Method Article

Визуализация динамики связи актина и микротрубочек in vitro с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF)

DOI:

10.3791/64074

⸱

July 20th, 2022

1Department of Biochemistry & Molecular Biology, and Department of Neuroscience & Physiology, State University of New York (SUNY) Upstate Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол является руководством для визуализации динамических актинов и микротрубочек с использованием микроскопического анализа in vitro полной внутренней флуоресценции (TIRF).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционно цитоскелеты актина и микротрубочек изучались как отдельные объекты, ограниченные конкретными клеточными областями или процессами и регулируемые различными наборами связывающих белков, уникальных для каждого полимера. Многие исследования в настоящее время демонстрируют, что динамика обоих цитоскелетных полимеров переплетена и что эти перекрестные помехи необходимы для большинства клеточных моделей поведения. Ряд белков, участвующих во взаимодействиях актин-микротрубочки, уже идентифицирован (т.е. Тау, МАКФ, ГАЗ, формины и т.д.) и хорошо охарактеризованы в отношении только актина или микротрубочек. Однако относительно немногие исследования показали анализы координации актин-микротрубочек с динамическими версиями обоих полимеров. Это может перекрыть возникающие механизмы связи между актином и микротрубочками. Здесь метод полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) на основе микроскопии in vitro позволяет визуализировать динамику как актина, так и микротрубочек из одной биохимической реакции. Этот метод сохраняет динамику полимеризации либо актиновой нити, либо микротрубочек по отдельности или в присутствии другого полимера. Коммерчески доступный тау-белок используется для демонстрации того, как поведение актин-микротрубочек изменяется в присутствии классического цитоскелетного сшивающего белка. Этот метод может обеспечить надежное функциональное и механистическое понимание того, как отдельные регуляторные белки координируют динамику актин-микротрубочек при разрешении отдельных нитей или комплексов более высокого порядка.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исторически актин и микротрубочки рассматривались как отдельные сущности, каждая со своим собственным набором регуляторных белков, динамическим поведением и различными клеточными местоположениями. Многочисленные данные в настоящее время демонстрируют, что полимеры актина и микротрубочек участвуют в функциональных механизмах перекрестных помех, которые необходимы для выполнения многочисленных клеточных процессов, включая миграцию, позиционирование митотического веретена, внутриклеточный транспорт и морфологию клеток 1,2,3,4. Разнообразное скоординированное поведение, лежащее в основе этих примеров, зависит от сложного баланса факторов связи, сигналов и физических свойств. Тем не менее, молекулярные детали, лежащие в основе этих механизмов, до сих пор в значительной степени неизвестны, потому что большинство исследований сосредоточены на одном цитоскелетном полимере за раз 1,2,5.

Актин и микротрубочки напрямую не взаимодействуют 6,7,8. Скоординированная динамика актина и микротрубочек, наблюдаемая в клетках, опосредована дополнительными факторами. Многие белки, которые, как считается, регулируют перекрестные помехи актин-микротрубочки, были идентифицированы, и их активность хорошо характеризуется в отношении только цитоскелетного полимера 1,2. Растущие данные свидетельствуют о том, что этот однополимерный подход скрыл двойные функции некоторых белков / комплексов, которые позволяют событиям связи актин-микротрубочки 7,8,9,10,11,12,13. Эксперименты, в которых присутствуют оба полимера, редки и часто определяют механизмы с одним динамическим полимером и статически стабилизированной версией других 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 . Таким образом, необходимы методы для исследования эмерджентных свойств белков, координирующих актин-микротрубочки, которые могут быть полностью поняты только в экспериментальных системах, использующих оба динамических полимера.

Комбинация подходов к прямой маркировке белка, генетически закодированных меток сродства и микроскопии полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) была применена с большим успехом в системах биомиметического восстановления 19,20,21,22,23. Многие схемы «снизу вверх» не содержат всех факторов, регулирующих белки в клетках. Однако технология «биохимия на покровном стекле» усовершенствовала многие механизмы динамики актина и микротрубочек в высоких пространственных и временных масштабах, включая компоненты, необходимые для сборки или разборки полимеров, и движение моторного белка 5,12,23,24,25,26,27 . Здесь описан минимальнокомпонентный однонитевой подход к исследованию связи актин-микротрубочек in vitro. Этот протокол может быть использован с коммерчески доступными или высокочистыми очищенными белками, флуоресцентно мечеными белками, перфузионными камерами и распространен на более сложные схемы, содержащие клеточные экстракты или синтетические системы. Здесь коммерчески доступный тау-белок используется для демонстрации того, как динамика цитоскелета изменяется в присутствии белка связи актин-микротрубочки, но может быть заменен другими предполагаемыми кодирующими факторы актин-микротрубочки. Основным преимуществом этой системы перед другими подходами является возможность одновременного мониторинга динамики нескольких цитоскелетных полимеров в одной реакции. Этот протокол также предоставляет пользователям примеры и простые инструменты для количественной оценки изменений цитоскелетных полимеров. Таким образом, пользователи протокола будут получать надежные, количественные данные о разрешении одной нити для описания механизмов, лежащих в основе того, как разнообразные регуляторные белки координируют динамику актин-микротрубочек.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Мытье обшивки

ПРИМЕЧАНИЕ: Стирка (24 мм x 60 мм, #1.5) обшивки согласно Smith et al., 201328.

  1. Расположите крышки в пластиковом контейнере для скользящей почтовой рассылки.
  2. Погружайте покровы последовательно в следующие растворы и обрабатывайте ультразвуком в течение 30-60 мин, промывая ddH2O 10 раз между каждым раствором: ddH2Oс одной каплей мыла для посуды; 0,1 М КОН. Храните крышки в 100% этаноле до 6 месяцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к стеклянным поверхностям нелюбимыми пальцами. Вместо этого используйте щипцы.

2. Покрытия очищенные (24 мм x 60 мм, #1.5) крышки с mPEG- и биотин-ПЭГ-силаном

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол специально использует систему биотин-стрептавидин для позиционирования актина и микротрубочек в плоскости визуализации TIRF. Могут быть использованы другие покрытия и системы (например, антитела, поли-L-лизин, миозин NEM и т.д.).

