Бесклеточное восстановление было ключевым инструментом для понимания сборки цитоскелетов, и работа в последнее десятилетие установила подходы к изучению динамики септина в минимальных системах. Здесь представлены три взаимодополняющих метода наблюдения сборки септина в различных мембранных контекстах: плоские бислои, сферические опоры и стержневые опоры.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Восстановление сборки септина на мембранах для изучения биофизических свойств и функций
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Большинство клеток могут чувствовать и изменять свою форму для выполнения фундаментальных клеточных процессов. У многих эукариот цитоскелет септина является неотъемлемым компонентом в координации изменений формы, таких как цитокинез, поляризованный рост и миграция. Септины представляют собой нитеобразующие белки, которые собираются для формирования разнообразных структур более высокого порядка и, во многих случаях, обнаруживаются в разных областях плазматической мембраны, особенно в областях положительной кривизны микронного масштаба. Мониторинг процесса сборки септина in vivo затруднен ограничениями световой микроскопии в клетках, а также сложностью взаимодействий как с мембранами, так и с цитоскелетными элементами, что затрудняет количественную оценку динамики септина в живых системах. К счастью, за последнее десятилетие был достигнут значительный прогресс в воссоздании цитоскелета септина в бесклеточной системе для анализа механизмов, контролирующих сборку септина с высоким пространственным и временным разрешением. Основные этапы сборки септина включают ассоциацию гетероолигомера септина и диссоциацию с мембраной, полимеризацию в нити и образование структур более высокого порядка посредством взаимодействий между нитями. Здесь мы представляем три метода наблюдения сборки септина в разных контекстах: плоские бислои, сферические опоры и стержневые опоры. Эти методы могут быть использованы для определения биофизических параметров септинов на разных стадиях сборки: как одиночных октамеров, связывающих мембрану, как нитей, так и в виде сборок нитей. Мы используем эти параметры в сочетании с измерениями выборки кривизны и предпочтительной адсорбции, чтобы понять, как измерение кривизны работает в различных масштабах длины и времени.
Введение
Формы клеток и многие из их внутренних компартментов зависят от липидных мембран, которые их окружают. Мембраны представляют собой вязкоупругие структуры, которые могут деформироваться посредством взаимодействия с белками, сортировки липидов и действующих внутренних и внешних сил для создания различных форм 1,2,3,4. Эти формы часто описываются в терминах кривизны мембраны. Клетки используют разнообразный набор белков, способных предпочтительно собираться или «ощущать» определенные кривизны мембраны для обеспечения определенного пространствен....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Формирование поддерживаемых липидных бислоев требует подготовки монодисперсных небольших одноламеллярных пузырьков (SUV). Пожалуйста, обратитесь к ранее опубликованномупротоколу 24 о формировании внедорожников. Короче говоря, все внедорожники формируются зондовой обработкой ультразвуком в течение 12 мин в общей сложности с амплитудой 70% через 4-минутные периоды обработки ультразвуком с последующими 2-минутными периодами отдыха в ледяной воде. Растворы внедорожников должны быть хорошо осветлены и монодисперсированы по размеру. Распределение по размерам внедорожников может быть измерено, например, динамическим рассеянием света
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После получения каждого SLB септины или интересующий белок могут быть инкубированы с желаемой поддержкой и визуализированы с помощью TIRFM, конфокальной микроскопии или SEM. Результаты, показанные здесь, используют септины, рекомбинантно экспрессированные и очищенные от E. coli17. С помощью TIRFM на плоских SLP можно определить длину нитей накала и их гибкость, измерить коэффициенты диффузии и наблюдать сборку с течением времени28,29
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Клеточные мембраны приобретают множество различных форм, кривизн и физико-химических свойств. Для изучения нанометрового механизма, с помощью которого клетки строят микрометровые сборки, необходимо спроектировать минимальные системы восстановления мембранной миметики. Этот протокол представляет методы, которые точно контролируют как кривизну мембраны, так и состав, позволяя пользователю легко проводить количественные измерения флуоресценции с использованием широко доступных методов микроскопии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана Грантом Национального института здравоохранения (NIH) No. R01 GM-130934 и грант Национального научного фонда (NSF) MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V. и K.S.C. были частично поддержаны грантом Национального института общих медицинских наук в рамках премии T32 GM119999.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,2 мл ПЦР-пробирки с плоским колпачком, Natural | Watson | 137-211C(EX) | |
| 0,5 мл пробирки с низкой адгезией | США Scientific | 1405-2600 | |
| Бета-меркаптоэтанол (BME) | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| Бычья сыворотка альбумин (БСА) | Sigma-Aldrich | A4612-25G | |
| Покровное стекло для изготовления ПЭГилированные покровные стекла | Thermo Scientific | 152450 | Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| яйцо Liss Rhodamine PE | Avanti Polar Lipids | 810146 | |
| EMS Глутаральдегид водный 25%, EM Grade | VWR | 16220 | |
| EMS Sodium Cacodylate Buffer | VWR | 11652 | |
| Этанол, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-223EA | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-1KG | |
| Гексаметилдисилазан | Sigma-Aldrich | 440191 | |
| Хлорид магния | VWR | 7791-18-6 | |
| Метилцеллюлоза 4000cp | Sigma-Aldrich | M052-100G | |
| Микростекло покровные стекла для планарных бислоев | Matsunami | Снята с производства | |
| Мини-центрифуга | |||
| Нефункционализированные микросферы диоксида кремния | Bangs Laboratories, Inc. | Зависит от размера: SS0200*-SS0500* | Диоксид кремния в водной суспензии |
| Оптический клей | Norland Thorlabs | NOA 68 | Гибкий клей для стекла или пластика |
| Тетраоксид осмия | Миллипоры Sigma | 20816-12-0 | |
| Парапленка | VWR | 52858-000 | |
| Очиститель плазмы | Плазменное травление | PE-25 | Напряжение: 120В, 60 Гц. Ток: 15 ампер |
| Хлористый калий | VWR | 0395-1кг | |
| Круглое покровное стекло, #1.5 12мм | VWR | 64-0712 | |
| Ультразвуковая ванна | Branson | 1510R-MT | Ультразвуковой очиститель Bransonic. 50-60 Гц. Выход: 70 Вт |
| Соя PI | Avanti Полярные липиды | 840044 | |
| настольной центрифугой | Eppendorf | 22331 | |
| УФ-лампа | Spectroline | ENF-260C | 115 Вольт, 60 Гц, 0,20 ампера |
| ВатманСтекло Микрофибра Фильтровальная бумага | VWR | 28455-030 | диаметр 42,5 мм, марка GF/C |
Ссылки
- Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
- Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
