Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Восстановление сборки септина на мембранах для изучения биофизических свойств и функций

2.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64090

⸱

28 июля 2022 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Бесклеточное восстановление было ключевым инструментом для понимания сборки цитоскелетов, и работа в последнее десятилетие установила подходы к изучению динамики септина в минимальных системах. Здесь представлены три взаимодополняющих метода наблюдения сборки септина в различных мембранных контекстах: плоские бислои, сферические опоры и стержневые опоры.

Аннотация

Большинство клеток могут чувствовать и изменять свою форму для выполнения фундаментальных клеточных процессов. У многих эукариот цитоскелет септина является неотъемлемым компонентом в координации изменений формы, таких как цитокинез, поляризованный рост и миграция. Септины представляют собой нитеобразующие белки, которые собираются для формирования разнообразных структур более высокого порядка и, во многих случаях, обнаруживаются в разных областях плазматической мембраны, особенно в областях положительной кривизны микронного масштаба. Мониторинг процесса сборки септина in vivo затруднен ограничениями световой микроскопии в клетках, а также сложностью взаимодействий как с мембранами, так и с цитоскелетными элементами, что затрудняет количественную оценку динамики септина в живых системах. К счастью, за последнее десятилетие был достигнут значительный прогресс в воссоздании цитоскелета септина в бесклеточной системе для анализа механизмов, контролирующих сборку септина с высоким пространственным и временным разрешением. Основные этапы сборки септина включают ассоциацию гетероолигомера септина и диссоциацию с мембраной, полимеризацию в нити и образование структур более высокого порядка посредством взаимодействий между нитями. Здесь мы представляем три метода наблюдения сборки септина в разных контекстах: плоские бислои, сферические опоры и стержневые опоры. Эти методы могут быть использованы для определения биофизических параметров септинов на разных стадиях сборки: как одиночных октамеров, связывающих мембрану, как нитей, так и в виде сборок нитей. Мы используем эти параметры в сочетании с измерениями выборки кривизны и предпочтительной адсорбции, чтобы понять, как измерение кривизны работает в различных масштабах длины и времени.

Введение

Формы клеток и многие из их внутренних компартментов зависят от липидных мембран, которые их окружают. Мембраны представляют собой вязкоупругие структуры, которые могут деформироваться посредством взаимодействия с белками, сортировки липидов и действующих внутренних и внешних сил для создания различных форм 1,2,3,4. Эти формы часто описываются в терминах кривизны мембраны. Клетки используют разнообразный набор белков, способных предпочтительно собираться или «ощущать» определенные кривизны мембраны для обеспечения определенного пространственно-временного контроля над процессами, включая клеточный трафик, цитокинез и миграцию 5,6. Динамику клеточного механизма на мембране особенно трудно наблюдать из-за сложности балансировки времени и пространственного разрешения со здоровьем клеток. Хотя методы сверхвысокого разрешения могут предложить подробное представление о таких структурах, они требуют длительных приобретений, которые не поддаются временным рамкам сборки / разборки для большинства машин. Кроме того, молекулярная сложность этих сборок в их родной среде и множество ролей, которые может играть один компонент, делают системы минимального восстановления ценным инструментом для изучения функциональной емкости молекул.

Минимальные мембранные миметики были разработаны для изучения свойств мембраны и белково-мембранных взаимодействий вне клетки. Мембранные миметики варьируются от отдельно стоящих липидных бислоев, таких как липосомы или гигантские одноцветные везикулы, до поддерживаемых липидных бислоев (SLB)7,8,9,10. SLB представляют собой биомиметические мембраны, прикрепленные к нижележащей опоре, обычно состоящие из стекла, слюды или кремнезема11,12. Различные геометрии могут быть использованы, включая плоские поверхности, сферы, стержни и даже волнообразные или микроструктурированные субстраты для зондирования белково-мембранных взаимодействий как на вогнутых, так и на выпуклых кривизнях одновременно1 3,14,15,16,17,18 . Образование бислоя начинается с адсорбции пузырьков на гидрофильной поверхности, за которой следует слияние и разрыв с образованием непрерывного бислоя (рисунок 1)19. Поддерживаемые бислои особенно поддаются световой и электронной микроскопии, обеспечивая как лучшее время, так и пространственное разрешение, чем это часто достигается в клетках. Изогнутые SLB особенно обеспечивают привлекательное средство для зондирования чувствительности к кривизне белка при отсутствии значительной деформации мембраны, позволяя различать зондирование кривизны и индукцию кривизны, которые часто невозможно разделить в отдельно стоящих системах.