  1. Разморозить аликвоты порошков ПЭГ-силана и биотина-ПЭГ-силана.
  2. Растворите порошки ПЭГ в 80% этаноле (рН 2,0) для получения растворов покрытия 10 мг/мл mPEG-силана и 2-4 мг/мл биотина-ПЭГ-силана непосредственно перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Порошки ПЭГ часто кажутся растворенными, но могут быть не на микроскопическом уровне. Правильное повторное суспендирование занимает ~1-2 мин при постоянной пипетке. Пользователям рекомендуется пипетку еще 10 раз после появления растворения порошка.
    ВНИМАНИЕ: Надевайте перчатки для защиты кожи от концентрированного HCl при производстве 80% этанола (рН 2,0).
  3. Снимите чистую (24 мм х 60 мм, #1.5) крышку из хранилища этанола с помощью щипцов. Высушите газообразным азотом и храните в чистой чашке Петри.
  4. Облицовка покрытия 100 мкл раствора покрытия: смесь 2 мг/мл mPEG-силана (MW 2000) и 0,04 мг/мл биотина-ПЭГ-силана (MW 3,400) в 80% этаноле (рН 2,0).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для разреженного покрытия (рекомендуется) используйте 2 мг/мл mPEG-силана и 0,04 мг/мл биотина-ПЭГ-силана. Для плотного покрытия используют 2 мг/мл мПЕГ-силан, 4 мг/мл биотина-ПЭГ-силана.
  5. Инкубировать крышки при 70 °C в течение не менее 18 ч или до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытые крышки разлагаются при хранении при температуре 70 °C более 2 недель.

3. Сборка проточных камер визуализации

  1. Вырежьте 12 полосок двусторонней ленты с двойной подложкой длиной до 24 мм. Снимите одну сторону подложки ленты и закрепите куски ленты рядом с шестью канавками, присутствующими на чистой камере визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лента должна быть плоской для правильной сборки, иначе камеры визуализации будут протекать. Осторожно снимите подложку ленты, чтобы избежать ударов. Рекомендуется скольжение клееных камер на чистой поверхности для сглаживания контактов ленточной камеры.
  2. Снимите второй кусок подложки ленты, чтобы обнажить липкую сторону ленты вдоль каждой канавки камеры. Поместите камерную ленту стороной вверх на чистую поверхность.
  3. Смешайте растворы эпоксидной смолы и отвердителя 1:1 (или в соответствии с инструкциями производителя) в небольшой весовой лодке.
  4. Используйте наконечник P1000, чтобы поместить каплю смешанной эпоксидной смолы между ленточными полосками на конце каждой канавки камеры визуализации (красная стрелка; Рисунок 1А). Поместите камерную ленту/эпоксидную смолу стороной вверх на чистую поверхность.
  5. Снимите покрытую оболочкой крышку инкубатора с температурой 70 °C. Промыть покрытые и непокрытые поверхности покровных пластин ddH2O шесть раз, высушить фильтрованным газообразным азотом, а затем прикрепить к камере визуализации стороной покрытия крышки по направлению к ленте.
  6. Используйте наконечник пипетки P200 или P1000 для оказания давления на интерфейс лента-стекло, чтобы обеспечить хорошее уплотнение между лентой и крышкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При правильном уплотнении двусторонняя лента становится полупрозрачной. Камеры визуализации, в которых отсутствует достаточное количество контактов ленточной камеры, будут протекать.
  7. Инкубировать собранные камеры при комнатной температуре не менее 5-10 мин, чтобы позволить эпоксидной смоле полностью загерметизировать камерные колодцы перед использованием. Перфузионные камеры истекают в течение 12-18 ч после сборки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размещения ленты и толщины используемой двусторонней ленты, собранная камера будет иметь конечный объем 20-50 мкл.

4. Кондиционирование перфузионных камер

  1. Используйте перфузионный насос (скорость установлена на уровне 500 мкл/мин) для последовательного обмена кондиционирующими растворами в перфузионной камере следующим образом:
    1. Расход 50 мкл 1% BSA для грунтовки камеры визуализации. Извлеките лишний буфер из резервуара luer.
    2. Расход 50 мкл 0,005 мг/мл стрептавидина. Инкубировать в течение 1-2 мин при комнатной температуре. Удалите лишний буфер из резервуара.
    3. Расход 50 мкл 1% BSA для блокирования неспецифического связывания. Инкубировать в течение 10-30 с. Удалите лишний буфер из резервуара.
    4. Поток 50 мкл теплого (37 °C) 1x TIRF буфера (1x BRB80, 50 мМ KCl, 10 мМ DTT, 40 мМ глюкозы, 0,25% (v/v) метилцеллюлозы (4,000 cp)).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не удаляйте лишний буфер из резервуара. Это предотвращает высыхание камеры, что может привести к появлению пузырьков воздуха в системе.
    5. Необязательно: Поток 50 мкл стабилизированных29 и 50% биотинилированных семян микротрубочек, разбавленных в 1x буфере TIRF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Надлежащее разбавление должно быть определено эмпирически и содержать изменчивость от партии к партии. В качестве отправных точек рекомендуются протоколы из 27,29. Разбавление, дающее 10-30 семян на поле зрения, хорошо работает с этой установкой.

5. Подготовка микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Биохимические реакции, содержащие динамические актиновые нити и микротрубочки, визуализируются/выполняются с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа с полным внутренним отражением (TIRF), оснащенного твердотельными лазерами мощностью 120-150 мВт, объективом TIRF с коррекцией температуры 63x погружения в масло и камерой EMCCD. Белки в этом примере визуализируются на следующих длинах волн: 488 нм (микротрубочки) и 647 нм (актин).

  1. Установите устройство нагревателя ступени/объектива на поддержание температуры 35-37 °C не менее чем за 30 минут до визуализации первой биохимической реакции.
  2. Задайте параметры получения изображения следующим образом:
    1. Установите интервал приема каждые 5 с в течение 15-20 мин.
    2. Установите 488 и 647 лазерных воздействий на 50-100 мс при мощности 5%-10%. Установите соответствующий угол TIRF для микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Независимо от настройки микроскопа, самый простой способ установить мощность лазера, экспозицию и угол TIRF - это внести коррективы в изображения любого полимера в одиночку (см. пункты 5.2.2.1 и 5.2.2.2 ниже). Пользователям настоятельно рекомендуется использовать самые низкие настройки мощности лазера и экспозиции, которые по-прежнему позволяют обнаруживать.
      1. Отрегулируйте реакцию полимеризации (рисунок 1С), чтобы инициировать сборку актиновой нити и получить изображения при 647 нм. Внесите соответствующие коррективы.
      2. Отрегулируйте реакцию полимеризации во второй кондиционированной перфузионной скважине, чтобы инициировать сборку микротрубочек (рисунок 1С) и визуализировать при 488 нм. Внесите соответствующие коррективы.

