Method Article

Сочетание 3D-привода магнитной силы и многофункциональной флуоресцентной визуализации для изучения метанобиологии ядра

DOI:

10.3791/64098

⸱

July 5th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Florida, 3Department of Biostatistics, University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE), University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center, University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование представляет новый протокол для непосредственного применения механической силы на ядро клетки через магнитные микрошарики, доставляемые в цитоплазму, и для проведения одновременной флуоресцентной визуализации живых клеток.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фундаментальный вопрос в механобиологии заключается в том, как живые клетки воспринимают внеклеточные механические стимулы в контексте клеточной физиологии и патологии. Считается, что клеточное механо-ощущение внеклеточных механических стимулов проходит через мембранные рецепторы, связанный белковый комплекс и цитоскелет. Последние достижения в области механобиологии демонстрируют, что ядро клетки в самой цитоплазме может независимо воспринимать механические стимулы одновременно. Тем не менее, механистическое понимание того, как клеточное ядро воспринимает, преобразует и реагирует на механические стимулы, отсутствует, главным образом из-за технических проблем в доступе и количественной оценке механики ядра с помощью обычных инструментов. В этой статье описывается проектирование, изготовление и реализация нового магнитного силового привода, который применяет точные и неинвазивные 3D-механические стимулы для прямой деформации ядра клетки. Используя клетки, спроектированные CRISPR / Cas9, это исследование демонстрирует, что этот инструмент в сочетании с конфокальной флуоресцентной визуализацией с высоким разрешением позволяет выявить динамику в реальном времени механочувствительного yes-ассоциированного белка (YAP) в отдельных клетках в зависимости от деформации ядра. Этот простой метод может преодолеть существующий технологический разрыв в механобиологическом сообществе и дать ответы на пробел в знаниях, который существует в отношении между механотрансдукцией ядра и функцией клетки.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование направлено на разработку и применение новой техники для выяснения механобиологии ядра путем объединения магнитных приводов, которые применяют механическую силу непосредственно к ядру клетки, и конфокальной флуоресцентной микроскопии, которая одновременно отображает структурные и функциональные субклеточные изменения. Клетки воспринимают внеклеточные биофизические сигналы, включая жесткость тканей 1,2,3,4, давление интерстициальной жидкости и напряжение сдвига 5,6,7, топологию/геометрию поверхности 8,9,10,11,12 и напряжение растяжения/сжатия 13,14, 15,16. Биофизические сигналы преобразуются в биохимические сигналы и вызывают потенциальные последующие изменения экспрессии генов и поведения клеток - процесс, известный как механотрансдукция 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Для изучения процессов механотрансдукции было разработано множество методов применения механической силы к клеткам, таких как атомно-силовая микроскопия28, устройство растяжения клеток29, датчик силы био-MEMS (микроэлектромеханические системы) 15,30,31, реология сдвига32 и стереовидение System 33 . Недавний обзор обобщает подходы к применению внеклеточных механических сигналов и вмешательству в механозондирование34. На сегодняшний день большинство из этих методов применяют силу на клеточную плазматическую мембрану, и клетки непосредственно получают эти внеклеточные биофизические сигналы через мембранные рецепторы, такие как интегрин, кадгерин, ионные каналы и рецепторы, связанные с G-белком. Впоследствии они передают сигнал на внутриклеточный цитоскелет и ядро. Например, используя транслокацию yes-ассоциированного белка (YAP) в качестве индикатора механо-зондирования, показано, что клетки воспринимают механические сигналы жесткости субстрата и внеклеточного напряжения от клеточной мембраны и передают их через цитоскелет в ядро, чтобы индуцировать транслокацию YAP цитоплазмы в ядро28,35.

Последние данные свидетельствуют о том, что само ядро клетки является независимым механосенсором 8,36,37. Это доказано экспериментами, выполненными на изолированном ядре, собранном из клеток, где было выявлено, что ядра адаптивно изменяют свою жесткость в ответ на механическую силу, непосредственно приложенную на них36. Во время многих физиологических состояний ядра как в опухолевых, так и в здоровых клетках воспринимают внеклеточные биофизические сигналы и изменяют свои механические свойства и сборки 38,39,40. Например, при экстравазации ядерная жесткость опухолевых клеток уменьшается и сохраняет мягкость более 24 ч38. Во время миграции через замкнутое интерстициальное пространство ядра опухолевых клеток часто теряют и восстанавливают свою структурную целостность39. Однако способ, которым ядро воспринимает биофизический сигнал, неизвестен, хотя было обнаружено, что в нем участвуют несколько белков ядерной оболочки и семейств белков, таких как Lamin A / C и линкер нуклеоскелета и комплекса цитоскелетов (LINC) 38,41. Следовательно, новые неинвазивные методы, которые могут непосредственно прикладывать силу к ядру, отделят эффект передачи силы от клеточно-плазматической мембраны и цитоскелета и помогут прояснить ранее недоступные молекулярные механизмы ядерного механо-зондирования.

