Методическая статья

Тестирование проницаемости эпителия в энтероидах, полученных из тканей плода

DOI:

10.3791/64108

⸱

16 июня 2022 г.

 ,  ,  ,  , 
1Morsani College of Medicine, University of South Florida, 2Department of Pediatrics, Morsani College of Medicine, University of South Florida, 3Department of Molecular Pharmacology and Physiology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол подробно описывает создание энтероидов, трехмерной кишечной модели, из кишечной ткани плода. Иммунофлуоресцентная визуализация эпителиальных биомаркеров использовалась для характеристики модели. Апикальное воздействие липополисахаридов, бактериального эндотоксина, с использованием метода микроинъекции индуцировало проницаемость эпителия дозозависимым образом, измеряемым утечкой флуоресцентного декстрана.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Энтероиды, полученные из тканей плода человека, становятся многообещающей моделью in vitro для изучения кишечных травм у недоношенных детей. Энтероиды проявляют полярность, состоящую из просвета с апикальной границей, плотных соединений и базолатерального внешнего слоя, подверженного воздействию питательных сред. К последствиям травм кишечника относят воспаление слизистой оболочки и повышенную проницаемость. Тестирование кишечной проницаемости у уязвимых недоношенных людей часто неосуществимо. Таким образом, для изучения кишечных повреждений кишечника у недоношенных детей необходима кишечная модель in vitro . Энтероиды могут быть использованы для проверки изменений проницаемости эпителия, регулируемых белками плотного соединения. У энтероидов стволовые клетки кишечника дифференцируются во все типы эпителиальных клеток и образуют трехмерную структуру на матрице базальной мембраны, секретируемой клетками саркомы мыши. В этой статье мы опишем методы, используемые для установления энтероидов из кишечной ткани плода, характеризуя энтероидные плотные соединения белков иммунофлуоресцентной визуализацией и проверки проницаемости эпителия. Поскольку грамотрицательный доминантный бактериальный дисбактериоз является известным фактором риска повреждения кишечника, мы использовали липополисахарид (ЛПС), эндотоксин, продуцируемый грамотрицательными бактериями, чтобы вызвать проницаемость в энтероидах. Флуоресцеин-меченый декстран был микроинъецирован в энтероидный просвет, и последовательные концентрации декстрана, просочившиеся в культуральную среду, были измерены для количественной оценки изменений параклеточной проницаемости. Эксперимент показал, что апикальное воздействие ЛПС индуцирует проницаемость эпителия в зависимости от концентрации. Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что грамотрицательный доминантный дисбактериоз способствует механизму повреждения кишечника у недоношенных детей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недоношенные дети подвергаются частому и длительному воспалению, которое подвергает их повышенному риску повреждения кишечника, что приводит к долгосрочной инвалидности или смерти1. Исследования в этой области оспариваются ограниченной способностью проводить эксперименты на уязвимых недоношенных детях. Кроме того, отсутствие подходящих моделей затрудняет всестороннее изучение преждевременной кишечной среды2. Существующие модели in vitro и in vivo не смогли всесторонне представить преждевременную кишечную среду человека. В частности, одиночные эпителиальные клеточные линии плода могут не образовывать плотных соединений, а животные модели демонстрируют различные воспалительные и иммунологические реакции, чем недоношенные дети. С открытием передачи сигналов Wnt в качестве основного пути в пролиферации и дифференцировке стволовых клеток кишечного крипта и новых тканевых стволовых клеток Lgr5+, органоиды, полученные из кишечной ткани, такие как энтероиды и колоноиды, были установлены в качестве моделей in vitro 3,4,5. Используя эту технологию, можно создавать и использовать трехмерные (3D) энтероидные модели, которые разрабатываются из целой ткани или биопсии кишечника для изучения эпителиальных реакций на кишечную среду 6,7.

В отличие от типичных клеточных линий кишечника, выращенных в культуре, энтероиды проявляют полярность с просветом, соединенным белками плотного соединения8. Это позволяет подвергать воздействию базолатеральную границу в среде роста, а также люминальную микроинъекцию для оценки апикальной границы. Кроме того, энтероиды демонстрируют сходные генетические, физиологические и иммунологические характеристики с эпителием человека 9,10. Энтероиды, полученные из тканей плода, позволяют исследовать роль недоношенных в функции эпителия. Уникальные характеристики энтероидов могут больше напоминать преждевременную кишечную среду9. Тканевые энтероиды могут быть использованы для проверки целостности плотного соединения в виде монослоя или в виде 3D-структур, встроенных в затвердевшую белковую смесь базальной мембраны. Метод микроинъекции требуется для последней формы, если требуется апикальное воздействие. Измерение эпителиальных реакций в энтероидных моделях включает экспрессию генов путем секвенирования РНК, биомаркеры с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) или передовые методы визуализации. Метод, представленный здесь, обеспечивает еще один возможный вариант измерения валовой проницаемости с помощью флуорометрии.

