Протокол спасения эмбрионов для межвидовой гибридизации в сквоше

Cucurbita (2n = 40) является очень разнообразным родом в семействе Cucurbitaceae, который содержит 27 различных видов, из которых пять одомашнены¹. Среди них Cucurbita moschata, C. pepo и C. maxima являются наиболее экономически важными во всем мире. В США C. moschata и C. pepo являются двумя наиболее важными видами в сельскохозяйственном производстве. C. pepo состоит из четырех подвидов (ovifera, pepo, fraternal и gumala), которые содержат как летние, так и зимние сортовые группы кабачков: кривошея, прямой шеи, желудя, гребешка, кокозель, кабачок, кабачки и тыква 2,3,4,5. C. moschata в основном состоит из зимних видов рынка кабачков, включая баттернат, Дикинсон и сыр группы¹. Эти два вида морфологически и фенотипически разнообразны, причем C. pepo рассматривается за его урожайность, раннесть, привычку роста кустов и разнообразные признаки плодов, включая форму плода, размер плода, цвет мякоти и рисунок кожуры. С другой стороны, C. moschata ценится за адаптацию к теплу и влажности, а также устойчивость к болезням и вредителям ^6,7. Межвидовая гибридизация между C. moschata и C. pepo является не только важной стратегией интрогрессии желательных характеристик между двумя видами, но и позволяет расширить генетическую базу в селекционных программах ^7,8.

Ранние скрещивания между C. moschata и C. pepo были сделаны для определения их совместимости и/или таксономических барьеров ^9,10,11, тогда как более поздние исследования в основном были сосредоточены на передаче желательных признаков 12,13,14. Межвидовая гибридизация между двумя видами была нацелена на передачу новых признаков, таких как привычка роста куста или полулеска и улучшение урожайности C. pepo наряду с устойчивостью к болезням, приспособляемостью к абиотическому стрессу и повышенной энергией от C. moschata 14,15,16. Например, специфические скрещивания между C. pepo (P₅) и C. moschata (MO₃) привели к повышению урожайности плодов¹³, в то время как C. moschata (нигерийские местные и menina) широко использовались в качестве основного источника устойчивости к потивирусам у культивируемых сортов C. pepo ^17,18.

Предыдущие исследования показали, что гибридизация между C. moschata и C. pepo возможна, но затруднена ^8,15. Межвидовые скрещивания могут привести к отсутствию плодового набора (аборт), партенокарпические плоды, лишенные жизнеспособных семян (пустые семена), бессемянные плоды, где незрелые эмбрионы не развиваются (стеноспермокарпия), или плоды с небольшим количеством незрелых эмбрионов, которые могут быть спасены в зрелые растения путем спасения эмбрионов^15,16. Например, жизнеспособные семена не были получены путем скрещивания C. pepo (столовая матка, материнская) с C. moschata (крупный сыр, отцовский), однако реципрокное скрещивание дало 57 жизнеспособных семян из 134 опылений⁹. Хаясе получил жизнеспособные семена из скрещиваний C. moschata и C. pepo только тогда, когда кресты были сделаны в 04:00 утра с использованием пыльцы, хранящейся при 10 ° C в течение^{19 часов}. Баггетт скрестил восемь различных сортов C. moschata с C. pepo (delicata) и сообщил, что из 103 общих опылений было получено 83 плода, которые казались нормальными, но ни один из них не содержал жизнеспособных семян⁸. В помеси C. pepo (S179) и C. moschata (NK) Zhang et al. получили 15 плодов с 2 994 семенами, но только 12 из этих семян были жизнеспособными, в то время как остальные демонстрировали только рудиментарное развитие. Эти исследования показывают, что, хотя межвидовое скрещивание между C. moschata и C. pepo очень полезно, получение плодов с жизнеспособными семенами из скрещиваний требует¹⁶.