6. Приготовление белковых реакционных смесей

  1. Приготовьте бульонный раствор флуоресцентно меченого тубулина.
    1. Определить концентрацию домашнего немаркированного тубулина с помощью спектрофотометрии при ABS280 следующим образом:
      1. Пустой спектрофотометр с 1xBRB80 без ГТП.
      2. Рассчитать концентрацию тубулина можно по определенному коэффициенту вымирания 115 000 М-1 см-1 и следующей формуле:
        figure-protocol-1
    2. Повторное суспендирование коммерчески производимого лиофилизированного лизина с маркировкой 488-тубулина до 10 мкМ (1 мг/мл; 100% этикетка) с 20 мкл 1x BRB80 без ГТФ.
    3. Разморозьте 7,2 мкл аликвоты 100 мкМ немаркированного переработанного тубулина29 на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переработанный тубулин имеет решающее значение для успешной сборки микротрубочек in vitro, поскольку он удаляет полимеризующие некомпетентные димеры, образующиеся в замороженных белковых запасах29,30.
    4. Соедините 3 мкл 10 мкМ 488-тубулина с 7,2 мкл аликвотой 100 мкМ немаркированного тубулина не более чем за 15 мин до применения.
  2. Приготовьте запасной раствор флуоресцентно меченого актина.
    1. Для домашних белков определите концентрацию и процентную метку актина с помощью спектрофотометрии Abs290 и Abs650 следующим образом:
      1. Пустой спектрофотометр с G-буфером.
      2. Рассчитать концентрацию немаркированного актина, используя определенный коэффициент вымирания 25 974 М-1 см-1 и следующую формулу:
        figure-protocol-2
      3. Рассчитайте концентрацию лизина, меченного Alexa-647-актином, используя коэффициент вымирания немаркированного актина, коэффициент коррекции фтора 0,03 и следующую формулу:
        [Алекса-647 актин], мкМ = (Abs290 - figure-protocol-3
      4. Рассчитайте процент метки Alexa-647-актина, используя определенный ε для Alexa-647 239 000 M-1 см-1, следующим образом:
        % метка Alexa-647-актина = (Abs290 - (figure-protocol-4
    2. Разморозьте одну аликвоту 2 мкл 3 мкМ 100% меченого биотин-актина (меченого на остатках лизина). Разбавить в 10 раз, добавив 18 мкл G-буфера.
    3. Смешайте 3 мкл разбавленного биотинилированного актина, соответствующие объемы немаркированного и меченого актина (выше) таким образом, чтобы конечная смесь составила 12,5 мкМ общего актина с 10%-30% флуоресцентной меткой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более 30% процентов флуоресцентных мономеров актина (конечные) могут поставить под угрозу разрешение изображения, поскольку нити становятся трудно различимыми с фона.
  3. Готовят реакционные смеси (рис. 1С).
    1. Готовят цитоскелетную смесь (трубку А), соединяя 2 мкл из 12,5 мкМ актиновой смеси (6,2,3) со смесью тубулина (6,1,4), не более чем за 15 мин до визуализации. Хранить на льду до использования.
    2. Приготовьте белковую реакционную смесь (tube B), объединив все другие экспериментальные компоненты и белки, в том числе: 2x TIRF-буфер, антибелоотей, нуклеотиды, буферы и вспомогательные белки. Пример показан на рисунке 1С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечное разбавление приводит к 1-кратному буферу TIRF, который содержит АТФ, ГТФ и ионную силу в пределах расчетного физиологического диапазона.
  4. Инкубировать трубку A и трубку B отдельно при 37 °C в течение 30-60 с. Чтобы начать реакцию, перемешайте и добавьте содержимое трубки B в трубку A (ниже).

7. Динамика актина изображения и микротрубочек

  1. Состояние перфузионной скважины (рисунок 1B; шаг 4, выше).
  2. Инициируют сборку актина и микротрубочек одновременно, добавляя содержимое трубки В (реакционная смесь) в трубку А (смесь цитоскелетов) (рисунок 1С).
  3. Поток 50 мкл реакции, содержащий 1x TIRF буфер, дополненный 15 мкМ свободного тубулина, 1 мМ ГТФ и 0,5 мкМ актиновых мономеров и соответствующими объемами буферных регуляторов.
  4. Записывайте покадровое видео с помощью программного обеспечения микроскопа для получения каждые 5 с в течение 15-20 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инициация динамики актина и микротрубочек происходит в течение 2-5 мин (рисунок 2). Более длительные задержки указывают на проблемы с контролем температуры или проблемы, связанные с концентрацией белков в реакционной смеси.
  5. Обусловите новую перфузионную скважину (этап 4) и замените буферный объем регуляторным белком (белками), представляющими интерес (т.е. тау) и буферными элементами управления (рисунок 1С). Приобретайте, как описано на этапе 7 (выше), для оценки регуляторных белков для эмерджентных функций актин-микротрубочек.

