Настоящий протокол описывает методы добавления липидов в жидких и пластинчатых культурах для Caenorhabditis elegans в сочетании с продольными исследованиями и анализом транскрипции генов из объемных или нескольких червей и тканей червей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Липидные добавки для долголетия и транскрипционного анализа генов при caenorhabditis elegans
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Старение является сложным процессом, характеризующимся прогрессирующими физиологическими изменениями, возникающими в результате как экологического, так и генетического вклада. Липиды имеют решающее значение для создания структурных компонентов клеточных мембран, хранения энергии и в качестве сигнальных молекул. Регуляция липидного обмена и передачи сигналов необходима для активации различных путей долголетия. Круглый червь Caenorhabditis elegans является отличным и мощным организмом для препарирования вклада липидного обмена и передачи сигналов в регуляцию долголетия. Многочисленные исследования описывали, как пищевые добавки специфических молекул липидов могут продлить продолжительность жизни C. elegans ; однако незначительные различия в условиях приема добавок могут вызвать проблемы воспроизводимости у ученых в разных лабораториях. Здесь сообщается о двух подробных методах добавок для C. elegans, использующих липидные добавки либо с бактериями, посеянными на пластинах, либо с бактериальной суспензией в жидкой культуре. Также в настоящем описании приведены сведения для выполнения анализов продолжительности жизни с пожизненным приемом липидных добавок и qRT-PCR-анализа с использованием целого лизата червя или рассеченных тканей, полученных от нескольких червей. Используя комбинацию продольных исследований и транскрипционных исследований при приеме липидных добавок, анализы кормления обеспечивают надежные подходы к анализу того, как липиды влияют на долголетие и здоровое старение. Эта методология также может быть адаптирована для различных подходов к скринингу питания для оценки изменений в подмножестве транскриптов с использованием либо небольшого количества рассеченных тканей, либо нескольких животных.
Введение
Липидов
Липиды представляют собой небольшие гидрофобные или амфипатические молекулы, растворимые в органических растворителях, но нерастворимые в воде 1,2. Различные липидные молекулы дифференцируются друг от друга на основе количества атомов углерода, содержащихся в их цепях, расположения, количества двойных связей и связанных структур, включая глицерин или фосфаты. Липиды играют решающую роль внутри и между отдельными клетками для регулирования функций организма, включая создание мембранных бислоев, обеспечение накопления энергии и действие в качестве сигнальных молекул<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
На рисунке 1 показана схема кормления липидами с использованием различных экспериментальных установок.
1. Получение липидных бактерий
- Приготовьте базовый раствор для ограничения рациона бактерий (BDR), растворив 5,85 г NaCl, 1,0 г K2HPO4 и 6,0 г KH2PO4 (см. Таблицу материалов) в 999 мл деионизированной воды. Отрегулируйте рН до 6,0 с 0,5 М КОН, а затем отфильтруйте через фильтр 0,22 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор BDR можно хранить при комнатной температуре для длительного хранения. - Приготовьте среду BDR, добавив 10 мк....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Валидация транскрипционных изменений с использованием нескольких целых червей при приеме липидных добавок
Чтобы исследовать, является ли протокол извлечения и ретротранскрибирования РНК в кДНК от нескольких целых червей воспроизводимым и сопоставимым с данными объемных червей, долгоживущий штамм червя, чрезмерно экспрессирующий лизосомальную кислоту липазы lipl-4 в кишечнике, был использован 7,8,33,35.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Липидные добавки были использованы в исследованиях старения, чтобы прояснить прямое влияние некоторых видов липидов на здоровое старение 6,7,23,26,27,31. Тем не менее, процедура добавления липидов может быть сложной, и любое несоответствие между экспериментами может привести к невоспроизводимым результатам. Здесь задокументи.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов.