Повреждение кишечника у недоношенных детей имеет многофакторный патогенез, который включает в себя дисбаланс микробного сообщества кишечника. Энтероиды могут обеспечить отличные модели для изучения определенных аспектов преждевременных кишечных заболеваний, таких как некротизирующий энтероколит, которые включают функции эпителия11. Энтероиды проявляют те же характеристики, что и кишечник плода человека10. Воздействие энтероидов на липополисахарид (ЛПС), эндотоксин, продуцируемый грамотрицательными бактериями, в культуральной среде в качестве базолатерального воздействия индуцирует экспрессию генов, которая может привести к увеличению воспаления и кишечной проницаемости7. Это исследование направлено на оценку изменений в валовой проницаемости эпителия после апикального воздействия бактериальных продуктов, таких как ЛПС. Результаты могут дать представление о микробно-эпителиальных взаимодействиях, участвующих в патогенезе повреждения кишечника. Метод, предназначенный для проверки валовой проницаемости, требует микроинъекционной установки и навыков.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Коллекция тканей человека была одобрена Советом по институциональному обзору Вашингтонского университета (идентификатор исследования: STUDY380 и CR ID: CR3603) и выполнена Исследовательской лабораторией врожденных дефектов. Исследовательская лаборатория врожденных дефектов была поддержана наградой NIH No 5R24HD000836 от Национального института детского здоровья и развития человека Имени Юнис Кеннеди Шрайвер. Образцы были собраны у согласных участников и отправлены как обезличенные и без какой-либо медицинской информации. Образцы тонкой кишки хранились в ледяном фосфатно-буферном солевом растворе Dulbecco (DPBS) и отправлялись на ночь в приемную лабораторию.

1. Подготовка реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Список реагентов и каталожные номера приведены в Таблице материалов ; рекомендуемые объемы предназначены для плиты с 6 скважинами, если не указано иное.

  1. Приготовьте 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), растворив 50 мг порошка BSA в 50 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) со 100 мкг / мл антибиотика широкого спектра действия примоцина для покрытия всей пластиковой посуды и наконечников, которые контактируют с тканями или энтероидами.
    1. Чтобы покрыть BSA, поместите нефильтрованные наконечники пипеток в коническую трубку объемом 50 мл с достаточным количеством BSA для покрытия наконечников, добавьте 1-2 мл BSA для покрытия поверхности чашки Петри или заполните конические трубки BSA объемом 15 мл в течение не менее 20-30 минут при комнатной температуре перед использованием.
  2. Готовят среду DPBS путем смешивания 50 мл DPBS со 100 мкг/мл примоцина и 50 мкг/мл гентамицина. Приготовьте эту среду с амфотерицином 2,5 мкг/мл и без него.
  3. Получают энтероидные питательные среды, смешивая 2 мл органоидной питательной среды, 100 мкг/мл примоцина, 10 мкМ Y27632 и 2,5 мкМ CHIR99021. Ежедневно готовьте свежие носители и нагревайте их в инкубаторе клеточных культур при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент разрежения для Y27632 составляет 1:250. Для CHIR99021 разбавьте раствор CHIR до 1:100 в теплых средах, а затем до 1:40 в энтероидных питательных средах для достижения разбавления 1:4000.
  4. Готовят матричную смесь базальной мембраны, добавляя в запас основную мембранную матрицу 10 мкМ Y27632 и 2,5 мкМ CHIR99021. Сделайте в общей сложности 285 мкл окончательной смеси матрицы базальной мембраны при концентрации белка 8 мг/мл для одной лунки 6-луночной пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Основная мембранная матрица должна быть ледяной, чтобы оставаться в жидкой форме и затвердевать при более высоких температурах. Концентрация белка в матрице базальной мембраны определяет объем, необходимый для получения конечной концентрации белка 8 мг/мл, используя уравнение:
    Объем 1 × Концентрация 1 = Объем 2 × Концентрация 2
  5. Приготовьте 4% параформальдегида (PFA), разбавив 32% запаса PFA в PBS на 1:8, и храните при комнатной температуре. Сделайте 0,5 мл на каждую лунку энтероидов, подлежащих фиксации.
  6. Приготовьте блокирующий буфер, добавив 5% козьей сыворотки и 0,5% Тритона X-100 в PBS. Приготовьте 1 мл для первого антитела на лунку и 0,5 мл для дополнительного антитела на лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте сыворотку того же вида, что и хозяин вторичных антител
  7. Получают первичные и вторичные антитела, разведенные в блокирующем буфере в концентрации, рекомендованной производителем для каждого антитела.
  8. Готовят 5 мкг/мл дмидино-2-фенилиндола (DAPI) путем разбавления до 1:200 из 1 мг/мл стандартного раствора в PBS. Внесите 0,5 мл на лунку окрашенных энтероидов.
  9. Приготовьте 70% глицерина в PBS и сделайте 0,5 мл для установки энтероидов на предметные стекла микроскопа.
  10. Готовят 5 мг/мл декстран-ФИТЦ (флуоресцеин-изотиоцианат), разбавляя 25 мг/мл раствора в PBS в соотношении 1:5. Сделайте 20 мкл для микроинъекции.
  11. Приготовьте липополисахариды (ЛПС) и декстран-ФИТЦ путем восстановления порошка ЛПС в ПБС до 5 мг/мл раствора. Разбавляют стоковые растворы ЛПС и декстрана в ПБС до 0,1 мг/мл и 0,5 мг/мл ЛПС и 5 мг/мл декстрана-ФИТЦ. Сделайте 20 мкл для микроинъекции.
  12. Получают этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N',N'-тетрауксусную кислоту (ЭГТА), сделав запасной раствор 0,2 М путем растворения порошка ЭГТА в дистиллированной воде и регулировки рН примерно до 8 с использованием соляной кислоты (HCl). Подготовьте испытательную концентрацию 2 мМ в питательных средах, выполнив разбавление 1:100.