Исследования, в которых использовались оптические пинцеты для манипулирования органеллами42 и микрошариками, вводимыми в клетки43, показали технологическую способность непосредственно прикладывать силу к ядру. Однако метод оптического пинцета имеет несколько ограничений: (1) оптический пинцет с низкой пропускной способностью часто манипулирует только одной клеткой или микрогранулой за раз; и (2) потенциальное фотоповреждение и температурный артефакт-деформация ядра требуют десятков пН36, а соответствующая необходимая мощность лазера составляет около 10 мВт на пН 44,45. Такой интенсивности лазера достаточно, чтобы вызвать фотоповреждения в клетках и возмутить функции клеток во время эксперимента46.

Магнитная сила, приложенная через микрошарики в живых клетках, показывает потенциал непосредственного приложения силы к ядру и преодолевает ограничения оптического пинцета. Как только микрошарики доставляются в цитоплазму, магнитное поле может оказывать магнитную силу на несколько микрошариков одновременно с высокой пропускной способностью. Магнитное поле не влияет на функции ячейки47, но генерирует силу от pN до nN, которой достаточно, чтобы вызвать ядерную деформацию 36,48,49. На сегодняшний день манипуляции с магнитными микрошариками применяются на клеточной плазматической мембране48, внутри цитоплазмы50, на F-актине51, внутри ядра47 и на изолированном ядре36. Однако магнитные манипуляции с микрошариками никогда не использовались для применения прямой механической силы на ядерную оболочку для изучения механотрансдукции в ядре.

В этой статье разработан простой метод неинвазивной доставки магнитных микрошариков в цитоплазму и использования этих микрошариков для приложения механической силы к ядру (рисунок 1). Здесь для проверки метода используются нормальные клеточные линии человека, спроектированные CRISPR / Cas9, которые эндогенно экспрессируют mNeonGreen21-10/11 YAP. YAP является механочувствительным белком, и транслокация YAP регулируется ядерным механо-зондированием14,28. Подход, регулируемый CRISPR/Cas9, был выбран для маркировки эндогенного YAP флуоресцентным белком (FP) mNeonGreen21-10/11. Хотя известно, что редактирование CRISPR имеет неполную эффективность и нецелевой эффект, протоколы в предыдущих публикациях интегрировали флуоресцентную сортировку для выбора для правильной вставки открытого кадра чтения 52,53,54. С этим дополнительным слоем отбора не наблюдалось никакого события нецелевой маркировки в более чем 20 клеточных линиях, ранее сгенерированных 52,53,54,55. Это расщепленная флуоресцентная белковая конструкция, но в принципе любая экспрессируемая флуоресцентная метка может быть пригодна для использования. Этот подход к маркировке превосходит методы трансгенов или антител. Во-первых, в отличие от трансгенной экспрессии, меченый белок поддерживает дозировку гена с одной копией и экспрессируется в физиологическом контексте регуляторной сети нативного гена, ограничивая отклонения в концентрации белка, локализации и взаимодействии. Метод маркировки, используемый в этом исследовании, обеспечивает более высокую пропускную способность и эффективность на порядок, чем полная маркировка FP. Это также позволяет избежать проблем, связанных с иммунофлуоресценцией из-за артефактов фиксации и ограниченной доступности высококачественных антител с высокой специфичностью. Во-вторых, подход, используемый в этой статье, делает минимальное возмущение физиологии клеток и позволяет в режиме реального времени выявить все эндогенные YAP достоверно. Напротив, другие распространенные трансгенные методы часто приводят к гиперэкспрессии YAP. Полученное искусственное распределение может потенциально вызвать цитотоксичность и повлиять на механо-зондирование клеток 56,57,58.