8. Обработка и анализ изображений с помощью программного обеспечения FIJI31

  1. Откройте сохраненные фильмы TIRF и просмотрите их как составные.
  2. Проанализируйте динамику микротрубочек (рисунок 3А) следующим образом:
    1. Создайте максимальную Z-проекцию на основе времени из меню стеков изображений.
    2. Синхронизируйте окно Z-проекции с оригинальным фильмом TIRF из меню Анализ> Инструменты> Синхронизировать Windows .
    3. Нарисуйте линию с помощью инструмента «прямая линия» вдоль интересующей микротрубочки на проецируемом во времени изображении.
      1. Откройте менеджер интересующей области (ROI) из меню анализа (Analyze> Tools> ROI Manager).
      2. Сохраните отдельные расположения микротрубочек, нажав клавишу «t». Повторите для всех интересующих микротрубочек.
    4. Нанесите кимографы выбранных линий с помощью «/» или запустите мультикимо макрос, который генерирует видео и кимограф для каждой микротрубочки в менеджере ROI31.
      1. Добавьте к кимографам полосы масштаба длины (мкм) и времени (мин) из меню Анализ> Инструменты> Шкала .
    5. Измерение скорости роста микротрубочек по склонам кимографа (рисунок 3А, 1-2; наклон черных линий).
    6. Подсчет динамических событий микротрубочек (катастрофа или возобновление роста) из сгенерированного кимографа или с помощью имеющихся макросов анализа 5,8,18,25. Красные пунктирные линии на рисунке 3A, 1-2 представляют события катастрофы/быстрой разборки.
  3. Проанализируйте динамику актина (рисунок 3B) следующим образом:
    1. Измерьте нуклеацию актина следующим образом:
      1. Подсчитайте количество актиновых нитей, присутствующих в поле зрения через 100 с после начала реакции и экспрессируйте по площади (нити намкм2).
      2. Записывайте и сохраняйте данные в менеджере ROI, как в шаге 8.2.3.1 выше.
    2. Измерьте скорость удлинения актиновой нити (рисунок 3B) следующим образом:
      1. Нарисуйте линию вдоль интересующей актиновой нити с помощью инструмента сегментированной линии.
      2. Добавьте строку в менеджер ROI, как показано в шаге 8.2.3.1 выше.
      3. Повторите следующие действия (добавляя каждое измерение в менеджер ROI) не менее четырех кадров фильма.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется измерение семи-восьми последовательных кадров, однако некоторые условия замедляют полимеризацию актина ниже обнаруживаемого предела, который может быть разрешен с помощью объектива / микроскопа. В таком случае измерения могут производиться через равные промежутки времени в непоследовательных кадрах (например, каждые пять кадров).
      4. График измеренных значений длины за прошедшее время. Наклон генерируемой линии представляет собой скорость удлинения актина в мкм/с.
      5. Передавать конечные расчетные скорости в виде субъединиц s-1 мкМ-1 с использованием поправочного коэффициента 370 субъединиц для учета числа мономеров актина в микроне нитинакала 32.
  4. Выполните корреляционный анализ для областей параллельной ассоциации актин-микротрубочек (рисунок 3C) следующим образом:
    1. Проведите линию вдоль интересующей микротрубочки в определенный момент времени (т.е. через 300 с после начала реакции), используя инструмент прямой линии.
      1. Добавьте строку в менеджер ROI, как показано в шаге 8.2.3.1 выше.
    2. График интенсивности флуоресценции вдоль линии в каждом канале.
      1. Выберите каждый канал с помощью ползунка изображения и нанесите интенсивность вдоль строки с помощью команды k.
      2. Сохраните или экспортируйте значения, нажав кнопку «список» в окне вывода.
    3. Экспрессия событий связи актин-микротрубочек в виде соотношения (перекрытие актина с микротрубочками) от отдельных событий или как количество событий в данном поле зрения в согласованной точке времени (рисунок 3C).
    4. Альтернатива: Используйте программное обеспечение для определения процента перекрытия обоих каналов 5,12.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При условиях, описанных выше (рисунок 1), полимеры актина и микротрубочек должны быть видимыми (и динамическими) в течение 2 мин после получения изображения (рисунок 2). Как и в случае с любым протоколом, основанным на биохимии, оптимизация может потребоваться для различных регуляторных белков или партий белка. По этим причинам угол TIRF и экспозиция изображения устанавливаются в первую очередь с реакциями, содержащими каждый отдельный полимер. Это подтверждает, что хранимые белки функциональны и достаточно меченого белка присутствует для обнаружения. Хотя это не всегда необходимо (и не выполняется здесь), постобработка фильмов (т.е. вычитание фона, усреднение или преобразования Фурье) может быть использована для повышения контрастности изображения (особенно микротрубочек)5,25,33. Прямая визуализация одиночных актиновых нитей и микротрубочек, обеспечиваемая этим анализом, поддерживает количественное определение нескольких динамических показателей для компонента цитоскелета отдельно или вместе, включая параметры полимеризации (т.е. скорость зародыша или удлинения), параметры разборки (т.е. скорость усадки или катастрофы) и угольное выравнивание/перекрытие полимера (рисунок 3). ). Кроме того, эти меры могут быть использованы в качестве отправной точки для расшифровки связывания или влияния регуляторных лигандов, таких как тау (рисунок 3). Многие измерения одиночных актиновых нитей или микротрубочек могут быть сделаны из одного фильма TIRF. Однако из-за различий в покрытии крышки, пипетке и других факторах надежные измерения должны также включать в себя несколько технических реплицированных реакций / фильмов.

Многие аспекты динамики микротрубочек могут быть определены на примере кимографов, включая скорость удлинения микротрубочек, а также частоту катастроф и спасательных событий (рисунок 3А). Использование кимографов для измерения динамики актина в этой системе не так просто, потому что актиновые нити более запутаны, чем микротрубочки. Как следствие, параметры динамики актиновой нити измеряются вручную, что является трудоемким и трудоемким. Количество нуклеаций измеряется как количество актиновых нитей, присутствующих в последовательной точке времени для всех условий. Эти подсчеты широко варьируются в зависимости от полей визуализации TIRF, но могут использоваться со многими репликами или для дополнения наблюдений из других анализов полимеризации. Количество зародышей также может быть использовано для микротрубочек, если в условиях испытаний отсутствуют стабилизированные семена микротрубочек. Скорость удлинения актиновой нити измеряется как длина нити накала с течением времени по меньшей мере из четырех кадров фильма. Значения скорости передаются на микромолярный актин с поправочным коэффициентом 370 субъединиц для учета количества мономеров актина в микроне нити накала (фиг.3В)32. Измерения для определения скоординированного поведения между актином и микротрубочками менее четко определены. Тем не менее, корреляционный анализ был применен для измерения совпадения обоих полимеров, включая сканирование линий (рисунок 3C) или перекрывающее программное обеспечение 5,11,34.