2. Коллекция образцов

  1. Как только образцы получены, выполните изоляцию эпителиальных клеток и покрытие в течение 24 часов после сбора образцов.

3. Покрытие эпителиальных клеток кишечника в матрице базальной мембраны из целых образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура следует модифицированным протоколам лаборатории моделирования трансляционных тканей Мичиганского университета 12,13,14. Использование питательных сред с высоким коэффициентом Wnt дает последовательные результаты для энтероидного образования. Как только энтероиды установлены, используйте те же среды с высоким коэффициентом Wnt, чтобы привести энтероиды к сферическим формам для микроинъекции.

  1. Переложите сегменты кишечника в чашку Петри размером 60 мм х 15 мм с ледяным DPBS с амфотерицином и замочите на льду в течение 20 мин. Пока ткань пропитывается, определите области (двенадцатиперстная кишка, тощая кишка или подвздошная кишка) тонкой кишки и удалите соединительную ткань и кровеносные сосуды щипцами и ножницами. Вымойте содержимое просвета по мере необходимости, используя небольшую иглу 23-25 г и шприц 3 мл без нарушения эпителия.
  2. Нарежьте сегменты кишечника на кусочки по 3-5 мм с помощью скальпеля и поместите 1-2 кусочка (для обшивки в одну лунку 6-луночной пластины) в чашку Петри размером 35 мм х 15 мм, содержащую на льду 0,5-1 мл органоидной питательной среды.
  3. С помощью рассечения микроножницы и щипцы разрезают кишечную трубку продольно. Используйте кончик щипцов, чтобы соскоблить эпителиальные клетки с фасции под 10-кратным стереомикроскопом. Удалите фасцию и закрутите блюдо, чтобы разбить сгустки клеток.
  4. Используйте наконечник пипетки объемом 20 мкл для переноса клеток и среды с шагом 5-10 мкл в матричную смесь базальной мембраны, чтобы получить раствор 285 мкл при концентрации матричного белка 8 мг/мл. Пипетка вверх и вниз медленно 20x для смешивания клеток в матрице базальной мембраны на льду с помощью разрезанного наконечника 200 мкл.
  5. Поместите пять 50 мкл полосок матрицы клеточной базальной мембраны в одну лунку предварительно нагретой 6-луночной пластины, хранящейся на теплом пенопластовом кирпиче. Инкубируют пластину в инкубаторе клеточной культуры при 37 °C и 5% CO2 в течение 10 мин, чтобы позволить матрице базальной мембраны полимеризоваться и затвердеть.
  6. Добавьте 2 мл энтероидной среды роста в лунку затвердевших полосок матрицы базальной мембраны и поместите обратно внутрь инкубатора клеточной культуры. Ежедневно меняйте медиа, чтобы стимулировать рост энтероидов. Ежедневно проверяйте дифференцировку кишечных стволовых клеток под 10-кратным инвертированным микроскопом.
  7. Через 10-14 дней пропускают энтероиды в одну лунку из 12-луночной или 6-луночной пластины в зависимости от плотности энтероидов. Начните менять медиа через день и проходите в соотношении 1:2 каждые 5-7 дней, когда энтероиды начнут процветать.
    1. Удаляют клетки, которые не дифференцируются в энтероиды, с помощью матричного слоя базальной мембраны во время проходов. Создайте замороженный запас энтероидов с низким проходом, заморозив их в 80% питательной среде, 10% фетальной бычьей сыворотке (FBS) и 10% диметилсульфоксиде (DMSO), если это необходимо.

4. Иммунофлуоресцентное окрашивание энтероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс фиксации и окрашивания занимает 3 дня. В этом протоколе мы фиксировали и окрашивали ядра (DAPI), эпителиальные маркеры (villin, CDX2), лизоцим, муцин и белки плотного соединения (клаудин 2, клаудин 3, окклюдин, zonula occluden-1) с использованием модифицированного протокола15. Флуоресцентные снимки были сделаны конфокальным микроскопом.

