Методическая статья

Простой метод настольной фильтрации для выделения небольших внеклеточных везикул из мезенхимальных стволовых клеток человека

DOI:

10.3791/64106

⸱

23 июня 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Universiti Kebangsaan Malaysia Medical Centre, 2My CytoHealth Sdn. Bhd., 3School of Biosciences, Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University, 4School of Pharmacy, Monash University Malaysia, 5Haematology Unit, Cancer Research Centre, Institute for Medical Research (IMR), National Institutes of Health (NIH), Ministry of Health Malaysia, 6School of Pharmacy, Faculty of Health & Medical Sciences, Taylor's University, 7Centre for Drug Discovery and Molecular Pharmacology (CDDMP), Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол демонстрирует, как изолировать небольшие внеклеточные везикулы мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповины человека (hUC-MSC-sEVs), с помощью простой лабораторной настольной настройки. Распределение по размерам, концентрация белка, маркеры sEVs и морфология изолированных hUC-MSC-sEV характеризуются анализом отслеживания наночастиц, анализом белка BCA, вестерн-блоттингом и просвечивающим электронным микроскопом соответственно.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процесс, основанный на ультрацентрифугировании, считается распространенным методом выделения малых внеклеточных везикул (sEV). Однако выход от этого метода изоляции относительно ниже, и эти методы неэффективны при разделении подтипов sEV. Это исследование демонстрирует простой метод настольной фильтрации для выделения малых внеклеточных везикул МСК, полученных из пуповины человека (hUC-MSC-sEVs), успешно отделенных ультрафильтрацией от кондиционированной среды hUC-MSCs. Распределение по размерам, концентрация белка, экзосомальные маркеры (CD9, CD81, TSG101) и морфология выделенных hUC-MSC-sEV были охарактеризованы с помощью анализа отслеживания наночастиц, анализа белка BCA, вестерн-блоттинга и просвечивающего электронного микроскопа соответственно. Размер изолированных hUC-MSC-sEV составлял 30-200 нм, с концентрацией частиц 7,75 × 10 частиц /мл и концентрацией белка 80 мкг / мл. Наблюдались положительные полосы для экзосомальных маркеров CD9, CD81 и TSG101. Это исследование показало, что hUC-MSC-sEV были успешно выделены из кондиционированной среды hUC-MSCs, а характеристика показала, что выделенный продукт соответствует критериям, указанным в Минимальная информация для исследований внеклеточных везикул 2018 (MISEV 2018).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Согласно MISEV 2018, sEV представляют собой нереплицирующиеся липидные бислойные частицы без функционального ядра размером 30-200нм 1. sEV, полученные из MSC, содержат важные сигнальные молекулы, которые играют важную роль в регенерации тканей, такие как микроРНК, цитокины или белки. Они все чаще становятся исследовательской «горячей точкой» в области регенеративной медицины и бесклеточной терапии. Многие исследования показали, что sEV, полученные из МСК, так же эффективны, как и МСК, при лечении различных состояний, таких как иммуномодуляция 2,3,4,5, усиление остеогенеза 6, сахарный диабет 7,8 или регенерация сосудов 9,10. По мере продвижения исследований на ранней стадии были выделены три основных ключевых вопроса, связанных с клинической трансляцией МСК-ЭВ: выход ВВ, чистота ВВ (свободные от клеточного мусора и других биологических загрязнителей, таких как белок и цитокины) и целостность фосфолипидной двухслойной мембраны ВВ после выделения.

Были разработаны различные методы выделения sEV с использованием плотности, формы, размера и поверхностного белка sEVs11. Двумя наиболее распространенными методами изоляции электромобилей являются методы на основе ультрацентрифугирования и ультрафильтрации.

Методы, основанные на ультрацентрифугировании, считаются золотым стандартом при выделении электромобилей. Два типа методов ультрацентрифугирования, которые обычно используются, - это дифференциальное ультрацентрифугирование и ультрацентрифугирование с градиентом плотности. Однако методы ультрацентрифугирования часто приводят к низкому выходу и требуют дорогостоящего оборудования для высокоскоростной ультрацентрифуги (100 000-200 000 × г)11. Кроме того, методы ультрацентрифугирования сами по себе неэффективны при разделении подтипов EV (sEV и больших EV), что приводит к образованию нечистого слояосадка 11. Наконец, ультрацентрифугирование градиента плотности также может занимать много времени и требовать дополнительных мер предосторожности, таких как добавление буфера сахарозы, чтобы предотвратить повреждение градиента на этапах12 ускорения и замедления. Следовательно, ультрацентрифугирование обычно приводит к относительно низкому выходу и не способно различать различные популяции ЭВ13, что ограничивает его применение для крупномасштабной подготовкиЭВ 11.