В этом исследовании представлен протокол для непосредственного приложения силы к ядру через магнитные микрошарики, доставляемые в цитоплазму, и для проведения одновременной флуоресцентной визуализации живых клеток. Таким образом, представленные здесь протоколы демонстрируют, как (1) доставлять магнитные микрошарики в клетку, находясь вне ядра, (2) манипулировать микрошариками для приложения магнитной силы к ядру, (3) выполнять конфокальную флуоресцентную визуализацию клеток во время манипуляции и (4) количественно анализировать соотношение YAP ядерной / цитоплазмы (N / C) на протяжении всего процесса приложения силы. Результаты показывают, что (1) через эндоцитоз магнитные микрошарики могут быть неинвазивно доставлены в цитоплазму B2B-клеток в течение 7 ч (Рисунок 2 и Рисунок 3); и (2) количественная магнитная сила, непосредственно приложенная к ядру (рисунок 4, рисунок 5 и рисунок 6), сама по себе может вызвать различные изменения соотношения YAP N/C в ячейках B2B, спроектированных CRISPR/Cas9 (рисунок 7 и рисунок 8).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Обслуживание B2B-ячеек, разработанных CRISPR/Cas9

  1. Культивируйте B2B-клетки в колбе T25 с RPMI-1640, дополненным 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллин-стрептомицином.
  2. Поддерживайте клетки B2B в увлажненном инкубаторе при 37 °C с 5% CO2.
  3. Субкультура B2B-клеток при слиянии достигает от 70% до 80%.
  4. Храните клеточную линию B2B в питательной среде RPMI-1640 с 10% (v/v) DMSO в морозильной камере -80 °C.
  5. Используйте в экспериментах B2B-клетки с числом прохода менее 10.

2. Клеточная культура

  1. Посейте клетки на чашку Петри со стеклянным дном.
    1. Переместите колбу, содержащую B2B-клетки внутри, из инкубатора в шкаф биобезопасности.
    2. Удалите питательную среду в колбу с помощью аспирирующей пипетки с подключенным вакуумным насосом.
    3. Промыть колбу 2 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
    4. Удалите PBS с помощью аспирационной пипетки.
    5. Добавляют 0,5 мл 0,05% раствора трипсина для отсоединения клеток от дна колбы субстрата.
    6. Поставьте колбу в инкубатор на 5 мин.
    7. Переместите колбу в шкаф биобезопасности. Добавьте 5 мл новой питательной среды в колбу и пипеткой раствор вверх и вниз.
    8. Нанесите 50 мкл среды с ячейками (300 клеток/мкл) на чашку Петри со стеклянным дном. Добавьте 2 мл питательной среды в чашку Петри.
    9. Поместите чашку Петри в инкубатор. Подождите 12 часов, пока ячейки не прикрепятся.
  2. Культивируйте клетки магнитными микрошариками.
    1. Весят 0,2 г карбонильных железных микрошариков среднего диаметра 7 мкм (далее именуемые микрошариками 7 мкм, см. Таблицу материалов).
    2. Используйте пипетку для суспендирования микрогранул в 1 мл питательной среды RPMI-1640.
    3. Возьмите чашку Петри с B2B-клетками в шкаф биобезопасности.
    4. Добавьте 200 мкл среды, содержащей микрогранулы, в чашку Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Быстро добавляйте среду, чтобы избежать осаждения микрошариков.
    5. Поместите чашку Петри обратно в инкубатор до тех пор, пока микрошарики не усвоятся клетками. Проверяйте интернализацию каждые 6 ч, чтобы определить оптимальное время интернализации для различных клеточных линий.
    6. Чтобы проверить интернализацию, выполните конфокальную флуоресцентную визуализацию для визуализации границы микрогранулы, ядра и клетки. Если микрогранула интернализуется клеткой, она будет находиться в пределах клеточной границы.

3. Визуализация ядра

  1. Прогреть 1,5 мл питательной среды в инкубаторе в течение 15 мин.
  2. Выключите свет шкафа биобезопасности. Возьмите чашку Петри, содержащую клетку, подогретую питательную среду, ядерное пятно и верапамил HCl, в шкаф биобезопасности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Компоненты ядерного окрашивания чувствительны к свету. Избегайте воздействия света во время работы.
  3. Разбавить 1000x ядерное пятно DMSO до 100x.
  4. Разбавляют 100 мМ верапамила HCl ДМСО до 10 мМ.
  5. Добавьте 15 мкл 100-кратного ядерного пятна и 15 мкл 10 мМ верапамила HCl к 1,5 мл питательной среды. Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз.
  6. Выньте питательную среду из чашки Петри. Добавьте в чашку Петри питательную среду, содержащую ядерное окрашивание.
  7. Поместите клетки обратно в инкубатор более чем на 2 ч.