Спасение эмбрионов было предложено в качестве подходящего метода для преодоления проблем, возникающих в результате раннего аборта или плохо развитых эмбрионов, и является одним из самых ранних и наиболее успешных методов культивирования in vitro для регенерации незрелых эмбрионов ^16,20. Спасение эмбрионов включает в себя культуру in vitro недоразвитых/незрелых эмбрионов с последующим переносом в стерильную питательную среду для облегчения восстановления саженцев и, в конечном счете, зрелых растений²¹. Хотя спасение эмбрионов обычно используется в разведении сквоша, подробное описание соответствующей методологии, которая позволила бы его рутинное применение, отсутствует. Использование метода спасения эмбрионов для преодоления межвидовых барьеров гибридизации у видов Cucurbita было зарегистрировано еще в 1954^{году 22}. Тем не менее, успех спасения эмбрионов в ранних исследованиях был либо незарегистрированным, либо очень низким. Metwally et al. сообщили о 10% успехе (регенерация в зрелые растения) среди 100 межвидовых гибридных эмбрионов, спасенных от скрещивания C. pepo и C. martinezii²³. Sisko et al. сообщили о переменном уровне успеха регенерации эмбрионов среди эмбрионов, полученных из различных перекрестных комбинаций: скорость регенерации гибридов, полученных путем скрещивания C. maxima (Bos. Max) и C. pepo (Золотая лихорадка), составила 15,5%, для C. pepo (Zucchini) и C. moschata (Hokaido) составила 20%, в то время как для C. pepo (Золотая лихорадка) и C. moschata (Dolga) она составила 37,5%²⁴. Помимо генотипа, среды и условия культивирования in vitro являются важными факторами успеха методики^25,26. В текущем исследовании были протестированы различные перекрестные комбинации между C. moschata и C. pepo, и была разработана простая методология использования метода спасения эмбрионов в сквоше. Разработка простого и легко воспроизводимого метода спасения эмбрионов облегчит межвидовую гибридизацию и увеличение зародышевой плазмы в программах разведения сквоша.

1. Посадка и опыление

ПРИМЕЧАНИЕ: Важно определить совместимые генотипы, гибридизация которых приведет к завязыванию плодов и производству жизнеспособных эмбрионов.

1. Условия посадки и техническое обслуживание
   1. Получение семян генотипов кабачков (сортов/приращений) для гибридизации (табл. 1).
   2. Заполните 50-ячейковые стартовые плоскости (ширина 25 см x длина 50 см) горшечной средой, дополненной полным удобрением NPK, содержащим 1,38 г/кг N, 1,38 г/кг P и 1,38 г/кг K.
   3. Посейте семена на глубину, равную их длине, и засыпьте горшечной средой. Поливайте квартиры, не создавая стоячей воды. После этого держите носитель влажным, поливая его вручную один раз в день.
   4. На второй стадии пересаживают рассаду в горшки диаметром от 25 см до 30 см, дополненные полным удобрением NPK в 3 столовые ложки / горшок. Удобряйте растения один раз в неделю 500 мл /горшок жидкого удобрения, содержащего NPK 20:20:20, добавленного в концентрации 1 г на галлон воды.
   5. Поддерживайте растения в теплице при температуре 22-28 °C при естественном освещении. Для винных генотипов предусмотреть опорную шпалеру в теплице (рисунок 1).
2. Выполнение опыления
   1. Как правило, цветение кабачков начинается на 6-8 неделе с момента посева в зависимости от сорта (рисунок 2А,В). Начните делать контролируемые гибридизации (скрещивания), как только растения начнут цвести. В тепличных условиях опыление может производиться круглогодично.
   2. Определите мужские и женские цветки сортов C. pepo и C. moschata , которые будут готовы к опылению на следующий день. Чтобы определить такие цветы, проверьте наличие цветов, лепестки которых имеют желтый оттенок, но не открыты. Аккуратно заклейте цветы, закрытые сверху, используя маскировочную ленту, чтобы предотвратить случайное опыление насекомыми (рисунок 2C, D).
   3. Утром следующего дня цветки готовы к опылению. Проводят опыление до 10:00 утра для улучшения скорости успеха гибридизации²⁷.
   4. Откройте женские и мужские цветки, аккуратно удалив заклеенную верхнюю часть лепестков. Удалите лепестки с мужского цветка и перенесите пыльцу, аккуратно втирая пыльник в рыльце женского цветка (рисунок 3А).
   5. После опыления немедленно закройте опыленный женский цветок маскировочной лентой. Используйте метку, чтобы записать дату опыления и указать отцовских и материнских родителей, используемых в кресте (рисунок 3B).
   6. На успешное скрещивание указывает расширенный завязь, который быстро образует небольшой плод в течение 1 недели (рисунок 4А). Затем растение готово к сбору урожая через 45-55 дней после опыления²⁸ (рисунок 4B).