Второй метод изоляции электромобилей - это ультрафильтрация, основанная на фильтрации по размеру. Ультрафильтрация относительно эффективна по времени и затратам по сравнению с ультрацентрифугированием, поскольку она не требует дорогостоящего оборудования или длительного времени обработки14. Следовательно, ультрафильтрация, по-видимому, является более эффективным методом изоляции, чем оба вышеупомянутых метода ультрацентрифугирования. Изолированные продукты могут быть более конкретными в зависимости от размеров пор и более высокого выхода15. Однако дополнительная сила, возникающая в процессе фильтрации, может привести к деформации или извержению EV16.

В настоящем документе предложен экономичный и эффективный по времени настольный протокол для выделения sEV, полученных из MSC, для последующего анализа и терапевтических целей. Метод, описанный в этой статье, сочетал в себе простой метод фильтрации с настольным центрифугированием для выделения высокопродуктивных и качественных EV из hUC-MSC для последующего анализа, включая анализ размера частиц, анализ биомаркеров и электронно-микроскопическую визуализацию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе.

1. Мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека и культура

  1. Культивируйте hUC-MSCs при плотности высева 5 × 103/см2 в DMEM, дополненный 8% лизатом тромбоцитов человека и 1% Pen-стрептококком. Инкубируйте клетки при 37 ° C в 5% CO2. Заменяйте среду для культивирования клеток каждые 3 дня, чтобы обеспечить правильный рост клеток.
  2. Расширьте ячейки до прохода 5 в колбах T175 для изоляции sEV.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения высокого выхода sEV требуется много колб (выход увеличивается с увеличением количества ячеек).

2. Выделение малых внеклеточных везикул из hUC - МСК

  1. Замените культуральную среду свежим ДМЭМ, не содержащим фенол-красного, с добавлением 1% Pen-Strep [кондиционированная среда (CM)], когда культура достигнет 70-80% слияния при прохождении 5.
    ВНИМАНИЕ: Используйте только базальные среды; избегайте добавок FBS и лизата тромбоцитов человека, чтобы избежать загрязнения внешними sEV.
  2. Через 24 ч центрифугируют КМ при 200 × г в течение 5 мин при 4 °С для удаления клеточного мусора. Соберите и отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтр 0,22 мкм для удаления частиц размером более 220 нм.
  3. Заполните центробежный фильтрующий блок 30 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), отфильтрованного через фильтр 0,2 мкм. Центрифугу центробежного фильтрующего блока при 3 500 × г в течение 5 мин при 4 °C.
  4. Залейте отфильтрованный CM в центробежный фильтрующий блок (максимальный объем каждого блока составляет 70 мл). Центрифугу КМ при 3 500 × г при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность центрифугирования следует контролировать время от времени, пока раствор не достигнет поверхности фильтра.
  5. Вылейте раствор в чашку с раствором фильтрата. Обратная центрифуга пробоотборника с чашкой для сбора концентрата при 1 000 x g при 4 °C в течение 2 мин.
  6. Переведите концентрированный CM обратно в центробежный фильтрующий блок. Добавьте 30 мл отфильтрованного PBS в центробежный фильтрующий блок и центрифугируйте установку при 3,500 × г при 4 °C.
  7. Вылейте раствор в чашку с раствором фильтрата. Установите чашку для сбора концентрата на фильтрующий блок и проведите реверсивную центрифугу при 1 000 × г в течение 2 мин при 4 ° C для получения очищенных электромобилей.
  8. Отфильтруйте sEV через шприцевой фильтр 0,22 мкм.
  9. Переложите образцы в новые пробирки и храните их при температуре -80 °C для дальнейшего анализа.