4. Подготовка аппаратуры приложения магнитной силы

  1. 3D-печать всех деталей с использованием акрилонитрилбутадиенстирола (ABS) и сборка их в соответствии с конструкцией CAD (рисунок 1A). Конструкция САПР включена в Таблицу материалов.
  2. Используйте двустороннюю ленту для крепления магнита к магнитно-движущемуся устройству (рисунок 1А).
  3. Установите магнитно-движущееся устройство рядом со сценой микроскопа. Используйте три ручки, чтобы отрегулировать пространственное расположение магнита, пока он не сможет перемещаться над чашкой Петри между 13 мм и 120 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что верхний предел расстояния между магнитом и чашкой Петри как можно больше, чтобы избежать нежелательного применения силы на магнитные микрошарики. 120 мм является максимальным значением в этой экспериментальной установке. Убедитесь, что магнит не мешает частям микроскопа, включая объективы и моторизованные ступени.
  4. Установите магнит в самое высокое z-положение (120 мм).

5. Принудительное применение и визуализация живых клеток

  1. Установка камеры окружающей среды для долгосрочной визуализации
    1. Нанесите 75% раствор этанола для тщательной стерилизации и очистки камеры окружающей среды.
    2. Поместите камеру окружающей среды на моторизованную ступень перевернутого микроскопа.
    3. Откройте резервуар CO2 и установите скорость притока CO2 на уровне 160 мл/мин.
    4. Отрегулируйте температуру камеры до 44 °C (сверху), 42 °C (ванна) и 40 °C (ступень).
    5. Добавьте 20 мл очищенной воды в ванну камеры окружающей среды для поддержания влажности 90%.
    6. Выньте чашку Петри со стеклянным дном, содержащую клетки-мишени, из инкубатора культуры тканей и поместите ее в камеру.
    7. Нанесите металлический зажим камеры окружающей среды, чтобы зафиксировать положение чашки Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чашка Петри должна быть плотно зажата в камере, потому что магнитная сила может переместить чашку, если она не зажата.
    8. Закройте крышку камеры.
  2. Оптимизация параметров визуализации
    1. Оптимизируйте размер точечного отверстия: точечное отверстие блокирует фотоны вне фокуса. Больший размер точечного отверстия дает больше фотонов вне фокуса, но более яркое изображение. Меньший размер точечного отверстия дает более сфокусированное и тусклое изображение. Обязательно оптимизируйте размер точечного отверстия, чтобы получить конфокальные изображения в фокусе с соответствующим соотношением сигнал/шум.
    2. Оптимизация интенсивности лазера: интенсивность лазера определяет интенсивность возбуждения и, следовательно, излучения света. Низкая интенсивность лазера дает низкое отношение сигнал/шум. Слишком высокая интенсивность лазера вызовет фотоотбеливание. Отрегулируйте интенсивность лазера соответствующим образом.
    3. Оптимизация размера шага и шагов: шаги и размер шага определяют, сколько изображений будет сделано в Z-стеке. Меньшие размеры шагов и больше шагов увеличат разрешение Z-стека, но также увеличат фотоотбеливание. В этом эксперименте размер шага 1 мкм использовался для клеток с высотой ячейки ~ 15 мкм.
    4. Оптимизируйте время экспозиции: время экспозиции определяет, как долго клетка будет подвергаться воздействию лазера возбуждения. Низкое время экспозиции уменьшит отношение сигнал/шум. Высокое время экспозиции приведет к фотоотбеливанию. В этом эксперименте использовалось время экспозиции 1 кадр на 4 с.
    5. Оптимизация параметров изображения: измените один из четырех параметров итеративно и сохраните согласованность остальных параметров. Каждый раз измеряйте коэффициент YAP N/C каждого изображения и сравнивайте изменение коэффициента YAP N/C, чтобы определить уровень фотоотбеливания. Повторяйте процесс оптимизации до тех пор, пока не будет достигнут баланс между отношением сигнал/шум, скоростью изображения и фотоотбеливанием.
    6. Определите конфигурации изображений, используя оптимизированные параметры изображения для более быстрых настроек изображения во время экспериментов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конфигурации, используемые в данном исследовании, описаны в разделе 5.3 параметров визуализации. Для оптимизации параметров визуализации конфигураций в разделе 5.3 используйте тот же метод, что и на шаге 5.2.5.