  1. Закрепление
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс обычно выполняется одновременно с энтероидным проходом или процедурой замораживания.
    1. Поместите энтероидную пластину на лед. Удалите питательные среды и аккуратно промыть 2x холодными DPBS.
    2. Определите энтероиды, подлежащие фиксации и окрашиванию. Переложите их на 12-луночную пластину, тщательно пипетировав их режущим наконечником объемом 200 мкл или используя инокуляторную петлю объемом 1 мкл. Поместите энтероиды в отдельные лунки, если необходимо провести окрашивание различными антителами.
    3. Удалите как можно больше жидкости кончиком объемом 200 мкл, не нарушая энтероиды. Добавьте 0,5 мл 4% PFA и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре. Время от времени закручивайте пластину, чтобы облегчить отслоение энтероидов от матрицы базальной мембраны.
    4. Исследуют грубо, чтобы определить отслоение энтероидов от матрицы базальной мембраны. Осторожно аспирируйте и выбросьте жидкий PFA, не нарушая энтероиды. Промывка с PBS 3x для удаления PFA и любой остаточной матрицы базальной мембраны
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аспирация жидкости под стереомикроскопом может быть полезна для предотвращения энтероидов. Фиксированные энтероиды могут храниться в PBS при 4 °C до 1 месяца.
  2. Блокировка
    1. Осторожно удалите остатки PBS пипеткой 200 мкл, не нарушая энтероиды. Добавить 0,5 мл блокирующего буфера и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре.
    2. Извлеките и выбросьте блокирующий буфер с помощью пипетки 200 мкл, стараясь избежать нарушения энтероидов.
  3. Окрашивание антителами
    1. Добавьте 500 мкл первичного антитела в блокирующий буфер к каждой лунке с энтероидами. Для первичных антител и для лизоцима коэффициент разбавления равен 1:100, для CDX2 коэффициент разбавления равен 1:100, а для виллина коэффициент разбавления равен 1:50. Инкубировать при 4 °C в течение ночи.
    2. На следующий день удалите раствор антител и промыть 3 раза PBS. Подождите 10-15 минут инкубационного времени для каждой стирки.
    3. Повторите шаги 4.3.1.-4.3.2. для вторичного антитела с коэффициентом разведения 1:400.
    4. Добавьте 500 мкл DAPI при 5 мкг/мл в PBS и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 мин. После инкубации промыть 3 раза PBS и дать 10-15 минут инкубационного времени для каждой промывки
  4. Установка
    1. Удалите как можно больше PBS. Промыть окрашенные энтероиды 70% глицерином 1x.
    2. Поднимите энтероиды из пластины с помощью инокуляционной петли объемом 1 мкл или разрезанного наконечника объемом 200 мкл и установите с 70% глицерином на предметное стекло микроскопа.
    3. Чтобы сохранить 3D-структуру энтероидов, обеспечьте пространство 0,5-1 мм между нижним стеклянным слайдом и крышкой. Используйте вырезы из тонкого силиконового резинового листа или стеклянной крышки, чтобы создать пространство между стеклянной горкой и крышкой. Энтероиды теперь можно визуализировать с помощью конфокального микроскопа.

5. Подготовка к микроинъекции энтероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол микроинъекции является модифицированным протоколом от Hill et al.16 в соответствии с ресурсами и настройками. Некоторые из подготовительных шагов должны быть завершены за несколько дней.