3. Характеристика hUC-MSC-sEV

  1. Анализ отслеживания наночастиц
    1. Разбавьте изолированные hUC-MSC-sEV в отфильтрованном PBS до 20-100 частиц в кадре.
    2. Введите 1 мл разбавленного образца в камеру NTA с помощью одноразовых шприцев объемом 1 мл.
    3. Установите соответствующие настройки измерения: отрегулируйте уровень камеры до уровня 14, определите порог обнаружения , чтобы включить как можно больше частиц с ограничением, что подсчитывается 10-100 красных крестов , а количество синих крестиков ограничено пятью.
    4. Для каждого измерения запишите пять видеороликов продолжительностью 1 минута и проанализируйте их с помощью программного обеспечения NanoSight с порогом обнаружения пять.
    5. Сделайте измерения в трех экземплярах для каждого образца.
  2. Анализ вестерн-блоттинга
    1. Лизируют hUC-MSC-sEV с помощью ледяного буфера для лизиса методом радиоиммунопреципитации (RIPA), инкубируют в течение 30 мин при 4 °C и центрифугу при 200 × г в течение 5 мин при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость.
    2. Количественно определите белок с помощью набора для анализа белка бицинхониновой кислоты (BCA). Соберите набор для гель-электрофореза соответствующим образом и выполняйте гель-электрофорез при 90 В, пока белок не достигнет конца геля для укладки. Измените напряжение на 200 В, чтобы отделить белки до конца рассасывающегося геля.
    3. Выполняйте полусухой перенос для переноса белков из геля в мембрану из поливинилидендифторида (PVDF) при 15 В в течение 1 ч.
    4. Заблокируйте мембрану PVDF 3% бычьим сывороточным альбумином (BSA)/трис-буферным физиологическим раствором-0,1% v/v Tween 20 (TBS-T) в течение 1 ч на шейкере при комнатной температуре. Инкубируют мембрану PVDF с первичными антителами следующим образом: моноклональное антитело мыши против CD 9 (1:500), моноклональное антитело против CD 81 мыши (1:500), моноклональное антитело мыши против GRP 94 моноклональное антитело мыши против TSG 101 (1:500) при 4 ° C в течение ночи с постоянным встряхиванием.
    5. На следующий день мембрану PVDF промывают 5 х 5 мин TBS-T и далее инкубируют с вторичным антителом: конъюгированным с пероксидазой хрена мышиным каппа-белком (m-IgGκ BP-HRP) (1:5000) в течение 1 ч с перемешиванием при комнатной температуре.
    6. Опять же, промойте мембрану PVDF TBS-T пять раз и визуализируйте мембрану в тепловизоре с зарядовой связью (CCD) с помощью реагента для обнаружения хемилюминесценции. Проанализируйте уровень экспрессии белков с помощью программного обеспечения ImageJ. Сначала откройте файл изображения в ImageJ (File | Открыть...). Повысьте качество изображения, отрегулировав яркость и контрастность (Изображение | Отрегулируйте | Яркость/контрастность). Отрегулируйте изображение до тех пор, пока кляксы не станут хорошо видны, нажмите кнопку «Применить », а затем сохраните изображения в формате TIFF (Файл | Сохранить как | ТИФФ...).
  3. Просвечивающий электронный микроскоп
    1. Разбавьте одну часть образца hUC-MSC-sEVs четырьмя частями отфильтрованного PBS до общего объема 10 мкл и инкубируйте на медной сетке с углеродным покрытием в течение 15 мин.
    2. Удалите излишки образца с помощью лабораторной салфетки и дайте ему высохнуть на воздухе в течение 3 минут.
    3. Инкубировать 10 мкл 1% раствора фосфовольфрамовой кислоты (ПТА) для окрашивания образца в течение 3 мин.
    4. Удалите излишки 1% раствора PTA с помощью лабораторной салфетки и дайте ему высохнуть на воздухе в течение 3 минут.
    5. Используйте образец для визуализации просвечивающим электронным микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 приведены обобщенные этапы схематического эксперимента.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 2 показано, что hUC-MSC-sEV имеют режим размера частиц на длине волны 53 нм, в то время как другие значимые пики размера частиц составляли 96 и 115 нм. Концентрация hUC-MSC-sEV, измеренная NTA, составляла 7,75 × 10 частиц /мл . Концентрация белка hUC-MSC-sEV, измеренная с помощью анализа BCA, составляла приблизительно 80 мкг / мл.