Септины представляют собой класс нитеобразующих цитоскелетных белков, хорошо известных своей способностью собираться на положительно изогнутых мембранах 6,18,20. В течение клеточного цикла в дрожжах септины собираются в кольцо и должны перестраиваться, образуя песочные часы и двойные кольцевые структуры, связанные с появлением почек и цитокинезом, соответственно21. В то время как красивая работа была выполнена с использованием электронной микроскопии платиновой реплики для наблюдения архитектуры септина на различных стадиях клеточного цикла22, наблюдение за сборкой септина с течением времени с использованием световой микроскопии в дрожжах столкнулось с ограниченным пространственным разрешением. Предыдущая работа над септинами с использованием липидных монослоев, визуализированных с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ), смогла воссоздать несколько интересных структур септина, таких как кольца, пучки и марля23. Однако методы ЭМ также ограничены по своему временному разрешению, в отличие от флуоресцентной микроскопии. Чтобы лучше разрешить кинетические параметры многомасштабного процесса сборки септина, мы обратились к поддерживаемой мембранной миметике, где можно тщательно контролировать геометрию мембраны, условия образца и модальность визуализации.

Протоколы, описанные здесь, используют плоские или изогнутые SLB, очищенный белок и комбинацию методов микроскопии. Количественная флуоресцентная конфокальная микроскопия и флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (TIRFM) использовались для измерения как объемного связывания белка на различных кривизнах мембраны, так и для измерения кинетики связывания отдельных молекул. Кроме того, этот протокол был адаптирован для использования со сканирующей электронной микроскопией (SEM) для изучения ультраструктуры белка на различных кривизнах мембраны. В то время как основное внимание в этих протоколах уделяется септиновому цитоскелету, протоколы могут быть легко изменены для исследования чувствительности к кривизне любого белка, который читатель находит интересным. Кроме того, те, кто работает в таких областях, как эндоцитоз или везикулярный трафик, могут найти эти методы полезными для зондирования зависимых от кривизны сборок мультибелковых комплексов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Формирование поддерживаемых липидных бислоев требует подготовки монодисперсных небольших одноламеллярных пузырьков (SUV). Пожалуйста, обратитесь к ранее опубликованномупротоколу 24 о формировании внедорожников. Короче говоря, все внедорожники формируются зондовой обработкой ультразвуком в течение 12 мин в общей сложности с амплитудой 70% через 4-минутные периоды обработки ультразвуком с последующими 2-минутными периодами отдыха в ледяной воде. Растворы внедорожников должны быть хорошо осветлены и монодисперсированы по размеру. Распределение по размерам внедорожников может быть измерено, например, динамическим рассеянием света25.