Благодарности
Благодарим. Свая за техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантами NIH R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI investigator (M.C.W.) и NIH T32 ES027801 pre-doctoral student fellow (M.S.). Некоторые штаммы были предоставлены CGC, который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1,5 мл Pestle | Genesee Scientific | 93-165P15 | Для измельчения червей с помощью тризола |
| Агарозы | Sigma | A9639-500G | |
| AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix | GenDEPOT | R5600 | Для обратной транскрипции из объемных образцов червей |
| Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR | ThermoFisher | A28567 | Для qRT-PCR |
| Benchmark Scientific StripSpin 12 Микроцентрифуга | Benchmark Scientific | C1248 | Для пробирок для ПЦР |
| Branson 450 Digital Sonifier, с наконечником 1/8" | Branson Ultrasonic Corporation | 100-132-888R | |
| Хлороформ | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Холестерин | Sigma | C8503-25G | |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Sigma | D8418-100ML | |
| Eppendorf 5424 R центрифуга | Eppendorf | 22620444R | Для экстракции РНК |
| Eppendorf vapo protect mastercycler pro | Eppendorf | 950030010 | Для обратной транскрипции |
| Этанол, абсолютный (200 пруф) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 Вт пластина | Neta Scientific | 665180 | 12-луночный Тарелки для кормления |
| Greiner Bio-One Чашка Петри, Ps, 100 x 20 мм | Neta Scientific | 664161 | Для бактериальных пластин LB и червя 10-см NGM тарелки |
| Greiner Bio-One Petri, Ps, 60 x 15 мм | Neta Scientific | 628161 | Для червей6-см NGM пластины |
| Invitrogen без нуклеазы воды | ThermoFisher | AM9937 | |
| Isoproanol | Sigma | PX1835-2 | |
| Левамизола гидрохлорид | VWR | SPCML1054 | |
| lipl-4Tg | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
| >lipl-4Tg; fat-3(wa22) | MCW Lab | N/A | Трансгенный C. elegans |
| Luria Brath Base | ThermoFisher | 12795-084 | |
| Сульфат магния (MgSO4) | Sigma | M2643-500G | |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96-луночный быстрый прозрачный реакционный планшет со штрих-кодом | ThermoFisher | 4483354 | 96-луночный планшет |
| для количественной ПЦРОптическая адгезивная пленка MicroAmp | Прикладная биосистема | 4311971 | Для герметизации 96-луночного кПЦР-планшета |
| Milli-Q Advantage A10 Система очистки воды Sigma | Z00Q0V0WW | деионизированной воды используется для изготовления всех реагентов, включая буферные и культуральные среды, если не указано как безнуклеазная вода в протоколе | |
| N2 | Caenorhabditis Genetics | Center N/A | C. elegans wild isolate |
| Спектрофотометр NanoDrop ND-1000 | ThermoFisher | N/A | Для измерения концентрации РНК |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | Бактерии, используемые в качестве C. elegans пищевой |
| диосновной тригидрат фосфата Potasium (K2HPO4· 3H2O) | Sigma | P5504-1KG | |
| Одноосновной фосфат потазия (KH2PO4) | Sigma | P0662-2.5KG | |
| Power SYBR Green cells-to-Ct набор | ThermoFisher | 4402953 | Для обратной транскрипции и количественной ПЦР из нескольких червей или ткани |
| червей Power SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4367659 | для qPCR из образцов червей |
| Pure Bright germicidal ultra bleach | ООО «КИК Интернешнл». | 59647210143 | 6% домашний отбеливатель Для приготовления яиц червей |
| Pyrex spot plate с девятью углублениями | Sigma | CLS722085-18EA | Часовое стекло для вскрытия червей |
| РНКазаZap РНКаза Раствор для обеззараживания | ThermoFisher | AM9780 | |
| Хлорид натрия (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
| Гидроксид натрия (NaOH) | Sigma | SX0590-3 | |
| Двухосновной гептагидрат фосфата натрия (Na2HPO4· 7H2O) | Sigma | S9390-1KG | |
| Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Центрифуга | Thermo | 7500-4337 | Для сбора бактерий |
| Thermo Sorvall ST 8 центрифуга | Thermo | 7500-7200 | Для приготовления яиц червей |
| Реагент ТРИзол | TheroFisher | 15596018 | реактив для экстракции РНК |
| Турбо набор без ДНК | ThermoFisher | AM1907 | Для удаления загрязнения ДНК при экстракции РНК |
| Vortexer 59 | Denville Scientific INV | S7030 | |
| VWR Одноразовые миксеры для пеллет и аккумуляторный двигатель | VWR | 47747-370 | Для измельчения червей с тризолом |
| VWR Kinetic Energy 26 Дж Мини-центрифуга C1413 V-115 | VWR | N/A | Для сбора червей. Снята с производства модель, аналогичная доступна на VWR с Cat# 76269-064 |
| Червячный подборщик | WormStuff | 59-AWP |
Ссылки
- Fahy, E., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1. Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).
- Liebisch, G., et al. Update on LIPID MAPS classificatio....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