Доступность данных:
Все наборы данных, связанные с этой работой, были депонированы в Zenodo и доступны по обоснованному запросу по адресу: 10.5281/zenodo.6368327.

figure-results-1
Рисунок 1. Экспериментальные схемы: сборка проточной камеры для получения изображения. (A) Сборка камеры визуализации. Сверху вниз: камеры визуализации IBIDI проклеены вдоль перфузионных скважин (обозначены стрелкой); второй (белый) слой ленточной подложки (оставленный на изображении, показанном для лучшего ориентации пользователей) удаляется и эпоксидная смола наносится на край перфузионной камеры (стрелка). Примечание: Чтобы легче ориентировать пользователей, где разместить эпоксидную смолу, на этом изображении была оставлена белая подложка. Очищенная и покрытая крышка прикреплена к камере визуализации стороной покрытия, обращенной к внутренней части перфузионного колодца. (B) Блок-схема, иллюстрирующая этапы кондиционирования камер визуализации для связей биотин-стрептавидин. С) Примеры реакций, используемых для получения фильмов TIRF динамических микротрубочек и актиновых нитей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2. Изображения последовательностей растущих актиновых нитей и микротрубочек при отсутствии или присутствии тау. Покадровый монтаж изображения из анализов TIRF, содержащих 0,5 мкМ актина (10% Alexa-647-актина и 0,09% биотин-актина) и 15 мкМ свободного тубулина (4% HiLyte-488 меченого) в отсутствие (A) или присутствие (B) 250 нМ тау. Показано время, прошедшее с момента начала реакции (смешивание трубки А и трубки В). Шкала, 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3. Пример измерений динамики микротрубочек и актиновых нитей. (A) Средняя временная проекция канала тубулина эффективно визуализирует общую длину микротрубочек для сканирования линий, используемых для создания графиков кимографа. Черные пунктирные линии соответствуют двум примерам кимографов динамических микротрубочек, показанным справа. На каждом кимографе показаны фазы роста (сплошные черные линии) и разборки (пунктирные розовые линии; две обозначены розовыми стрелками) микротрубочек. Шкала времени, 3 мин. Длина шкалы, 10 мкм. Реакция содержит 0,5 мкМ актина (10% 647-метки) и 15 мкМ свободного тубулина (4% 488-HiLyte метки). Показан только канал тубулина. (B) Два примера покадровых монтажей изображений, изображающих одноактиновые нити, активно полимеризующиеся. Скорости относительного удлинения рассчитываются как наклон участков длины актиновых нитей с течением времени на микромолярный актин. Таким образом, поправочный коэффициент, равный двум, должен быть применен к актиновым реакциям 0,5 мкМ для сравнения скоростей, обычно определяемых при концентрации актина 1 мкМ. Примеры из пяти нитей показаны справа. Шкала стержней, 10 мкм. Реакция содержит 0,5 мкМ актина (10% 647-метки) и 15 мкМ свободного тубулина (4% 488-HiLyte метки). Показан только канал актина. (C) TIRF изображения динамических микротрубочек (MT) (зеленый) и актиновых нитей (фиолетовый), полимеризующихся в отсутствие (слева) или в присутствии 250 нМ тау (посередине). Синие пунктирные линии и стрелки обозначают, где была нарисована линия для графиков сканирования линий, соответствующих каждому условию (под каждым изображением). Перекрытие между микротрубочками и актиновыми областями (показано черным) может быть оценено в заданный момент времени для каждой области (справа). Шкала стержней, 25 мкм. Реакции содержат 0,5 мкМ актина (10% 647-метки) и 15 мкМ свободного тубулина (4% метки 488-HiLyte) с 250 нМ тау или без него. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF) для визуализации очищенных белков было плодотворным и убедительным подходом к препарированию уникальных механизмов цитоскелетной регуляции 5,23,24,25,26,27,35. По сравнению с традиционными биохимическими анализами, реакции TIRF требуют очень малых объемов (50-100 мкл), а количественные измерения динамики цитоскелета могут быть получены из отдельного анализа. Большинство исследований динамики цитоскелета сосредоточены на одной полимерной системе (т.е. актиновых нитях или микротрубочках), поэтому подробные измерения перекрестных помех или эмерджентного поведения между актиновыми нитями и микротрубочками, обычно наблюдаемые в клетках, остаются неуловимыми и их трудно повторить в пробирке. Чтобы решить эту проблему, этот протокол описывает систему микроскопии TIRF с одной нитью, которая позволяет непосредственно визуализировать динамические полимеры актина и микротрубочек в одной и той же биохимической реакции. Таким образом, этот метод выходит за рамки традиционных анализов, которые повторяют динамическое поведение только актиновых нитей или микротрубочек. Этот метод также был выполнен с тау в качестве примера того, как несколько динамических свойств изменяются в присутствии фактора связи цитоскелетов. Этот протокол может быть использован с дополнительными белками, известными или подозреваемыми для координации динамики актина или микротрубочек, включая (но не ограничиваясь) MACF, GAS, формины и многое другое. Наконец, предоставленные примеры анализа могут быть использованы в качестве руководства для количественной оценки данных, полученных с помощью этого протокола.

«Видеть — значит верить» — это веская причина для проведения анализов на основе микроскопии. Однако при проведении и интерпретации экспериментов по микроскопии TIRF требуется осторожность. Одна из основных проблем цитоскелетных анализов совместной сборки заключается в том, что многие часто используемые условия визуализации не совместимы с каждым полимером. Микротрубочки и актин обычно имеют различные требования к буферу, температуре, соли, нуклеотидам и концентрации для полимеризации. Актин, тубулин, регуляторные белки, представляющие интерес, и буферы, используемые в этом протоколе, чувствительны к циклам замораживания-оттаивания. Поэтому для успешного выполнения этого протокола необходимо тщательное обращение с белками и буферами. Чтобы облегчить многие из этих проблем, настоятельно рекомендуется использовать свежепереработанный тубулин (замороженный в течение <6 недель) и предварительную очистку замороженных / повторно суспендированных актинов с помощью ультрацентрифугирования. Эти соображения также применимы к множеству регуляторных белков, подлежащих оценке с помощью этой процедуры, которые могут быть чувствительны к циклам замораживания-оттаивания или концентрации буферных солей 5,11,36.