1. Плоские липидные бислои

  1. Плазменная очистка слайдов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плазменная очистка удаляет органические загрязнения и повышает гидрофильность стекла, обеспечивая эффективную адсорбцию липидов. Следующие шаги могут измениться или должны быть оптимизированы в зависимости от используемого плазменного очистителя и стеклянных крышек.
    1. Продувите плазмоочиститель на 5 мин кислородом, чтобы удалить воздух из линий и камеры. Это делается для обеспечения того, чтобы при работе плазменного очистителя в линиях и камере в основном находился кислород, обеспечивая более последовательные двухслойные препараты.
    2. Во время продувки пропустите инертный газ, такой как N2 или Ar, на стекла микрокрытой крышки, чтобы удалить пыль и твердые частицы.
      ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Стеклянные горки можно мыть, опрыскивая каждую сторону 100% изопропанолом с последующей водой. Повторите промывку изопропанол-водой 3 раза, а затем высушите струейN2 .
    3. Уложите стеклянные горки с сухим покрытием в керамическую колыбель. Поместите люльку в заднюю часть плазменной камеры так, чтобы крышки были параллельны длинному краю камеры (это удерживает их на месте во время плазменной очистки). Запустите плазмоочиститель в течение 15 минут с кислородом на максимальной мощности.
  2. Подготовка камеры
    ПРИМЕЧАНИЕ: Способ, описанный здесь, использует самодельные камеры из пластиковых ПЦР-трубок для поддержки реакционных объемов, но другие материалы с низкой адгезией, такие как силиконовые колодцы, также могут быть подходящими.
    1. С помощью лезвия бритвы или ножниц отрежьте колпачок чуть ниже матовой части трубки ПЦР объемом 0,2 мл (рисунок 2).
    2. Покрасьте ободок трубки ПЦР УФ-активированным клеем, избегая внутренней части трубки. Аккуратно поместите приклеенную трубку ПЦР в центр очищенной плазмой крышки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать клея внутри камеры, используйте минимальное количество клея, чтобы получить уплотнение, и своевременно обрабатывайте ультрафиолетовым излучением, не натыкаясь и не нарушая камеру.
    3. Поместите камеру под длинноволновый ультрафиолетовый свет на 5-7 мин, чтобы вылечить клей.
  3. Двухслойное формирование
    ПРИМЕЧАНИЕ: Монодисперсные внедорожники должны использоваться на этом этапе для эффективного двухслойного формирования. В таблице 1 приведены рецептуры для всех буферов, используемых в двухслойной формации, включая запасы и конечные буферные концентрации.
    1. Добавить 40 мкл поддерживаемого липидного двухслойного буфера (SLBB: 300 мМ KCl, 20 мМ HEPES, рН 7,4, 1 мМMgCl2; Таблица 1), 10 мкл внедорожников 5 мМ и 1 мкл 100 мМ CaCl2 в скважину. Осторожно встряхните камеры из стороны в сторону, чтобы нарушить работу внедорожников, а затем высиживайте при 37 °C в течение 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы ограничить испарение, инкубируйте в покрытой чашке Петри влажной салфеткой.
  4. Вымывание избытка липидов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг удаляет лишние внедорожники и действует как шаг буферного обмена. Очень важно не соскребать бислой наконечником пипетки во время стирки; если стекло подвергается воздействию, септины и многие другие белки будут связываться необратимо, снижая эффективную концентрацию белка.
    1. После инкубации промойте бислой 6x 150 мкл SLBB, пипетируя вверх и вниз, чтобы каждый раз смешивать, избегая пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 150 мкл непосредственно к 50 мкл буфера и внедорожников, уже присутствующих в общей сложности 200 мкл в реакционной скважине.
    2. Когда будете готовы начать инкубацию с септинами или другим белком по выбору, промыть бислой 6x 150 мкл реакционного буфера (RXN: 33,3 мМ KCl, 50 мМ HEPES, рН 7,4, 1,4 мг/мл BSA, 0,14% метилцеллюлозы, 1 мМ BME).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов сделайте реакционный буфер свежим и будьте очень осторожны при смешивании в реакционном колодце, чтобы избежать пузырьков.
    3. На последней стадии промывки удалите 125 мкл реакционного буфера, оставив 75 мкл в лунке. Добавьте 25 мкл септинов, разбавленных в буфере хранения септина (SSB: 300 мМ KCl, 50 мМ HEPES, pH 7,4, 1 мМ BME) при желаемой концентрации и изображении с помощью микроскопии TIRF26.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При настройке этого анализа в первый раз или включении новой липидной композиции рекомендуется обеспечить свободное диффузию липидов на поверхности с использованием флуоресцентного восстановления после фотоотбеливания (FRAP). Хотя скорость восстановления будет различной для разных липидных композиций и по своей сути ниже, чем для отдельно стоящих систем, липиды не должны быть неподвижными.