  1. Настройка микроинъекционной установки
    1. Установите микроинжекторный аппарат либо внутри шкафа биобезопасности, либо на чистый счетчик, в зависимости от цели экспериментов, следующим образом: стереомикроскоп для просмотра, микроманипулятор с регулятором осей X,Y и Z, установленный на тяжелой подставке рядом с микроскопом, держатель микропипетки, установленный на кронштейне микроманипулятора, трубка микроинжектора, соединяющая держатель микропипетки, и шприц с трехсторонним запорным краном, затем к пневматическому насосу и настенному источнику воздуха, подключенному к насосу (рисунок 1).
    2. Дезинфицируйте микроинъекционный аппарат 70% этанолом перед экспериментальным использованием и после него. Проверьте позиционирование микроскопа и микроманипулятора в соответствии с желаемыми физическими характеристиками, включая перемещение осевых ручек, чтобы микропипетка могла достичь целевого образца.
  2. Приготовление микропипетки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эти действия заранее.
    1. Используйте съемник микропипетки, чтобы втянуть стеклянные капиллярные трубки в микропипетки.
    2. Под стереомикроскопом поместите микропипетку на горизонтальный держатель микропипетки (рисунок 2), сосредоточьтесь на наконечниках и вырежьте наконечники с помощью микроножников, глядя через окуляры микроскопа. Подготовьте около 10-15 микропипеток с одинаковым размером наконечника для каждого эксперимента.
    3. Проверьте размер наконечника, подтянув 0,5-1 мкл жидкости, и посчитайте, сколько насосов необходимо для опорожнения объема. Протестируйте несколько размеров наконечников, чтобы найти подходящий размер для эксперимента. Соответствующий размер наконечника выбрасывает примерно 10-30 нЛ объема на насос.
    4. Храните нарезанные стеклянные микропипетты в чистой коробке или трубке, не повреждая наконечники.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно нарезанные микропипетты доступны в продаже.
  3. Энтероидная подготовка
    1. Поместите на лед пластину, состоящую в основном из крупных и сферических энтероидов. Замените старую питательную среду свежей.
    2. Осторожно отделите точки матрицы базальной мембраны от пластины с помощью клеточного лифтера. Закрутите гелевые точки из стороны в сторону на льду, чтобы разрушить матрицу базальной мембраны, не нарушая энтероиды.
    3. Выберите около 10-15 сферических энтероидов с вырезанным наконечником пипетки 20 мкл под стереомикроскопом и добавьте к матрице базальной мембраны, чтобы получить 285 мкл смеси белковой концентрации 8 мг / мл.
    4. Аккуратно пипетируйте вверх и вниз с помощью разрезанного наконечника объемом 200 мкл, чтобы смешать энтероиды, не ломая их. Пластина пяти 50 мкл гелевых точек в центре круглой чашки 35 мм х 10 мм для культуры клеток Петри или одной с аналогичными размерами.
    5. Инкубировать энтероидные гелевые точки при 37 °C в течение 10 мин для затвердевания. Затем добавьте в блюдо 1 мл свежей питательной среды. Инкубируют энтероиды в течение не менее 2-3 дней для стабилизации и до тех пор, пока энтероиды не достигнут соответствующего размера 0,5-1 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно иметь блюдо с низкой стенкой для более легкого доступа к энтероидам и небольшим диаметром для меньшего объема питательной среды.
  4. Микроинъекция декстран-ФИТЦ и испытуемого материала
    1. Выключите трехсторонний запорный кран на пневматический насос. Заполните микропипетку введенным материалом, в данном случае декстран-ФИТЦ с ЛПС или без него.
    2. Приготовьте чашку Петри, покрытую полоской прозрачной пленки. Поместите на пленку две-четыре точки введенного материала по 1 мкл.
    3. Используйте микроманипулятор, чтобы загнать наконечник микропипетки прямо внутрь жидкости, но над пленкой под визуализацией стереомикроскопа. Осторожно потяните за шприц, чтобы вывести введенный материал в микропипетку.
    4. Наполните микропипетку 2-4 мкл введенного материала и надавите на шприц, чтобы удалить любой воздух на кончике микропипетки. Осмотрите колонку впрыскиваемого материала в микропипетке, чтобы убедиться, что в ней нет воздушного кармана. Запишите объем вводимого материала, который выводился внутрь микропипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкость видна в зеленоватом цвете благодаря декстран-ФИТК.
    5. Включите источник воздуха, подключенный к пневматическому насосу, который обеспечивает давление воздуха примерно 60 фунтов на квадратный дюйм. Включите насос и установите длительность насоса на 10-15 мс. Поверните запорный кран на шприце, чтобы открыть линию от насоса до микропипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большая продолжительность насоса позволяет выделять больше материала на насос. Для оценки объема впрыска рекомендуется использовать одинаковую продолжительность насоса и микропипетты с одинаковыми размерами наконечников.
    6. Удалите энтероиды из инкубатора клеточной культуры и поместите посуду поверх теплого пенопластового кирпича в закрытый контейнер, чтобы ограничить воздействие света после микроинъекции.
    7. Поместите чашку Петри с энтероидами под стереомикроскоп и переместите ручки микроманипулятора, чтобы поместить наконечник микропипетки под углом около 35°-45° к горизонтальной поверхности (рисунок 3). Это требует некоторой практики заранее.
    8. Визуализируйте и нанесите на карту энтероиды в каждой чашке Петри под микроскопом, чтобы составить план введения около 3-5 сферических энтероидов на чашку.
    9. Как только кончик микропипетки приблизится к поверхности жидкости, посмотрите в окуляры микроскопа, чтобы продвинуть наконечник к целевому энтероиду.
    10. Проколите энтероид кончиком микропипетки, продвигая ручку оси Z точным медленным движением. Энтероидная стенка будет сжиматься и выскакивать назад, как только наконечник проходит через энтероидную поверхность, и в этот момент продвижение должно прекратиться.
    11. Нажмите на педаль насоса одной ногой и заполните энтероид зеленоватым раствором декстран-FITC до тех пор, пока он не будет слегка расширен. Запишите количество насосов, чтобы рассчитать перекачиваемый объем и концентрацию декстрана.
    12. Извлеките кончик микропипетки после завершения микроинъекции и перейдите к следующему энтероиду. С практикой процесс может пройти гладко.
      1. Если наконечник сломался, замените его другой микропипеткой с аналогичным размером наконечника. Вытяните достаточный объем вводимого материала для всех энтероидов в одной группе воздействия и измените микропипетку между вводимыми материалами, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
    13. Поместите введенное энтероидное блюдо под крышку, чтобы избежать воздействия света.
  5. Сбор и измерение Декстран-ФИТЦ
    1. После процедуры микроинъекции немедленно удалить культуральную среду. Промыть свежей питательной средой 2x, чтобы удалить остатки декстран-FITC. Добавьте свежие носители и запишите время как время 0 после микроинъекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вам может понадобиться второй человек, чтобы выполнить этот шаг, не нарушая процесс микроинъекции.
    2. Собрать 200 мкл культуральной среды в непрозрачной микрофузионной трубке объемом 0,5 мл, а затем заменить удаленную культуральную среду тем же объемом свежей питательной среды через 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 10 ч и 12 ч после микроинъекций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Временной интервал может варьироваться в зависимости от эксперимента. При базолатеральном воздействии замещающие среды должны содержать экспозицию в той же концентрации.
    3. Хранят собранные питательные среды при 4 °C и измеряют концентрацию декстрана в течение 24 ч. Храните остатки среды при температуре −80 °C для других анализов. В конце сбора питательных сред собирают энтероиды для экстракции РНК или визуализации, если это необходимо.
    4. Измерьте концентрации декстран-ФИТК с помощью флуоресцентного микропластичного считывателя. Постройте стандартную кривую для каждой пластины, используя последовательные разбавления и установив линию линейной регрессии, как показано на рисунке 4.
    5. Корректировать абсорбцию для удаленного объема культуральной среды, содержащей декстран, которая была заменена свежей питательной средой без декстрана, следующим образом: удаление 200 мкл из 2 мл культуральной среды составляет 10% по объему.
      Скорректированное поглощение через 2 ч = (поглощение при 1 ч х 10%) + измеренное поглощение через 2 ч
      Поглощение первой скорректированной среды не нуждается в коррекции. Затем рассчитайте концентрацию декстрана из скорректированного значения поглощения, используя стандартное уравнение кривой.
    6. Для нормализации разделите концентрацию декстрана на общее количество насосов для каждой чашки Петри, а затем умножьте на наибольшее общее количество насосов на чашку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все экспозиции проводятся в трех экземплярах (три чашки Петри на экспозицию с 3-5 микроинъективами на чашку). Средние значения трипликатов сравниваются между экспозициями с помощью t-теста Студента.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы установили энтероидную клеточную линию из донорской ткани плода подвздошной кишки в соответствии с модифицированными протоколами, предоставленными нашими сотрудниками в Лаборатории моделирования трансляционных тканей Мичиганского университета12. Энтероидная клеточная линия дала отрицательный результат на микоплазменную инфекцию. Энтероиды окрашивались положительно на виллин, CDX2, лизоцим, муцин, клаудин, окклюдин и зонула-окклюден 1 (рисунок 5), подтверждая их эпителиальное происхождение тонкой кишки. Энтероиды были микроинъецированы декстран-FITC 4 кДа при 5 мг/мл в PBS (рисунок 6). Тестовые воздействия представляли собой ЛПС в различных концентрациях, 0,1 мг/мл и 0,5 мг/мл, смешанные с декстран-ФИТЦ для апикального воздействия. В качестве положительного контроля мы использовали 2 мМ EGTA и добавляли его в культуральную среду через 4 ч после микроинъекции декстрана. EGTA является хелатором кальция, который увеличивает проницаемость плотных соединений. Отрицательные контрольные группы были микроинъецированы декстран-ФИТЦ только в PBS. Для базолатерального воздействия замещающая среда для сбора серийных питательных сред имела одинаковую концентрацию экспозиции (т.е. 2 мМ EGTA). Результаты показывают явное увеличение концентрации декстрана в питательных средах после добавления EGTA по сравнению с отрицательным контролем PBS. Апикальное воздействие ЛПС индуцировало более высокую проницаемость декстрана, начиная примерно через 8 ч после воздействия концентрационно-зависимым образом (рисунок 7).