К сожалению, не существует универсального буфера без экспериментальных компромиссов. Для присвоения большего объема белкам более низкой концентрации АТФ и ГТФ могут быть включены в 2-кратный буферный раствор TIRF (рис. 1С). Однако, поскольку эти нуклеотиды чрезвычайно чувствительны к циклам замораживания-оттаивания, это не рекомендуется. Используемые здесь кислородопоглощающие соединения (т.е. каталаза и глюкозооксидаза) необходимы для визуализации белков в течение длительных периодов времени (от минут до часов), но, как известно, ограничивают полимеризацию микротрубочек при высоких концентрациях5. В связи с этими буферными соображениями ограничение этого протокола заключается в том, что некоторым каноническим регуляторным белкам, связанным с микротрубочками, может потребоваться больше или меньше соли для рекапитуляции функций, обнаруженных в клетках или анализах с использованием одних только микротрубочек (без актина). Изменение природы или концентрации соли для решения этих проблем, вероятно, повлияет на скорость полимеризации актиновой нити и/или параметры динамики микротрубочек. Измерения нескольких описательных параметров (минимально, нуклеации, скорости удлинения и стабильности) (рисунок 3) необходимы для подтверждения успеха протокола или для явного документирования эффектов конкретных буферов или регуляторных белков. Например, слишком большая полимеризация актиновой нити может скрыть события связи актин-микротрубочки в течение нескольких секунд. Следовательно, тонкая настройка экспериментальных условий путем снижения общей концентрации актина или включения дополнительных белков для подавления нуклеации актина (т.е. профилина) продлит общий период, в течение которого можно будет четко увидеть скоординированную активность актин-микротрубочек. Элементы управления, отвечающие этим предварительным требованиям, и технические реплики (за пределами нескольких полей зрения) имеют решающее значение для пользователей для получения надежных и воспроизводимых результатов.

Клеточные исследования дают ограниченную возможность наблюдать прямые белково-белковые отношения или действие регуляторных комплексов. Напротив, некоторые из механизмов, почерпнутых из анализов in vitro, не всегда отражают точное поведение белков, наблюдаемое в клетках. Эта классическая дилемма биохимика может быть решена в будущих применениях этого метода с конкретными модификациями. Например, добавление функциональных флуоресцентно меченых соединительных белков расширяет этот метод от исследований с одной нитью до исследований с одной молекулой. Анализы могут быть дополнительно модифицированы для использования клеточных экстрактов, которые могут добавить «отсутствующие» неизвестные ключевые факторы, необходимые для повторения клеточных явлений. Например, анализы на основе TIRF с использованием дрожжей или экстрактов xenopus имеют восстановленные сократительные актомиозиновые кольца37, митотические веретена26,38, компоненты актина или сборки микротрубочек39,40 и даже динамику у центросом и кинетохоров 36,41,42,43 . Более того, такие системы могут проложить путь к системам искусственных клеток, которые имеют липиды или сигнальные факторы, присутствующие 44,45,46.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет никаких конфликтов интересов для раскрытия.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Я благодарен Марку Ридилье (Repair Biotechnologies) и Брайану Хаареру (SUNY Upstate) за полезные комментарии по этому протоколу. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (GM133485).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1% BSA (w/v)Fisher ScientificBP1600-100Для этой цели (блокирование камер TIRF) BSA ресуспендируют в ddH20 и фильтруют через 0,22 µ м.
1&раз; BRB80Самодельные80 мМ ТРУБКИ, 1 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, pH 6,8 с KOH
10 мг/мл (1000 U) глюкозооксидазыSigma Aldrich Inc, St. Louis, MOG2133-50KUВ сочетании с каталазой, аликвотой и хранением при -80 oC до использования
100 &; M tubulinCytoskeleton Inc, Denver, COT240Домашние тубулины должны быть переработаны перед использованием для удаления неспособного к полимеризации тубулина (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Коммерчески доступные тубулины часто слишком разбавлены для переработки, но хорошо функционируют при ресуспендии в соответствии с рекомендациями производителя и предварительно очищают с помощью ультрацентрифугирования (278 000 × g) в течение 60 минут перед использованием.
100 мМ ATPGold Biotechnology Inc, Olivette, MOA-081Ресуспендирован в ddH20 (pH 7,5) и стерилизован фильтром.
100 мМ ГТФFisher ScientificAC226250010ресуспендирован в 1& раз; BRB80 (pH 6,8) и фильтр стерилизованный.
Твердотельные лазеры мощностью 120-150 мВтLeica Microsystems11889151; 11889148
2 мг/мл каталазыSigma Aldrich Inc, Сент-Луис, MOC40-100В сочетании с глюкозооксидазой, аликвотой и хранением при -80 oC до использования
2&раз; Буфер TIRFДомашний2× BRB80, 100 мМ KCl, 20 мМ DTT, 80 мМ глюкозы, 0,5% (v/v) метилцеллюлозы (4 000 CP); Примечание: 1 & микро; L 0,1M GTP и 1µ L 0,1М АТФ добавляется отдельно в реакции TIRF, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания.
24 × 60 мм, #1.5 защитное стеклоFisher Scientific, Waltham, MA22-266882Защитное стекло необходимо тщательно промыть перед использованием (Smith et al. (2014)22)
37 oC heatblock
37 oC водяная баня
5 мг/мл стрептавидина (600x стоковый)Avantor, Филадельфия, ПенсильванияRLS000-01Ресуспендирован в Tris-HCl (pH 8,8); разбавить аликвоту в 1&раз; в буфере HEK в день использования
5 мин. Эпоксидная смола и отвердительLoctite, Rocky Hill, CT1365736Комбинированная смола и отвердитель могут занять до 30 минут для отверждения.