  3. Применение малых усилий и конфокальная визуализация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскоп Nikon Ti2-E использовался для визуализации в этом исследовании, и подробные шаги для получения изображения приведены ниже.
    1. Откройте инвертированный микроскоп. Откройте программное приложение Elements.
    2. Определите magnetic_find конфигурации. Проверьте только канал FITC. Установите PMT HV = 70, Смещение = 0, Интенсивность лазера = 10. Установите скорость сканирования на 1 кадр в 2 с, нажав кнопку 1/2 . Установите размер точечного отверстия на 1,2 а.е., нажав кнопку 1.2 A.U. Эта конфигурация будет использоваться на шаге 5.3.5.
    3. Определите magnetic_YAP_Nucleus конфигурации. Проверьте канал FITC. Установите PMT HV = 70, Смещение = 0, Интенсивность лазера = 10. Установите скорость сканирования на 1 кадр в 4 с, нажав кнопку 1/2 . Установите размер точечного отверстия на 1,2 а.е., нажав кнопку 1.2 A.U. Чтобы сфотографировать границу ядра и интенсивность ядерного пятна, проверьте канал Cy5. Установите PMT HV = 70, Смещение = 0, Интенсивность лазера = 10. Размер точечного отверстия оптимизирован для 3D-визуализации YAP. Не нажимайте кнопку 1.2 A.U. снова после проверки канала Cy5. Эта конфигурация будет использоваться на шаге 5.3.7.
    4. При необходимости включите DIA через Elements . Откройте SpinView, используйте яркое поле и настройте фокус объекта, чтобы получить четкое изображение ячеек в фокусе. Используйте 10-кратную цель, чтобы найти подходящие несколько одиночных клеток в трех условиях: с одной микрогранулой внутри, с несколькими микрошариками внутри и без какой-либо микрогранулы внутри. Переключитесь на объектив 40x. Назовите эту позицию соответствующим номером позиции.
    5. Открытые элементы. Нажмите на magnetic_find. Нажмите кнопку Удалить блокировку.
    6. Нажмите кнопку Сканировать и отрегулируйте Z-положение фокальной плоскости. Нажмите кнопки «Сверху» и «Снизу», чтобы задать нижний и верхний пределы для Z-стека выделенных ячеек. Остановите сканирование, нажав кнопку Сканировать еще раз.
    7. Переключитесь на конфигурацию magnetic_YAP_Nucleus . Задайте имя файла before_small_force.nd2. Нажмите на кнопку Выполнить с записанным Z-стеком.
    8. Переключитесь на правильный путь освещения и включите DIA. Откройте SpinView и нажмите на кнопку Запись . Между тем, покрутите ручку магнитно-движущегося устройства, чтобы переместить магнит вниз на 46 мм над дном чашки Петри. Сохранение последовательности изображений или видео с ярким полем. Проверьте видео, чтобы подтвердить, что микрошарики показывают смещение, вызванное магнитной силой.
    9. Повторите шаги 5.3.5-5.3.7; задайте для файла имя after_small_force.nd2.
    10. Переключитесь на правильный путь освещения и включите DIA. Затем откройте SpinView и нажмите кнопку «Запись ». Между тем, покрутите ручку магнитно-движущегося устройства, чтобы переместить магнит до 120 мм над дном чашки Петри. Сохранение последовательности изображений или видео с ярким полем.
    11. Повторите шаги 5.3.5-5.3.7 и задайте имя файла before_large_force.nd2.
  4. Применение большого усилия и конфокальная визуализация
    1. Снимите крышку камеры окружающей среды, чтобы магнит достиг 13 мм над дном чашки Петри.
    2. Переключитесь на правильный путь освещения и включите DIA. Откройте SpinView и нажмите на кнопку Запись . Между тем, покрутите ручку магнитно-движущегося устройства, чтобы переместить магнит вниз на 13 мм над дном чашки Петри. Сохранение последовательности изображений или видео с ярким полем. Проверьте видео, чтобы подтвердить, что микрошарики показывают смещение, вызванное магнитной силой.
    3. Повторите шаги 5.3.5-5.3.7 и задайте имя файла after_large_force.nd2.
    4. Переключитесь на правильный путь освещения и включите DIA. Затем откройте SpinView и нажмите кнопку «Запись ». Между тем, покрутите ручку магнитно-движущегося устройства, чтобы переместить магнит до 120 мм над дном чашки Петри. Сохранение последовательности изображений или видео с ярким полем.
    5. Повторите шаги 5.3.5-5.3.7; задайте для файла имя retract_large_force.nd2.
    6. Закройте крышку камеры окружающей среды.
  5. Повторите шаги 5.2 и 5.3 для нескольких полей зрения, чтобы при необходимости получить дополнительные данные.