figure-results-1
Рисунок 1: Установка микроинжектора. Установка включает в себя стереомикроскоп, микроманипулятор, установленный на магнитной подставке на тяжелой стальной опорной пластине, держатель микропипетки, соединенный со шприцем с трехсторонним запорным краном, и пневматический насос. Подача воздуха в стену обеспечивает давление воздуха, которое регулируется насосом для создания постоянного объема насоса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Горизонтальный держатель микропипетки. Эта пластиковая платформа предназначена для удержания микропипетки после вытягивания стеклянной капиллярной трубки для резки наконечника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Позиционирование микропипетки. Угол 35°-45° идеально подходит для инъекций энтероидов, расположенных в середине чашки Петри. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Стандартная кривая Декстрана. Кривая построена с флуоресцентным поглощением 10 последовательных разбавлений декстрана в дубликатах. Для создания уравнения регрессии была установлена линия линейной регрессии. Панели ошибок являются SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Флуоресцентные биомаркеры энтероидов. DAPI для окрашивания ядра синий. Показаны следующие биомаркеры: (A) виллин, (B) CDX2, (C) лизоцим, (D) муцин, (E) клаудин, (F) окклюдинг и (G) зонула-окклюден 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6
Рисунок 6: Энтероиды на разных стадиях. (А) Энтероид в возрасте 7-10 дней маленький и с толстой стенкой. (B) Энтероид, готовый к микроинъекции с большим размером, просветом и мысленной стенкой, и (C) флуоресцентный декстран-FITC внутри энтероида через 2 дня после микроинъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-7
Рисунок 7: Проницаемость декстран-ФИТЦ после микроинъекции. (А) Измеренные уровни декстрана в средах были выше после добавления EGTA по сравнению с PBS. (B) Микроинжекция 0,5 мг/мл ЛПС вызывала большую утечку декстрана из энтероидного просвета в среду, чем микроинжекционированная 0,1 мг/мл ЛПС, начиная с 8 ч после инъекции. *p-значение < 0,05, полосы ошибок SEM, n = 3, для расчета значимости использовался t-тест Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол детализирует установление энтероидов из кишечной ткани плода, а также характеристику модели с иммунофлуоресцентным окрашиванием и тестированием проницаемости эпителия. Проницаемость энтероидов проверяли с использованием метода микроинъекции и последовательных измерений с течением времени утечки концентрации декстран-ФИТК в культуральной среде. Новизна этого протокола заключается в апикальном воздействии, которое более близко напоминает физиологию кишечника человека по сравнению с базолатеральным воздействием в культуральной среде7. В предыдущих исследованиях Hill et al. использовали серийную визуализацию и расчет интенсивности флуоресценции во времени16. Ares et al. подвергли ЛПС базолатеральную мембрану эпителиальной модели, а затем сравнили схему экспрессии клеточных генов7. Для сравнения, мы используем апикальное воздействие испытуемых реагентов, а затем исследуем потенциальные изменения валовой проницаемости путем измерения серийных концентраций просочившегося декстрана в питательных средах. Наш метод также позволяет проводить серийный сравнительный анализ цитокинов, продуцируемых эпителиальными клетками в культуральных средах и экспрессии генов путем сбора клеточной мРНК. ЛПС обычно используется для изучения повреждения кишечника на животных и в моделях in vitro из-за его способности индуцировать проницаемость и воспаление 7,17. Когда ЛПС тестировался в этой модели, проницаемость эпителия дифференцировалась по концентрации воздействия. Этот протокол может быть расширен для изучения других патологий заболевания с использованием различных микроинъекционных материалов и измерений результатов.