2. Техника спасения эмбрионов

1. Подготовка СМИ
   1. Подготовка запасов антибиотиков: Для цефотаксима (натриевой соли) растворите антибиотик в 4 мл деионизированной или дистиллированной воды, процедите через стерильный шприцевой фильтр 0,22 мкм и сделайте аликвоты 0,5 мл. Хранить при -20 °C. Полученный исходный раствор будет иметь концентрацию 250 мг/мл.
   2. Для ампициллина (натриевой соли) растворите порошок в 10 мл воды, процедите через стерильный шприцевой фильтр 0,22 мкм и аликвоту в запасе 1 мл с конечной концентрацией 100 мг/мл. Хранить при -20 °C.
   3. Сделайте среду Murashige и Skoog (MS), растворив 2,45 г среды (концентрация 4,91 г/л) в 500 мл дистиллированной воды в бутылке объемом 1 л. Добавить 1,5 г г геллановой камеди и автоклава при 121 °C в течение 20 мин. Геллановая камедь полностью растворяется во время автоклавирования.
   4. После автоклавирования охладите среду, поместив бутылку на водяную баню при температуре 50 °C. Извлеките запасы антибиотиков из морозильной камеры и разморозьте их в ламинарном проточном шкафу.
   5. Переложите среднюю бутылку на ламинарную вытяжку. Добавьте 0,6 мл раствора цефотаксима (250 мг/мл) и 0,25 мл запаса ампициллина (100 мг/мл) в средний флакон и хорошо перемешайте. Налейте около 7 мл среды в стерильную чашку Петри (60 мм х 15 мм).
   6. Дайте среде затвердеть в чашках Петри в течение примерно 15-20 минут. Закройте чашки Петри герметичной пленкой и поместите их в ящик для хранения. Хранить при комнатной температуре.
2. Спасение эмбрионов
   1. Перед началом работы очистите и стерилизуйте ламинарно-воздушный шкаф 70% этиловым спиртом.
   2. Соберите плоды кабачков, разбив/отрезав их от основной лозы, и продезинфицируйте поверхность плодов, промыв жидким моющим средством (например, 0,3% хлороксиленола) в лабораторной раковине до тех пор, пока вся рыхлая грязь не будет удалена (рисунок 5А).
   3. Смойте достаточным количеством водопроводной воды. Высушите фрукты чистыми бумажными полотенцами. Переместите плоды в ламинарно-воздушный шкаф (рисунок 5В).
   4. Поверхностную стерилизацию плодов путем распыления 70% этанола на плоды в стерильном ламинарно-воздушном шкафу. Разделите плоды пополам стерильным ножом (рисунок 5С) и извлеките семена.
   5. Используйте стерильные щипцы, чтобы асептически вскрыть семенную оболочку и обнажить незрелые эмбрионы (рисунок 6). Осторожно поместите незрелые эмбрионы в чашку Петри, содержащую РС-среду, дополненную цефотаксимом и ампициллином (рисунок 7А). Закройте чашку Петри и запечатайте упаковочной пленкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера эмбриона, можно поместить пять или шесть эмбрионов в чашку Петри.
   6. Поместите запечатанные чашки Петри с эмбрионами в камеру роста под 16 ч фотопериода при 25 °C и относительной влажности 70%. Если происходит загрязнение, своевременно субкультурируйте незагрязненные эмбрионы в новую пластину с той же средой.
   7. Семядоли начнут расширяться через 4 дня и станут зелеными через 10 дней (рисунок 7B). На этом этапе, при необходимости, выполните субкультуру в новые пластины, содержащие ту же среду, чтобы обеспечить расширение ткани. Корни начнут появляться через 14 дней (рисунок 7C), а через 21 день растения будут иметь расширенные корни и семядоли (рисунок 7D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Культуральная среда, используемая в протоколе, подходит для дифференциации на побеги и корни без дополнительных регуляторов роста.
   8. На этом этапе выньте растения из посуды Петри и аккуратно смойте среду с корней водопроводной водой (рисунок 8). Поместите сухари в пластиковый контейнер (14 см х 9 см х 4 см) и накройте корни влажными бумажными полотенцами (рисунок 9А). Накройте контейнер и при необходимости смажьте бумажные полотенца.
   9. Храните контейнеры при комнатной температуре (25-28 °C) и с 16-часовым фотопериодом. Этот шаг позволит акклиматизировать растения. После акклиматизации в течение 7-10 дней в контейнере рассада будет примерно 3-4 в длину. В этот период смачивайте бумажные полотенца по мере необходимости.
   10. Переложите рассаду в 50-ячейковые стартовые квартиры (ширина 25 см х 50 см длины), дополненные удобрением, как описано ранее, и переместите их в теплицу (рисунок 9B). Не переувлажняйте рассаду во избежание гниения; добавляйте приблизительно 10-20 мл на ячейку по мере необходимости.
   11. На второй-третьей стадии пересаживают рассаду в горшки диаметром 30 см, заполненные горшечной средой, дополненной удобрением, как описано ранее (рисунок 10А). Обеспечить решетчатую поддержку для виноградных растений и выполнить контролируемую гибридизацию, когда растения начинают цвести, как описано ранее (рисунок 10B).
   12. Поддерживайте растения в теплице при температуре 22-28 °C при естественном освещении. Оцените растения по характеристикам плодов и семян.