50% биотинилированные семена микротрубочек GpCppCytoskeleton Inc; Самодельныесемена микротрубочек T333P(опционально) GppCpp или Taxol могут более эффективно опосредуть полимеризацию микротрубочек. Таксол и GppCpp стабилизируют микротрубочки различными способами, что может влиять на структуру решетки микротрубочек и способность некоторых регуляторных белков связываться со стабилизированной частью микротрубочки. Метод получения различных видов семян микротрубочек описан в работе Hyman et al. (1992).
70 oC инкубатор
Actin mix stockHomemade; этот протоколA 12.5 &; Смесь М-актина, состоящая из меченого (флуоресцентного и биотинилированного) и немеченого актина для проведения до шести реакций. 2 & микро; Л материала используется в конечной реакции TIRF. Конечная концентрация актина, используемого в каждой реакции, составляет 0,5°; M (10% Alexa-647; 0,09% меченый биотином).
Надлежащий буферный контрольДомашняякомбинация буферов из всех оцениваемых белков
Biotin-PEG-silane (MW 3,400)Laysan Bio Incbiotin-PEG-SIL-3400Дозирован в аликвоты по 2-5 мг, заполнен азотом, парапленирован закрытым и хранится при -20 oC с влагопоглотителем до использования
Biotinylated actinCytoskeleton Inc; СамодельныйAB07производится путем мечения на остатках лизина и, таким образом, предполагается, что он мечен не менее чем на 100%, но варьируется в зависимости от различных партий/препаратов. Оптимальные концентрации биотинилированного актина должны быть определены эмпирически для конкретных применений/экспериментальных дизайнов. Более высокие концентрации обеспечивают более эффективное отслеживание, но могут препятствовать полимеризации или взаимодействию с регуляторными белками. При этом небольшой процент (0,09% или 900 пМ) биотинилированного актина присутствует в конечной реакции TIRF.
Мыло для посудыDawn, Procter and Gamble, Цинциннати, ОгайоПо неизвестным причинам синяя версия очищает покровные стекла более эффективно, чем другие доступные цвета.
сухого льда
FIJIwww.https://imagej.net/software/fiji/downloadsSchneider et al. (2012)31.
Флуоресцентно меченный актинCytoskeleton Inc; СамодельныйAR05Самодельный флуоресцентно меченный актин хранится в G-буфере с добавлением 50% глицерина при -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Флуоресцентно меченный актин диализуют против G-буфера и предварительно очищают ультрацентрифугированием в течение 60 мин при 278 000 раз; g перед использованием.
Флуоресцентно меченный тубулинCytoskeleton IncTL488M, TLA590M, TL670Mресуспендирован в 20 & микро; L 1× BRB80 (10 & микро; M в конечной концентрации) и предварительно очищаются с помощью ультрацентрифугирования (278 000 × g) в течение 60 мин перед использованием.
G-буфердомашний3 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 мМ CaCl2, 0,5 мМ DTT, 0,2 мМ ATP
HEK BufferДомашний20 мМ HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA (pH 8,0), 50 mM KCl
Ведро
льда
Камеры для визуализацииIBIDI, Fitchburg, WI80666Заказать камеры без дна для использования различных защитных покрытий
iXon Life 897 EMCCD cameraAndor, Белфаст, Северная Ирландия8114137
программное обеспечение для микроскопа LASX Premium LeicaMicrosystems11640611
метилцеллюлозу (4,000 cp)Sigma Aldrich IncM0512
База микроскопа с модулем TIRFLeica Microsystems, Вецлар, Германия
mPEG-силан (MW 2,000)Laysan Bio Inc, Arab, ALmPEG-SIL-2000Дозирован в аликвоты по 10-15 мг, залит азотом, парапленирован закрытым и хранится при температуре -20 oC с адсорбентом до использования
Нагреватель объектива и нагреваемая сценическая вставкаOKO labs, Поцциоли, Италия8113569Установите регуляторы температуры на 35-37 oC. Используйте рекомендации производителя для точной калибровки.
Перфузионный насосHarvard Apparatus, Holliston, MA704504Можно заменить шприц и трубку.
Чашка Петри, 100 x 15 ммGenesee Scientific, Сан-Диего, Калифорния32-107
Пластиковый скользящий почтовый контейнерFisher ScientificHS15986
SA-S-1L-SecureSeal толщиной 0,12 мм GraceBiolabs, Bend, OR620001Настоятельно рекомендуется использовать двустороннюю ленту точных производственных размеров.
Малый контейнер из пенополистиролаAbcam, Кембридж, ВеликобританияПовторно использован с судоходства
Маленькая весовая лодкаFisher Scientific02-202-100
Спектрофотометр
TauCytoskeleton IncTA01Три изоформы тау присутствуют в коммерчески доступном препарате тау. Концентрацию в этом протоколе определяли из самой высокой молекулярной массы (14,3 &; M, при ресуспензии в зависимости от производителя с 50 & микро; L из ddH20).
Температурная коррекция в 63 раза; План Апо 1.47 Н.А. масляная иммерсионная TIRF объективLeica Microsystems11506319
Тубулин стокСамодельный; этот протоколА тубулин сток состоящий из 7.2 & микро; Л переработанный 100 &микро; M немеченый тубулин и 3 & микро; L из 10 & микро; M ресуспендированный коммерчески доступный флуоресцентно меченный тубулин. Один запас тубулина используется на одну реакцию и размораживается/хранится на льду. Конечная концентрация свободного тубулина в каждой реакции составляет 15 °микро; М (4% маркировки). Более 15 & микро; М-тубулин приводит к гиперстабилизации (не динамическим) микротрубочкам, тогда как концентрации ниже 7,5 &; М свободный тубулин плохо полимеризуется. Требуется тщательное определение концентрации белка и обращение с ним.
Немеченый актин (темный)Cytoskeleton Inc; СамодельныеAKL99почти всегда присутствуют в коммерчески доступных (лиофилизированных) или замороженных актинах и способствуют вариабельности количественных измерений (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Актин мышц кролика хранится в G-буфере при -80 <суп>оС и предварительно очищается ультрацентрифугированием в течение 60 мин при 278 000 раз; g перед использованием.  В течение дня изготавливается несколько актиновых стоковых растворов (не более чем достаточно для шести реакций за один раз); настоятельно рекомендуется).
биотин-актин Программное обеспечение для для11889146 ядра актина