Критические шаги в этом протоколе включают установление энтероидов из тканей кишечника плода, энтероидную характеристику и технику микроинъекции. Целостность этого исследования зависит от точного отбора проб клеток. Использование анатомических ориентиров и кровеносных сосудов полезно для обеспечения отбора клеток тонкого кишечника. Из-за устойчивого роста и дифференцировки стволовых клеток кишечника плода обширная процедура выделения стволовых клеток из других эпителиальных клеток не требуется. После того, как энтероиды были установлены, важно подтвердить характеристики модели путем окрашивания белков и клеточных маркеров. В этом протоколе энтероиды были окрашены для энтероцитов с использованием виллина и CDX2, клеток Панета с использованием лизоцима и бокаловидных клеток с использованием муцина, все клетки, которые находятся в эпителии тонкой кишки 18,19,20. В отличие от традиционных одиночных клеточных линий, которые отображают один тип клеток, энтероиды устанавливают все типы клеток из стволовых клеток-предшественников кишечника8. Окрашивающая часть этого протокола может быть модифицирована для конкретных клеточных маркеров, представляющих интерес. Решающее значение для надежности этого протокола имеет метод микроинъекции. Консистенцию наконечников микропипетки можно проверить, измерив объем на насос с помощью раствора декстран-ФИТЦ и визуализировав диаметр наконечников под микроскопом. Из-за риска загрязнения одна и та же микропипетка не может использоваться более чем для одного воздействия. Кроме того, на форму и рост энтероидов может влиять содержимое их питательных сред. Мы обнаружили, что сферические, а не цветные энтероиды обеспечивают лучшие модели для микроинъекции. Сферическая форма может быть индуцирована большим коэффициентом Wnt в среде21.

Этот протокол во многом зависит от навыков исполнителя в микроинъекции, чтобы уменьшить вариации, особенно в чувствительных ко времени измерениях. Вариации могут быть сведены к минимуму, имея одного и того же опытного исполнителя с последовательными методами, используя одно и то же происхождение клеток, чтобы избежать генетической изменчивости, тестирование на одном и том же проходе для устранения смещения зрелости и выращивание клеток в одном и том же типе среды для аналогичной дифференцировки клеток. Компоненты питательной среды могут индуцировать различную дифференцировку стволовых клеток in vitro , а не в среде in vivo . Например, in vivo лизоцим не экспрессируется до 22-24 недель гестационного развития, когда клетки Панета формируются и становятся функциональными22. Тем не менее, мы смогли обнаружить лизоцим в наших энтероидах, установленных из 10-недельного кишечника плода. Этот метод может ограничить количество тестируемых воздействий за один раз из-за высоких технических навыков, необходимых для микроинъекции. Утечка декстрана из прокола микроинъекционного отверстия может повлиять на оценку проницаемости. Для устранения этого эффекта сразу после микроинъекции рекомендуется тройные промывания для удаления остатков декстрана из процедуры. Концентрацию декстрана в средах следует измерять ежечасно в течение 4-6 ч после микроинъекции. Эксперименты со значительным повышением концентрации декстрана в течение 2-4 ч после инъекции следует исключить из итогового анализа.

Этот метод имеет ряд преимуществ. Это требует более низкой стоимости и меньших ресурсов по сравнению с монослоями энтероидного происхождения на трансвелле. Кроме того, он может быть расширен на другие воздействия, такие как живые бактерии или вирусы, для изучения первоначального взаимодействия между кишечными микробами и эпителием. Закрытый просвет энтероида может поддерживать стабильный рост микроинжекционных живых бактерий без загрязнения среды роста13. В отличие от монослоя, подвергающегося воздействию питательных сред и инкубационного кислорода, закрытый просвет представляет собой плотное, изолированное пространство. Закрытый просвет не обеспечивает связи со средой роста и содержанием кислорода в просвете, которое со временем ниже при росте живых бактерий13.