Поддерживаемый липидный двухслойный буфер (SLBB)
ЗапасТомКонечная концентрация
2 млн кКл1,5 мл300 мМ
1 М HEPES200 мкл20 мМ
500 мМ MgCl2 20 мкл1 мМ
Вода8 мл
Предреакционный буфер (PRB)
ЗапасТомКонечная концентрация
2 млн кКл166 мкл33,3 мМ
1 М HEPES500 мкл50 мМ
Вода9.33 мл
Реакционный буфер
ЗапасТомКонечная концентрация
2 млн кКл166 мкл33,3 мМ
1 М HEPES300 мкл50 мМ
10 мг/мл BSA1.39 мл1,39 мг/мл
1% метилцеллюлоза1.39 мл0.0014
ВодаДо 10 мл
БМЭ0.7 мкл1 мМ
Буфер хранения септина (SSB)
ЗапасТомКонечная концентрация
2 млн кКл1,5 мл300 мМ
1 М HEPES500 мкл50 мМ
ВодаДо 10 мл
БМЭ0.7 мкл1 мМ

Таблица 1: Буферные компоненты для получения поддерживаемого липидного бислоя и реакций. Показаны объемы стоковых растворов, которые включены в буферы, и конечные концентрации каждого компонента. SLB и PRB могут храниться при комнатной температуре и повторно использоваться между экспериментами. Реакционный буфер и SSB становятся свежими для каждого эксперимента.

2. Сферические поддерживаемые липидные бислои

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются микросферы кремнезема, взвешенные в сверхчистой воде при плотности 10%. Для любой работы над кинетическими параметрами сборки белка важно строго контролировать общую площадь поверхности мембраны между экспериментами и кривизнами. В таблице 2 показаны скорректированные объемы шариков и буфера для поддержания 5мм2 общей площади поверхности мембраны. Этот протокол расширяет ранее опубликованный метод 8,18.

  1. Двухслойное формирование
    ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается планарных бислоев, важно иметь высококачественные внедорожники для прочного двухслойного формирования. В таблице 2 перечислены объем бусин из раствора с плотностью 10% и их соответствующие объемы SLBB, которые используются для получения конечной площади поверхности 5мм2 для диапазона диаметров шариков.
    1. Микросферы кремнезема (также называемые бусинами), как правило, оседают и сливаются вместе; чтобы смешать бусины и разбить любые грозди, вихрьте бутылку в течение 15 с, затем втирайте в ванну в течение 1 мин и снова вихрь в течение 15 с.
    2. Смешайте соответствующий объем шариков (таблица 2) с соответствующим объемом SLBB и 10 мкл внедорожников 5 мМ в микроцентрифужной трубке с низкой адгезией объемом 0,5 мл.
    3. Размахните шариково-липидную смесь концом-концом в течение 1 ч при комнатной температуре. Убедитесь, что эта инкубация выполняется на ротаторе, чтобы предотвратить осаждение.
  2. Подготовка камер на полиэтиленовых крышках
    ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается плоских бислоев, самодельные камеры из пластиковых ПЦР-трубок используются для поддержки реакционных объемов, но другие материалы с низкой адгезией, такие как силиконовые колодцы, могут работать так же хорошо.