При анализе вестерн-блоттинга hUC-MSC-sEV продемонстрировали положительные полосы для экзосомальных маркеров CD9,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ЭВ являются одним из важных подмножеств секретома в МСК, которые играют решающую роль во время нормальных и патологических процессов. Тем не менее, в последнее десятилетие sEV с диапазоном размеров от 30 до 200 нм стали потенциальным инструментом для бесклеточной терапии. Были разработаны различные методы для выделения sEV из MSC. Однако дифференциальное ультрацентрифугирование, ультрафильтрация, осаждение на основе полимеров, иммуноаффинный захват и осаждение на основе микрофлюидики обладают различными преимуществами и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Публикация этого видео была поддержана My CytoHealth Sdn. Bhd.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
40% акриламидNacalai Tesque06121-95Western blot
95% этанолNacalai Tesque14710-25Дезинфицирующие средства
Absolute MethanolChemiz45081Для активации мембраны PVDF (Western blot)
AccutaseSTEMCELL Technologies7920Фермент диссоциации
клеток персульфата аммонияChemiz14475Катализ полимеризации геля (Гель электрофорез
анти-CD 81 (B-11)Santa Cruz Biotechnologysc-166029Антитело для маркера sEVs
анти-TSG 101 (C-2)Santa Cruz Biotechnologysc-7964Антитело для маркера sEVs
Бычий сывороточный альбуминNacalai Tesque00653-31PVDF блокирование мембраны
бромофенол синийNacalai Tesque05808-61электрофоретический цветовой маркер
Centricon Plus-70 (100 кДа NMWL)Изоляция миллипорUFC710008sEVs
ChemiLumi One LNacalai Tesque7880хемилюминесцентный реагент
CryoStor замораживающая средаSigma-AldrichC3124-100MLCell криоконсерв
Dulbecco' s модифицированный Eagle' s mediumNacalai Tesque08458-45Среда для клеточных культур
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein MarkerSMOBIOPM2610Маркеры молекулярной массы белка
Сверхтолстая промокательная бумагаATTOбуфер резерв (вестерн-блот)
ГлицеринMerckG5516Химикаты для вестерн-блоттинга
Глицин1-е основаниеBIO-2085-500gХимикаты для буфера (Western Blot)
мышиного белка, связывающего каппа с пероксидазой хрена (m-IgGκ BP-HRP)Santa Cruz Biotechnologysc-516102Вторичное антитело (вестерн-блот
Хьюман Уортон s Желейные мезенхимальные стволовые клетки (МСК)Центр тканевой инженерии и регенеративной медицины, Медицинский факультет, Национальный университет Малайзии
Антитела к мышам анти-CD 9 (C-4)Санта-Круз Биотехнология  sc-13118Антитело для sEVs маркер
Nanosight NS300, оснащенный CMOS-камерой, объективом 20×, синим лазерным модулем (488  nm), и программное обеспечение NTA v3.2Malvern Panalytical, Великобритания
параформальдегидNacalai Tesque02890-45Sample Fixation во время TEM
penicillin– стрептомицинNacalai Tesque26253-84Антибиотик для сред
фенилметилсульфонилфторидNacalai Tesque27327-81Ингибирует протеазы в образцах sEVs после добавления лизисного буфера
фосфатно-солевого буфераGibco10010023Washing, разведение образца
поливинилиденфторид (PVDF) мембрана с
размером пор 0,45 мм		ATTOДля удержания белка во время переноса белка (вестерн-блот)
Коктейль ингибиторов протеазыNacalai Tesque25955-11Ингибирование протеаз в образцах sEVs после добавления буфера лизиса
Protein Assay Bicinchoninate KitNacalai Tesque06385-00Измерение белка
буферный раствор образца с 2-MENacalai Tesque30566-22Восстановитель для западного блоттинга
натрия хлоридNacalai Tesque15266-64Химикаты для вестерн-блоттинга
додецилсульфат натрияNacalai Tesque31606-62ионное поверхностно-активное вещество при гель-электрофорезе
Tecnai G2 F20 S-TWIN просвечивающий электронный микроскопFEI, США
тетраметилэтилендиаминNacalai Tesque33401-72химикаты для приготовления гелевого
трис-основания1st BaseBIO-1400-500gХимикаты для буфера (Western Blot)
  Tween 20GeneTexGTX30962Химикаты для вестерн-блоттинга
UVP (Ultra Vision Product) CCD imagerCCD imager для обнаружения сигнала вестерн-блоттинга
)

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239(2017).
  3. Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
  4. Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
  5. Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
  6. Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
  7. Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741(2021).
  8. Jayabalan, N., et al. Frontiers in Endocrinology. 8, Front Endocrinol. Lausanne. (2017).
  9. Wei, Y., et al. Biomaterials. 204, Biomaterials. 13-24 (2019).
  10. Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
  11. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  12. Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  13. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
  14. Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).
  15. Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  16. Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
  17. Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, San Diego, Calif. 64-74 (2015).
  18. Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BCA

Похожие статьи