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pimm, M. L., Henty-Ridilla, J. L. New twists in actin-microtubule interactions. Molecular Biology of the Cell. 32 (3), 211-217 (2021).
  2. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  3. Etienne-Manneville, S. Actin and microtubules in cell motility: which one is in control. Traffic. 5 (7), 470-477 (2004).
  4. Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nature Cell Biology. 5 (7), 599-609 (2003).
  5. Prezel, E., et al. TIRF assays for real-time observation of microtubules and actin coassembly: Deciphering tau effects on microtubule/actin interplay. Methods in Cell Biology. 141, 199-214 (2017).
  6. Griffith, L. M., Pollard, T. D. The interaction of actin filaments with microtubules and microtubule-associated proteins. The Journal of Biological Chemistry. 257 (15), 9143-9151 (1982).
  7. Henty-Ridilla, J. L., Rankova, A., Eskin, J. A., Kenny, K., Goode, B. L. Accelerated actin filament polymerization from microtubule plus ends. Science. 352 (6288), 1004(2016).
  8. Elie, A., et al. Tau co-organizes dynamic microtubule and actin networks. Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).
  9. Preciado López, M., et al. Actin-microtubule coordination at growing microtubule ends. Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).
  10. Oberhofer, A., et al. Molecular underpinnings of cytoskeletal cross-talk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 3944-3952 (2020).
  11. Nakos, K., et al. Septins mediate a microtubule-actin crosstalk that enables actin growth on microtubules. bioRxiv. , (2022).
  12. Kučera, O., Gaillard, J., Guérin, C., Théry, M., Blanchoin, L. Actin-microtubule dynamic composite forms responsive active matter with memory. bioRxiv. , (2022).
  13. Kundu, T., Dutta, P., Nagar, D., Maiti, S., Ghose, A. Coupling of dynamic microtubules to F-actin by Fmn2 regulates chemotaxis of neuronal growth cones. Journal of Cell Science. 134 (13), 252916(2021).
  14. Roth-Johnson, E. A., Vizcarra, C. L., Bois, J. S., Quinlan, M. E. Interaction between microtubules and the Drosophila formin Cappuccino and its effect on actin assembly. The Journal of Biological Chemistry. 289 (7), 4395-4404 (2014).
  15. Gaillard, J., et al. Differential interactions of the formins INF2, mDia1, and mDia2 with microtubules. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4575-4587 (2011).
  16. Bartolini, F., et al. The formin mDia2 stabilizes microtubules independently of its actin nucleation activity. The Journal of Cell Biology. 181 (3), 523-536 (2008).
  17. Sider, J. R., et al. Direct observation of microtubule-F-actin interaction in cell free lysates. Journal of Cell Science. 112 (12), 1947-1956 (1999).
  18. Alkemade, C., et al. Cross-linkers at growing microtubule ends generate forces that drive actin transport. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (11), 2112799119(2022).
  19. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Methods in Enzymology. 361, 1-33 (2003).
  20. Amann, K. J., Pollard, T. D. Direct real-time observation of actin filament branching mediated by Arp2/3 complex using total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15009-15013 (2001).
  21. Al-Bassam, J. Reconstituting dynamic microtubule polymerization regulation by TOG domain proteins. Methods in Enzymology. 540, 131-148 (2014).
  22. Smith, B. A., Gelles, J., Goode, B. L. Single-molecule studies of actin assembly and disassembly factors. Methods in Enzymology. 540, 95-117 (2014).
  23. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).
  24. Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less - bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), (2019).
  25. Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules. Journal of Visualized Experiments. (150), e59520(2019).
  26. King, M. R., Petry, S. Phase separation of TPX2 enhances and spatially coordinates microtubule nucleation. Nature Communications. 11 (1), 270(2020).
  27. Ramirez-Rios, S., et al. A TIRF microscopy assay to decode how tau regulates EB's tracking at microtubule ends. Methods in Cell Biology. 141, 179-197 (2017).
  28. Smith, B. A., et al. Three-color single molecule imaging shows WASP detachment from Arp2/3 complex triggers actin filament branch formation. eLife. 2, 01008(2013).
  29. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
  30. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Pollard, T. D., Blanchoin, L., Mullins, R. D. Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 545-576 (2000).
  33. Kapoor, V., Hirst, W. G., Hentschel, C., Preibisch, S., Reber, S. MTrack: Automated detection, tracking, and analysis of dynamic microtubules. Scientific Reports. 9 (1), 3794(2019).
  34. Willige, D., et al. Cytolinker Gas2L1 regulates axon morphology through microtubule-modulated actin stabilization. EMBO reports. 20 (11), (2019).
  35. Hirst, W. G., Kiefer, C., Abdosamadi, M. K., Schäffer, E., Reber, S. In vitro reconstitution and imaging of microtubule dynamics by fluorescence and label-free microscopy. STAR Protocols. 1 (3), 100177(2020).
  36. Farina, F., et al. The centrosome is an actin-organizing centre. Nature Cell Biology. 18 (1), 65-75 (2016).
  37. Mishra, M., et al. In vitro contraction of cytokinetic ring depends on myosin II but not on actin dynamics. Nature Cell Biology. 15 (7), 853-859 (2013).
  38. Groen, A. C., Ngyuen, P. A., Field, C. M., Ishihara, K., Mitchison, T. J. Glycogen-supplemented mitotic cytosol for analyzing Xenopus egg microtubule organization. Methods in Enzymology. 540, 417-433 (2014).
  39. Pollard, L. W., Garabedian, M. V., Alioto, S. L., Shekhar, S., Goode, B. L. Genetically inspired in vitro reconstitution of Saccharomyces cerevisiae actin cables from seven purified proteins. Molecular Biology of the Cell. 31 (5), 335-347 (2020).
  40. Bergman, Z. J., Wong, J., Drubin, D. G., Barnes, G. Microtubule dynamics regulation reconstituted in budding yeast lysates. Journal of Cell Science. 132 (4), 219386(2018).
  41. Inoue, D., et al. Actin filaments regulate microtubule growth at the centrosome. The EMBO Journal. 38 (11), (2019).
  42. Colin, A., Singaravelu, P., Théry, M., Blanchoin, L., Gueroui, Z. Actin-network architecture regulates microtubule dynamics. Current Biology. 28 (16), 2647-2656 (2018).
  43. Torvi, J. R., et al. Reconstitution of kinetochore and microtubule dynamics reveals a role for a kinesin-8 in establishing end-on attachments. bioRxiv. , (2022).
  44. Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
  45. Abu Shah, E., Keren, K. Symmetry breaking in reconstituted actin cortices. eLife. 3, 01433(2014).
  46. Vendel, K. J. A., Alkemade, C., Andrea, N., Koenderink, G. H., Dogterom, M. In vitro reconstitution of dynamic co-organization of microtubules and actin filaments in emulsion droplets. Cytoskeleton Dynamics. 2101, 53-75 (2020).
  47. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  48. Liu, X., Pimm, M. L., Haarer, B., Brawner, A. T., Henty-Ridilla, J. L. Biochemical characterization of actin assembly mechanisms with ALS-associated profilin variants. European Journal of Cell Biology. 101 (2), 151212(2022).
  49. Pimm, M. L., Liu, X., Tuli, F., Lojko, A., Henty-Ridilla, J. L. Visualizing functional human profilin in cells and in vitro applications. bioRxiv. , (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Actin Microtubule DynamicsTIRF MicroscopyCytoskeletal CrosstalkIn Vitro ReconstitutionActin Filament PolymerizationMicrotubule AssemblyCytoskeletal Regulatory ProteinsTau ProteinPerfusion ChamberKymograph Analysis

Related Articles