    1. Пока бусины качаются, разморозьте полиэтиленовый покров при комнатной температуре. Вырежьте ПЦР-трубку объемом 0,2 мл и приклейте ее к крышке, как описано на этапе 1.2. Для слайдов размером 24 мм x 50 мм на одном слайде может поместиться до 10 камер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются стеклянные крышки диаметром 24 мм x 50 мм PEGylated, которые готовятся заранее. Вкратце, стеклянные крышки тщательно очищаются с помощью ультразвука в ацетоне, метаноле и 3 М КОН. Затем покровные листы функционализируют n-2-аминоэтил-3-аминопропилтриметоксисиланом и ковалентно связывают с mPEG сукцинимидилалератом. Готовые полиэтиленовые крышки хранятся в вакуумном уплотнении при −80 °C. Аналогичный протокол пассивации см. в работе Gidi et al.27. В то время как здесь предлагаются полиэтиленовые стеклянные крышки, другие средства пассивации, такие как методы BSA или поли-L-лизина, могут быть эффективными.
  3. Вымывание избытка липидов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг функционирует для удаления лишних внедорожников и выполнения буферного обмена. Шарики промывают в общей сложности 4 раза с предреакционным буфером (PRB: 33,3 мМ KCl, 50 мМ HEPES, pH 7,4). В таблице 3 перечислены скорости отжима в RCF для диапазона диаметров шариков.
    1. Отжимают бусины по обозначенному RCF в течение 30 с (таблица 3). Если вы используете бусины нескольких размеров, держите бусины качающимися, пока их не придет время мыть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не стоит откладывать более крупные бусины в том же спине, что и более мелкие бусины с меньшей скоростью осаждения бусин, чтобы сэкономить время. Это может привести к тому, что бусины будут прилипать друг к другу и поставить под угрозу целостность бислоя.
    2. После первого спина удалите 50 мкл надосадочного вещества и добавьте 200 мкл PRB. После второго и третьего вращений удалите 200 мкл и добавьте 200 мкл PRB. После четвертого спина удалите 200 мкл и добавьте 220 мкл PRB. Пипетка энергично для каждой стирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем повторного суспендирования отличается от объема стирки. Не вращайте бусины после инкубации с липидами, так как это может оставить пробелы в бислоях. Чтобы избежать осаждения при работе с другими размерами бусин или настройке других частей анализа, поместите шариковые смеси обратно на торцевой ротатор.
  4. Подготовка реакции
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта реакция предназначена для сохранения общей площади поверхности мембраны реакции на уровне 5мм2 и получения конечного состояния реакции 100 мМ KCl, 50 мМ HEPES, 1 мг/мл BSA, 0,1% метилцеллюлозы и 1 мМ BME.
    1. Если вы проводите конкурсный анализ с несколькими размерами бусин, сделайте смесь 1: 1, смешивая равные объемы каждого размера бусины вместе. Затем смешайте 29 мкл желаемой бисерной смеси (или одного шарика) с 721 мкл буфера RXN.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно тщательно смешивать бусины на каждом этапе с пипеткой, чтобы избежать плотных скоплений бусин; это приведет к более равномерному распределению бусин и точной общей площади поверхности.
    2. Смешайте с лунками 75 мкл разбавленных шариков и 25 мкл белка, разведенного в SSB.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Авторы обычно изображают дрожжевые септиновые комплексы при 1-50 нМ.
    3. При измерении септинов в установившемся состоянии инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем снимают с помощью почти TIRF или конфокальной микроскопии.
Диаметр бусины (мкм)Объем хорошо смешанных бусин (мкл)Объем буфера SLB (мкл)Объем внедорожников (мкл)
6.468.9461.110
5.0676310
3.174.3965.610
0.961.3368.710
0.540.7569.310
0.310.4369.610