6. Обработка изображений и анализ данных

  1. Количественная оценка соотношения YAP N/C
    1. Открыть Фиджи ImageJ. Откройте изображения .nd2, сделанные на шаге 5.
    2. Нажмите «Анализировать > набор измерений». Проверьте область, интегрированную плотность, среднее значение серого цвета и дескрипторы формы.
    3. Используйте канал Cy5 для идентификации ядра. Нажмите на Freehand Selections, чтобы использовать инструмент свободного выделения для очертания ядра. Кроме того, проверьте автоматический макрос ядерной маски в ImageJ (см. Таблицу материалов).
    4. Щелкните Анализировать > меру в канале FITC. Измеренным значением среднего значения является средняя интенсивность ядерного YAP DN.
    5. Используйте канал Cy5 для идентификации ядра. Используйте канал FITC для идентификации ячейки. Нажмите « Выделение от руки», чтобы использовать инструмент свободного выбора, чтобы выбрать интересующую область в цитоплазме и избежать магнитной микрошарики. Эта область интереса не должна включать ядро.
    6. Щелкните Анализировать > меру в канале FITC. Измеренным значением среднего значения является средняя интенсивность цитоплазматического YAP DC.
    7. Рассчитайте отношение YAP N/C = DN / DC.
  2. Количественная оценка ядерной формы и нормированной интенсивности ядерных пятен
    1. Открыть Фиджи ImageJ. Откройте изображения .nd2, сделанные на шаге 5.
    2. Нажмите «Анализировать > набор измерений». Проверьте область, интегрированную плотность, среднее значение серого цвета и дескрипторы формы.
    3. Используйте канал Cy5 для идентификации ядра. Нажмите на Freehand Selections, чтобы использовать инструмент свободного выделения для очертания ядра.
    4. Нажмите «Анализировать > измерение » в канале Cy5. Измеренным значением среднего значения является интенсивность ядерного пятна. Измеренное значение Circ. — это ядерная цикличность.
    5. Чтобы сравнить интенсивность ядерного пятна при различном силовом состоянии, вся интенсивность ядерного пятна делится на интенсивность ядерного пятна в «before_small_force,nd2» для получения нормализованной интенсивности ядерного пятна.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конструкция магнитно-подвижного устройства и применение магнитной силы
Чтобы приложить силу к ядру через магнитные микрошарики, было спроектировано и построено магнитно-движущееся устройство для управления пространственным положением магнита. Магнитно-движущееся устройство содержит центральную раму, три ручки и рельсы для независимого перемещения прикрепленного магнита в направлениях x, y и z с пространственным разрешением 1,59 мм на цикл (рисунок 1A). Как только магнит п...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Интернализация магнитных микрошариков (раздел 2.2) имеет решающее значение, поскольку внеклеточные микрошарики не могут прикладывать силу непосредственно к ядру. Применение силы и визуализация (раздел 5.3) являются критическими шагами в этом эксперименте, и сила, необходимая для деформации ядра и индуцирования значимых биологических последствий, может зависеть от образца. Величина силы в этом эксперименте (0,8 нН и 1,4 нН) может быть дополнительно увеличена, чтобы вызвать ядерное механо-зондирование в менее чувствительны...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет никаких конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот проект финансируется UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), UFHCC Pilot Award (X. T. и Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) и UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Мы искренне ценим интеллектуальные дискуссии и техническую поддержку со стороны д-ра Джонатана Лихта (UFHCC), д-ра Рольфа Ренне (UFHCC), д-ра Кристофера Вульпе (UFHCC), д-ра Бланки Шармы (BME), д-ра Марка Шеплака (MAE & ECE), д-ра Даниэля Ферриса (BME), д-ра Малисы Сарнтиноранонт (MAE), д-ра Ашока Кумара (MAE), д-ра Бенджамина Кеселовски (BME), д-ра Брента Гила (RSC), д-ра Филиппа Фэна (ECE), Д-р Грегори А. Худалла (BME), д-р Стивен Гивизцани (OSSM), д-р Йенисель Круз-Алмейда (CDBS), д-р Роджер Филлингим (CD-BS), д-р Роберт Кодл (OMS), д-р Джон Нойберт (DN-OR), д-р Джастин Хилиард (нейрохирургия), д-р Тянь Хэ (Гарвардский университет), д-р Юхуа Тан (Гонконгский политехнический университет), д-р Джесси Л-С Ау (Институт фармакологии количественных систем), д-р Дэвид Хан (Университет Аризоны), и Группа поддержки компании «Никон» (д-р Хосе Серрано-Велес, Ларри Кордон и Джон Экман). Мы глубоко благодарны за эффективную поддержку со стороны всех членов исследовательских лабораторий Tang' s, Yamaguchi's, Sharma's, Au's, Siemann и Guan, а также всех сотрудников отдела UF MAE.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,05 % трипсинCorning25-051-CI