Набор плодов и жизнеспособность семян
Первоначальное испытание было проведено для определения набора плодов и жизнеспособности семян в различных перекрестных комбинациях. Всего было выбрано 15 генотипов кабачков, четыре C. pepo и 11 C. moschata (таблица 1). Из 24 попытавшихся межвидовых перекрестных комбинаций было получено фруктовое множество для 22 (таблица 2), что представляет собой общий успех >92% в наборе плодов. Зрелые плоды не были получены путем скрещивания O и M и E и J, в то время как наибольшее количество плодов (n = 6) было получено путем скрещивания F и J (таблица 2). Количество цветков, опыляемых для различных поперечных комбинаций, варьировалось от одного до 11, а успешность опыления колебалась от 0% до 100%. Количество цветков, опыляемых в разных поперечных сочетаниях, варьировалось в зависимости от количества цветочных наборов и синхронизации цветения среди мужских и женских цветков. Несмотря на то, что плоды были получены из всех скрещиваний, кроме двух, оценка плодов после их разрезания показала, что большинство плодов имели абортированные эмбрионы без жизнеспособных семян. Плоды из большинства скрещиваний выглядели нормально, но были лишены семян или состояли из семян с рудиментарными эмбрионами. В общей сложности 44 плода были получены из всех перекрестных комбинаций, и только один плод, полученный путем скрещивания C и J, имел плохо развитые эмбрионы, которые можно было восстановить с помощью метода спасения эмбрионов.