Таблица 2: Нормализованные объемы микросфер. Чтобы сохранить одинаковую площадь поверхности каждого размера бусины и сохранить общую площадь поверхности мембраны согласованной между экспериментами, были рассчитаны объемы для каждого размера шарика и буфера, которые нормализовали общую площадь поверхности.

Диаметр бусины (мкм)Скорость осаждения (RCF)
0.314.5
0.544.5
0.962.3
3.170.8
5.060.3

Таблица 3: Скорости осаждения для микросфер различного диаметра. Для каждого диаметра шарика показанные минимальные скорости осаждения использовались для гранулирования шариков для смывания несвязанных липосом.

3. Стержневые липидные бислои

ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от других анализов, представленных здесь, стержневой анализ не позволяет тщательно контролировать общую площадь поверхности мембраны. Можно быть последовательным в количествах и объемах между экспериментами, но поскольку это приводит к стержням разной длины и диаметра, трудно экстраполировать общую площадь поверхности мембраны в реакции. Таким образом, хотя это отличный анализ для изучения зондирования кривизны с несколькими кривизнами на одной поверхности и был полезен для изучения ультраструктуры септина, он не рекомендуется для кинетических измерений. Этот метод был ранее сообщен18 и расширяется здесь.

  1. Получение боросиликатных стержней из стеклянных фильтров из микрофибры
    1. Разорвите один стеклянный фильтр из микрофибры марки GF/C толщиной 42,5 мм на мелкие кусочки и поместите их в стакан объемом 100 мл с 60 мл 100% этанола. Ванна-ультразвук до тех пор, пока раствор не станет непрозрачным; это может занять всего 20-30 минут с мелко измельченным фильтром.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно соник, чтобы разбить большие куски; чем больше диссоциированности/непрозрачности, тем лучше.
    2. Накройте раствор пленкой и храните раствор при комнатной температуре в течение ночи.
  2. Формирование бислоев на стержнях
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется с избытком липидов для достижения полного покрытия стержня, поскольку в этом методе невозможно количественно оценить общую площадь поверхности.
    1. На следующий день раствор этанола будет оседать (этап 3.1.2.), поэтому хорошо перемешайте его перед использованием. Смешайте 10 мкл стержневого раствора и 70 мкл SLBB.
    2. Вращайтесь с максимальной скоростью в мини-центрифуге в течение 30 с и удаляйте 50 мкл супернатанта. Повторно суспендировать еще в 50 мкл SLBB и повторить отжим в общей сложности четыре промывки, чтобы разбавить этанол.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стержневые опоры не образуют твердой гранулы в нижней части трубки. Вместо этого их размазывают по бокам трубки; это затрудняет их полное сохранение при стирке. Поскольку общая площадь поверхности в этом анализе не контролируется, хорошо, если они нарушены.
    3. Смешайте 10 мкл хорошо смешанного стержневого раствора с 50 мкл внедорожников 5 мМ и 20 мкл SLBB. Инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре, вращая концом-концом как при образовании бислоев на микросферах.
  3. Вымывание избытка липидов
    1. Аналогично этапу 3.2.2, вращайте раствор липидного стержня на максимальной скорости в мини-центрифуге в течение 30 с для гранулирования стержней с мембранным покрытием из раствора.
    2. После первого спина удалите 50 мкл супернатанта и добавьте 200 мкл PRB. После второго и третьего вращений удалите 200 мкл и добавьте 200 мкл PRB. После четвертого спина удалите 200 мкл, добавьте 220 мкл PRB и энергично перемешайте пипетку.
  4. Подготовка реакции
    1. В микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл смешайте 721 мкл реакционного буфера с 29 мкл раствора стержня. Хорошо перемешать.
    2. В ПЦР-пробирке 0,2 мл соедините 75 мкл стержней в реакционном буфере и 25 мкл септинов в нужной концентрации, разведенной в SSB. Дайте ему инкубироваться при комнатной температуре не менее 1 ч.
  5. Подготовка к сканирующей электронной микроскопии
    1. После инкубации добавьте 100-мкл септин-стержневую смесь на круглый 12-миллиметровый покров с ПЭГ-покрытием и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч в закрытой чашке Петри.
    2. Зафиксируйте образец, заполнив дно чашки Петри (должно быть достаточно 10 мл) 2,5% глутаральдегида в 0,05 М какодилата натрия (NaCo), рН 7,4, в течение 30 мин. Аспирируйте жидкость стеклянной пипеткой. Промыть образец, инкубируя его с 10 мл 0,05 М NaCo в течение 5 мин и повторить в общей сложности две промывки.
    3. Постфиксировать в 0,5% osO4 какодилатный буфер в течение 30 мин, а затем промыть 3 раза в 0,05 М NaCo (5 мин/промывка).
    4. Инкубировать образец с 1% дубильной кислотой в течение 15 мин, а затем промыть в NaCo 3x. Инкубировать в течение 15 мин в 0,5% OsO4 и промыть 3 раза NaCo.
    5. Обезвоживать образцы с помощью повышения концентрации этанола: 30% EtOH в течение 5 мин, 2х; 50% EtOH в течение 5 мин; 75% EtOH в течение 5 мин; и 100% EtOH в течение 5 мин, 2x. Затем следует еще 10-минутная инкубация.
    6. Инкубировать в переходной жидкости (гексаметилдисилазан) 3x (5 мин, 10 мин, затем 5 мин).
    7. Дайте высохнуть на воздухе, затем поместите образцы в осушитель до распыления покрытия. Напыляйте слой 4 нм сплавом золота/палладия, а затем наносите изображение на сканирующий электронный микроскоп.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После получения каждого SLB септины или интересующий белок могут быть инкубированы с желаемой поддержкой и визуализированы с помощью TIRFM, конфокальной микроскопии или SEM. Результаты, показанные здесь, используют септины, рекомбинантно экспрессированные и очищенные от E. coli17. С помощью TIRFM на плоских SLP можно определить длину нитей накала и их гибкость, измерить коэффициенты диффузии и наблюдать сборку с течением времени28,29