25 см<суп>2 колбаCorning156340
7-&микро; m средний диаметр карбонильные микрошарикижелеза н/д н/д
A1R конфокальная системаNikon
Порошок карбонильного железа CMBASF30042253Магнитные микрогранулы
Культуральная среда (RPMI-1640)Gibco11875093
Настольный компьютерDellс операционной системой Windows 10
Климатическая камера ТИЗБTokai HitTIZB
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco26140
Fiji ImageJНациональные институты здравоохранения и Лаборатория оптических и вычислительных приборов
Чашка Петри со стеклянным дномMatTekP35G-1.5-14-C
MagnetK& J Magnetics, Inc.D99-N52
Монохромный  ФотоаппаратFLIRBFS-U3-70S7M-C
Программная платформа NIS-Elements Программная платформаNikonЯдерная
маска ImageJ макромаска
https://github.com/KOLIUG/Nuclear NucSpot Live 650Biotium#40082Ядерное окрашивание
Пенициллин-стрептомицинGibco15140122
Фосфат буферизованный солевой раствор (PBS)Gibco10010023
инвертированный микроскоп Ti2-E
Nikon XYZ mover (файлы CAD)https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
  3. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (4), 1261-1269 (2020).
  4. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  5. Hofmann, M., et al. Lowering of tumor interstitial fluid pressure reduces tumor cell proliferation in a xenograft tumor model. Neoplasia. 8 (2), 89-95 (2006).
  6. Yankaskas, C. L., et al. The fluid shear stress sensor TRPM7 regulates tumor cell intravasation. Science Advances. 7 (28), (2021).
  7. Kim, E., et al. A biosynthetic hybrid spidroin-amyloid-mussel foot protein for underwater adhesion on diverse surfaces. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (41), 48457-48468 (2021).
  8. Tajik, A., et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nature Materials. 15 (12), 1287-1296 (2016).
  9. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  10. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  11. Ren, B., et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Applied Physics Reviews. 9 (1), 011408(2022).
  12. Coyle, S., et al. Cell alignment modulated by surface nano-topography-Roles of cell-matrix and cell-cell interactions. Acta Biomaterialia. 142, 149-159 (2022).
  13. Sawada, Y., et al. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas. Cell. 127 (5), 1015-1026 (2006).
  14. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  15. Tang, X., et al. Specific and non-specific adhesion in cancer cells with various metastatic potentials. Mechanobiology of Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. , Springer. Boston, MA. 105-122 (2011).
  16. Tang, X., Saif, T. A. Adhesivity of colon cancer cells during in vitro metastasis. International Journal of Applied Mechanics. 5 (03), 1350025(2013).
  17. Chaudhuri, O., et al. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  18. Ohashi, K., Fujiwara, S., Mizuno, K. Roles of the cytoskeleton, cell adhesion and rho signalling in mechanosensing and mechanotransduction. The Journal of Biochemistry. 161 (3), 245-254 (2017).
  19. Hamill, O. P., Martinac, B. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiological Reviews. 81 (2), 685-740 (2001).
  20. Liang, C., et al. Towards an integrative understanding of cancer mechanobiology: Calcium, YAP, and microRNA under biophysical Forces. Soft Matter. 18, 1112-1148 (2022).
  21. Tan, Y., et al. Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature Communications. 5 (1), 1-12 (2014).
  22. Poh, Y., et al. Dynamic force-induced direct dissociation of protein complexes in a nuclear body in living cells. Nature Communications. 3 (1), 1-10 (2012).
  23. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13 (1), 1-15 (2014).
  24. Wu, J., et al. Effects of dynein on microtubule mechanics and centrosome positioning. Molecular Biology of the Cell. 22 (24), 4834-4841 (2011).
  25. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 7197-7206 (2011).
  26. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  27. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  28. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171 (6), 1397-1410 (2017).
  29. Gudipaty, S. A., et al. Mechanical stretch triggers rapid epithelial cell division through Piezo1. Nature. 543 (7643), 118-121 (2017).
