоме толщиной до 5 мкм. Окрашивайте слайды гематоксилином и эозином (H&E) в соответствии со стандартными протоколами. Изображение тканевых слайдов с помощью световой микроскопии.
  5. Для количественной оценки содержания ДНК получите сухую массу биопсии ткани после ночного высыхания тканей в печи при 60 °C. Переваривайте образцы в буфере экстракции папаина при 65 °C в течение ночи. Центрифугируйте переваренные образцы при 10 000 х г и перенесите супернатант в свежую микроцентрифужную трубку. Анализ содержимого ДНК с помощью коммерческого набора для экстракции ДНК в соответствии с инструкциями производителя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол для децеллюляризации васкуляризированных лоскутов свиней основан на перфузии моющего средства на основе ионов, SDS, через сосудистую ткань лоскута в индивидуальном перфузионном биореакторе. До децеллюляризации три васкуляризированных лоскута в свиной модели были закуплены и каннулированы в соответствии с их основными сосудами-источниками. Лоскуты были немедленно промыты после закупки, чтобы сохранить патентную, перфузионную сосудистую систему, чтобы обеспечить успешную децеллюляризацию. Используя герметичны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предлагаемый протокол использует перфузию SDS низкой концентрации для децеллюляризации ряда лоскутов, полученных из свиней. С помощью этой процедуры бесклеточный сальник, тензорная фасция лата и радиальные клапаны предплечья могут быть успешно децеллюляризированы с использованием протокола, который способствует низкой концентрации SDS. Предварительные эксперименты по оптимизации определили, что SDS при низкой концентрации (0,05%) от 2 дней до 5 дней способен удалять клеточный материал для сальника, тензорной фасции лата ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 & микро; m поры Фильтр АкродискVWRCA28143-310
0,9 % раствор хлорида натрия (нормальный физиологический раствор)BaxterJF7123
20 л Полипропилен CarboyCole-ParmerRK-62507-20
3-0 Sofsilk Нерассасывающийся хирургический галстукCovidien  LS639
3-полосный запорный кранCole-ParmerUZ-30600-04
Щипцы АдсонаFine Science Tools11027-12
Антибиотик-антимикотический раствор, 100XWisent450-115-EL
Сульфат атропина 15 мг/30 млСтропила 8 продуктов238481
BD Angiocath 20-калибраVWR BD381134
BD Angiocath 22-gaugeVWRBD381123
BD Angiocath 24-gaugeVWR BD381112
Calcium ChlorideSigma-AldrichC4901DNAse Co-factor
DNase I из поджелудочной железы крупного рогатого скотаSigma-AldrichDN25
анализ ДНК (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)InvitrogenP7589
DPBS, 10XWisent311-415-CL  без Ca++/Mg++
Halsted-Mosquito HemostatFine Science Tools13008-12
Гепарин, 1000 МЕ/млLeo Pharma A/S453811
Кетамина гидрохлорид  5000 мг/50 млBimeda-MTC Animal Health Inc.
Насос Ismatec Tygon 3-ступенчатая трубкаCole-ParmerRK-96450-40внутренний диаметр:  1,85 мм
Ismatec REGLO 4-канальный насосCole-Parmer78001-78
Трубка Ismatec кассетыCole-ParmerRK-78016-98
изофлуран 99,9%, 250 млPharmaceutical Partners of Canada Inc.
LB Agar LennoxBioshop CanadaLBL406.500Тест на стерильность агаровые пластины
Сульфат магнияSigma-AldrichM7506Кофактор ДНКазы
Masterflex L/S 16 ТрубкаCole-ParmerRK-96410-16
Мидазолам 50 мг/10 млPharmaceutical Partners of Canada Inc.
Монополярный карандаш для прижиганияValleylabE2100
нормальный буферизованный формалин, 10%Sigma-AldrichHT501128
N° 11 лезвие скальпеляSwann Morton303
Папаин из папайи латексSigma-AldrichP3125
Надуксусная кислотаSigma-Aldrich269336
Пластиковый колючий соединитель для трубки от 1/4" до 1/8" IDMcMaster-Carr5117K61
Пластиковая колючая трубка 90° Угловые соединителиMcMaster-Carr5117K76
Пластиковые быстроповоротные трубчатые заглушкиMcMaster-Carr51525K143Мужские
пластиковые быстроповоротные трубкиMcMaster-Carr51525K293Женские луэровские
пункционные биопсийные инструментыIntegra Miltex3332
Хлорид калия 40 мг-экв/20 млHospira Healthcare Corporation37869
Повидон-йод, 10%Ружье833133
серологический пипет, 2 млFisher Science13-678-27D
Герметичные контейнеры с защелкивающейся крышкойSnapLock142-3941-4
Порошок додецилсульфата натрияSigma-AldrichL4509
Хирургические металлические зажимы для лигирования, маленькийTeleflex001200
Тенотомические ножницы Stevens, 115 мм, прямыеB. НаборBraun BC004R
Edwards LifesciencesPX260
61231622319292242905 Луэра Гнезда для контроля давления TruWave

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
  2. Edsander-Nord, Å, Jurell, G., Wickman, M. Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study. Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).
  3. Qian, Y., et al. A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651(2018).
  4. Issa, F. Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses. Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).
  5. Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
  6. Iske, J., et al. Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges. Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).
  7. Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016, 1541823(2016).
  8. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  9. Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).
  10. Colazo, J. M., et al. Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration. Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).
  11. Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
  12. Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
  13. Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
  14. Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization. Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).
  15. Zhang, J., et al. Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template. Biomaterials. 89, 114-126 (2016).
  16. Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
  17. Duisit, J., et al. Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering. Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).
  18. Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
  19. Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
  20. Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , Springer. Denmark. 177-181 (2021).
  21. Hammouda, B. Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).
  22. Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold. Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).
  23. Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 84, 25-34 (2015).
  24. Mendibil, U., et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds. International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447(2020).
  25. Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).
  26. Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
  27. Adil, A., Xu, M., Haykal, S. Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation. Frontiers in Surgery. 9, 843677(2022).
  28. Phelps, E. A., García, A. J. Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).
  29. Pozzo, V., et al. A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63557(2022).
  30. Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. Journal of Visualized Experiments. (48), e2394(2011).
  31. Uzarski, J. S., et al. Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development. Journal of Visualized Experiments. (102), e53271(2015).
  32. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
  33. Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. Decellularization systems and devices: State-of-the-art. Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).
  34. Schilling, B. K., et al. Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering. Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Tissue EngineeringDecellularized ScaffoldsExtracellular MatrixSoft Tissue ReconstructionOmental FlapSodium Dodecyl SulfateRecellularization Methods

Похожие статьи