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Клеточные мембраны приобретают множество различных форм, кривизн и физико-химических свойств. Для изучения нанометрового механизма, с помощью которого клетки строят микрометровые сборки, необходимо спроектировать минимальные системы восстановления мембранной миметики. Этот протокол представляет методы, которые точно контролируют как кривизну мембраны, так и состав, позволяя пользователю легко проводить количественные измерения флуоресценции с использованием широко доступных методов микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Грантом Национального института здравоохранения (NIH) No. R01 GM-130934 и грант Национального научного фонда (NSF) MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V. и K.S.C. были частично поддержаны грантом Национального института общих медицинских наук в рамках премии T32 GM119999.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 мл ПЦР-пробирки с плоским колпачком, NaturalWatson137-211C(EX)
0,5 мл пробирки с низкой адгезиейСША Scientific1405-2600
Бета-меркаптоэтанол (BME)Sigma-AldrichM6250-100ML
Бычья сыворотка альбумин (БСА)Sigma-AldrichA4612-25G
Покровное стекло для изготовления ПЭГилированные покровные стеклаThermo Scientific152450Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5
DOPCAvanti Polar Lipids850375
яйцо Liss Rhodamine PEAvanti Polar Lipids810146
EMS Глутаральдегид водный 25%, EM GradeVWR16220
EMS Sodium Cacodylate BufferVWR11652
Этанол, 200 proofFisher Scientific04-355-223EA
HEPESSigma AldrichH3375-1KG
ГексаметилдисилазанSigma-Aldrich440191
Хлорид магнияVWR7791-18-6
Метилцеллюлоза 4000cpSigma-AldrichM052-100G
Микростекло покровные стекла для планарных бислоевMatsunamiСнята с производства
Мини-центрифуга
Нефункционализированные микросферы диоксида кремнияBangs Laboratories, Inc.Зависит от размера: SS0200*-SS0500*Диоксид кремния в водной суспензии
Оптический клейNorland ThorlabsNOA 68Гибкий клей для стекла или пластика
Тетраоксид осмияМиллипоры Sigma20816-12-0
ПарапленкаVWR52858-000
Очиститель плазмыПлазменное травлениеPE-25Напряжение: 120В, 60 Гц. Ток: 15 ампер
Хлористый калийVWR0395-1кг
Круглое покровное стекло, #1.5 12мм   VWR64-0712
Ультразвуковая ваннаBranson1510R-MTУльтразвуковой очиститель Bransonic. 50-60 Гц. Выход: 70 Вт
Соя PIAvanti Полярные липиды840044
настольной центрифугойEppendorf22331
УФ-лампаSpectrolineENF-260C115 Вольт, 60 Гц, 0,20 ампера
ВатманСтекло Микрофибра Фильтровальная бумагаVWR28455-030диаметр 42,5 мм, марка GF/C
22x22

Ссылки

  1. Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
  2. Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).
  3. Mao, Y., Baum, B. Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology. Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).
  4. Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference. Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).
  5. Bigay, J., Casella, J. -F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  6. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
  7. Picard, F., Paquet, M. -J., Dufourc, ÉJ., Auger, M. Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study. Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).
  8. Fu, R., et al. Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules. Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).
  9. Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment. Nature Communications. 5 (1), 4916(2014).
  10. Gill, R. L., et al. Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).
  11. Pan, J., Dalzini, A., Song, L. Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).
  12. Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).
  13. Lee, A. A., et al. Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118(2021).
  14. Ferhan, A. R., et al. Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions. Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).
  15. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420(2019).
  16. Lou, H. -Y., et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  17. Bridges, A. A., et al. Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).
  18. Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
  19. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  20. Lobato-Márquez, D., et al. Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution. Nature Communications. 12 (1), 4511(2021).
  21. Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. The septin cortex at the yeast mother-bud neck. Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).
  22. Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle. Nature Communications. 5, 1-10 (2014).
  23. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  24. Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers. Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).
  25. Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).
  26. Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29(2012).
  27. Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).
  28. Woods, B. L., et al. Biophysical properties governing septin assembly. bioRxiv. , (2021).
  29. Cannon, K. S., et al. A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism. bioRxiv. , (2021).
  30. Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLOS One. 11 (7), 0158457(2016).
  31. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).
  32. Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -Y. Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction. Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).
  33. Andrews, J. T., et al. Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts. Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).
  34. Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).
  35. Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).
  36. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

TIRF
Восстановление сборки септина на мембранах для изучения биофизических свойств и функций
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.