  30. Tang, X., et al. Attenuation of cell mechanosensitivity in colon cancer cells during in vitro metastasis. PLoS One. 7 (11), 50443(2012).
  31. Cha, C., et al. Top-down synthesis of versatile polyaspartamide linkers for single-step protein conjugation to materials. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2377-2382 (2012).
  32. Chen, X., et al. Glycosaminoglycans modulate long-range mechanical communication between cells in collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (15), (2022).
  33. Boyle, J. J., Pless, R. B., Thomopoulos, S., Genin, G. M. Direct estimation of surface strain fields from a stereo vision system. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (7), 074503(2020).
  34. Kim, S., Uroz, M., Bays, J. L., Chen, C. S. Harnessing mechanobiology for tissue engineering. Developmental Cell. 56 (2), 180-191 (2021).
  35. Driscoll, T. P., et al. Cytoskeletal to nuclear strain transfer regulates YAP signaling in mesenchymal stem cells. Biophysical Journal. 108 (12), 2783-2793 (2015).
  36. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  37. Vashisth, M. Scaling concepts in 'omics: Nuclear lamin-B scales with tumor growth and often predicts poor prognosis, unlike fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (48), (2021).
  38. Roberts, A. B., et al. Tumor cell nuclei soften during transendothelial migration. Journal of Biomechanics. 121, 110400(2021).
  39. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  40. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  41. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. The Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
  42. Shelby, J., Patrick, J., Edgar, S., Chiu, D. T. Monitoring cell survival after extraction of a single subcellular organelle using optical trapping and pulsed-nitrogen laser ablation. Photochemistry and Photobiology. 81 (4), 994-1001 (2005).
  43. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Diffusion and directed motion in cellular transport. Physical Review E. 66 (1), 011916(2002).
  44. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23 (1), 247-285 (1994).
  45. Rohrbach, A. Stiffness of optical traps: quantitative agreement between experiment and electromagnetic theory. Physical Review Letters. 95 (16), 168102(2005).
  46. Neuman, K. C., et al. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophysical Journal. 77 (5), 2856-2863 (1999).
  47. Kanger, J. S., Subramaniam, V., Driel, R. V. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic microbeads. Chromosome Research. 16 (3), 511-522 (2008).
  48. Bausch, A. R., et al. Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic microbead microrheometry. Biophysical Journal. 75 (4), 2038-2049 (1998).
  49. Fisher, J. K., et al. Three-dimensional force microscope: a nanometric optical tracking and magnetic manipulation system for the biomedical sciences. Review of Scientific Instruments. 76 (5), 053711(2005).
  50. Berret, J. -F. Local viscoelasticity of living cells measured by rotational magnetic spectroscopy. Nature Communications. 7, 10134(2016).
  51. Hu, B., Dobson, J., El Haj, A. J. Control of smooth muscle α-actin (SMA) up-regulation in HBMSCs using remote magnetic microbead mechano-activation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (1), 45-55 (2014).
  52. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046(2016).
  53. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370(2017).
  54. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3501-3508 (2016).
  55. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  56. Ansari, A. M., et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 553-559 (2016).
  57. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  58. Ratz, M., et al. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592(2015).
  59. Suzuki, H., Ho, C., Kasagi, N. A chaotic mixer for magnetic microbead-based micro cell sorter. Journal of Microelectromechanical Systems. 13 (5), 779-790 (2004).
  60. Luo, Q., et al. All-optical mechanobiology interrogation of yes-associated protein in human cancer and normal cells using a multi-functional system. Journal of Visualized Experiments. (178), e62934(2021).
  61. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. BioRxiv. , (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nucleus MechanobiologyMagnetic Force ActuatorFluorescence ImagingConfocal MicroscopyNuclear MechanosensingYAP TranslocationMagnetic MicrobeadsNucleus DeformationCytoskeleton MechanicsLive Cell Imaging

Related Articles