Спасение эмбрионов и дальнейшее продвижение
Межвидовой гибрид F1 , разработанный путем скрещивания C и J, имел в общей сложности 44 семени, но только 10 из них имели эмбрионы, которые можно было спасти для продвижения поколения. Остальные семена не имели эмбрионов. Все 10 эмбрионов культивировали в среде спасения эмбрионов и ежедневно проверяли их рост и развитие. Размер 10 незрелых эмбрионов варьировался от 3,51 мм до 8,26 мм. Успешность спасения эмбрионов составила 80%. Межвидовые гибриды F1 (мостовые линии), разработанные путем скрещивания C. moschata и C. pepo (C и J), содержали геномы обоих видов в соотношении 1:1 (50% каждый). Эти растения использовались в качестве мостовых линий для интрогрессии экономически важных признаков по двум видам. Например, пересечение этих мостовых линий с C. moschata приведет к гибридам с генетическим фоном 75% C. moschata и 25% C. pepo соответственно. Плоды, полученные из этих мостовых линий, имели смесь нежизнеспособных семян и семян с незрелыми эмбрионами, которые впоследствии требовали культивирования тканей для регенерации. Например, один из плодов имел в общей сложности 54 семени, среди которых 14 семян имели незрелые эмбрионы, которые были спасены с использованием протокола, описанного здесь.

Рисунок 1: Опорная шпалера для вертикально растущих растений кабачков в теплице. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Иллюстрация открытых и заклеенных цветов. Открытый (А) мужской и (В) женский цветок кабачков в теплице. (C) Заклеенный мужской цветок от родителя Cucurbita moschata по отцовской линии. (D) Заклеенный женский цветок от родителя Cucurbita pepo по материнской линии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Иллюстрация опыления. (А) Перенесите пыльцу с мужского цветка, аккуратно потирая пыльник о рыльце женского цветка. (B) После опыления заклейте женский цветок и используйте бирку, чтобы записать дату опыления и отцовских и материнских родителей, используемых в кресте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Набор плодов. (А) После опыления завязь быстро расширится, образуя небольшой плод в течение 1 недели. (B) Плоды готовы к сбору урожая через 45 дней после опыления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Приготовление фруктов. (А) Вымойте фрукты моющим средством. Соберите и продезинфицируйте поверхность плода, промыв его жидким моющим средством в лабораторной раковине. (B) Промойте и высушите плоды. Высушите фрукты чистыми бумажными полотенцами, после ополаскивания достаточным количеством водопроводной воды, и переместите их в ламинарно-воздушный шкаф. (C) Рассейте плод пополам стерильным ножом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Извлеките эмбрион из семян. Используйте стерильные щипцы, чтобы асептически открыть оболочку семян и обнажить незрелый эмбрион. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Регенерация эмбрионов в среде РС. (А) Осторожно поместите незрелые эмбрионы в чашку Петри, содержащую РС-среду. (B) Семядоли расширятся и станут зелеными в течение 10 дней. (C) Корни начнут появляться через 14 дней. (D) Через 21 день растения будут иметь расширенные корни и семядоли, которые готовы к переносу в пластиковый контейнер для акклиматизации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Промыть корни. Выньте растения из посуды Петри и аккуратно смойте среду с корней водопроводной водой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9: Акклиматизируйте растения. (А) Поместите растения в пластиковый контейнер и накройте корни влажным бумажным полотенцем на 5 дней, чтобы акклиматизировать их. (B) Переложите саженцы в ячейки, содержащие коммерческую горшечную смесь, дополненную полным удобрением NPK. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 10: Пересадите рассаду в горшки. (А) На втором-третьем стадии пересаживают рассаду в горшки диаметром 30 см, заполненные горшечной средой, дополненной удобрением. (B) Обеспечивают решетчатую поддержку для винных растений и обеспечивают контролируемую гибридизацию, когда растения начинают цвести. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: В общей сложности 15 генотипов кабачков, четыре C. pepo и 11 C. moschata, были использованы в исследовании для межвидовых скрещиваний.

Таблица 2: Попытки перекрестных комбинаций с 15 генотипами тыквы и соответствующим набором плодов, количеством абортированных семян, незрелыми эмбрионами и успешным спасением эмбрионов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.