Использование кишечной ткани плода более точно изображает кишечный эпителий недоношенных детей по сравнению со взрослыми кишечными стволовыми клетками или животными моделями7. Кроме того, полярность энтероидов позволяет проводить как апикальное, так и базолатеральное воздействие и измерения23. Энтероиды образуют замкнутый просвет с более низкой концентрацией оксигенации, который более точно имитирует концентрацию оксигенации кишечника24. В отличие от более технологически продвинутых протоколов16, использование валовых измерений среды обеспечивает большую доступность этого метода. Эксперимент показал, что утечка эпителия может быть вызвана апикальным воздействием ЛПС и зависит от концентрации. Поскольку этот метод исследует изменения в утечке концентрации декстрана, он полезен для обнаружения грубых функциональных изменений в плотных соединениях. Сбор матричной РНК и секвенирование обнаженных энтероидов и анализ вестерн-блот могут дополнять анализ грубых функциональных изменений. Эта модель изучает целостность кишечного эпителия в системе, которая очень напоминает преждевременную среду и, таким образом, может быть использована для лучшего понимания преждевременных травм кишечника и других патологий заболеваний.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Яна Гласса и сотрудников Исследовательской лаборатории врожденных дефектов Вашингтонского университета за совместное использование тканей плода. Мы также благодарим д-ра Майкла Дэйма и д-ра Джейсона Спенса из Лаборатории моделирования трансляционных тканей Мичиганского университета за их бесконечную поддержку и руководство на протяжении всего процесса.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Амфотерицин 250 мкл/млGibco15-290-026
Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0,5 мл концентрированная мышь, IgG, моноклональныйBiogenexMU392A-5UC
антитело к клаудину 2 (ab53032)abcamab53032
антитело против клаудина 3 (ab15102)abcamab15102
антитело против LYZ, произведенное у кроликаMillipore SigmaHPA066182-100UL
Антитела к муцину 2/MUC2 (F-2): sc-515032Santa Cruzsc-515032
Anti-Villin, клон VIL1/4107R 0,5 мл концентрированный кролик, IgG, моноклональныйBiogenexNUA42-5UC
Бычья сыворотка альбумина (BSA)Millipore SigmaA8806
Клеточные культуральные планшеты, CytoOne 12-луночные необработанные планшеты США Scientific Inc50-754-1395
Планшеты для клеточных культур, CytoOne 6-луночные необработанные планшеты США Scientific Inc50-754-1560
Центрифуга с ведрами для пробирок объемом 15 млEppendorf 05-413-110
CHIR 99021Tocris Bioscience4423
Конфокальный микроскоп Olympus FV1200N/AИли аналогичный микроскоп
Конические центрифужные пробирки, 15 млFalcon05-527-90
Покровное стекло для предметных стекол микроскопаFisher Scientific12-544-DP
Одноразовые скальпелиMopec22-444-272
Дмидино-2-фенилиндол (DAPI) Раствор (1 мг/мл)Fisher Scientific62248
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS, 1X)НаучныйAAJ67802K2
Фишера этиленгликоль-бис(&бета;-аминоэтиловый эфир)-N,N,N,N′,N′-тетрауксусная кислота тетранатриевая соль (EGTA)Millipore SigmaE8145-10G
Флуоресцеин изотиоцианат декстран (Dextran-FITC) 4 кДаМиллипор Sigma46944
Fuorescence микропланшетный ридерAgilent BioTekSynergy HTX
Gentamicin 50 мг/млGibco15-750-060
Стеклянные капиллярные трубки, одноствольные боросиликатные, 1x0,5 мм, 6" (разрезанные пополам перед вытягиванием)A-M systems626500
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Высокоадсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor Plus 594Fisher ScientificA32742
Козье антитело против кролика IgG (H+L) с высокой степенью перекрестной адсорбции, Alexa Fluor Plus 488Fisher ScientificA32731
Сыворотка для козFisher Scientific16210064
программное обеспечение ImageJNIHN/Ahttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
IntestiCult Органоидная среда для роста (человека)Стволовые клетки  Технологии  06010
Липополисахариды из  Escherichia coli  O111: B4Миллипоровый магнитный стенд SigmaL4391-1MG
World Precision Instruments M10
Matrigel Матрица базальной мембраны, без LDEV, 10 млCorning354234  концентрация белка > 9 мг/мл предпочтительно
микрощипцыFisher Scientific13-820-078
МикроножницыFisher Scientific08-953-1B
МикроманипуляторWorld Precision Instruments M3301
Съемник микропипетокWorld Precision Instruments SU-P1000Или аналогичное оборудование
Микроскоп предметные стеклаFisher Scientific22-034486
Окклюдин Поликлональное антителоFisher Scientific  71-1500
Параформальдегид 32% водный растворELECTRON  MICROSCOPY SCIENCESRT 15714
Чашки Петри, 35x10 ммЧашки Петри Fisher Scientific150318
, 60x15 ммFisher Scientific12-565-94
Фосфатный буферный раствор (PBS)Ножной переключатель Fisher Scientific10010031
PicoPumpWorld Precision Instruments3260
Наконечники для пипеток, нефильтрованные, 1000 мклFisher Scientific21-402-47
Наконечники для пипеток, нефильтрованные, 20 мклFisher Scientific21-402-41
Наконечники для пипеток, нефильтрованные, 200 мклFisher Scientific21-236-54
Пневматическая система PicoPump WorldPrecision InstrumentsSYS-PV820или аналогичная система пиконасоса
Primocin 50 мг/мл, флакон 10x1 млInvivoGenant-pm-1
Стальная опорная плитаWorld Precision Instruments5052
СтереомикроскопZeiss stemi 350Или аналогичный микроскоп
ThermoSafe PolarPack Пенопластовые брикетыSonoco03-531-53
Triton X-100Millipore SigmaT8787
Настенный источник воздухаН/Д Н/Д
Y-27632 дигидрохлоридTocris Bioscience1254
ZO-1 Поликлональное антителоFisher Scientific61-7300

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Humberg, A., et al. Preterm birth and sustained inflammation: Consequences for the neonate. Seminars in Immunopathology. 42 (4), 451-468 (2020).
  2. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  3. Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes & Development. 17 (14), 1709-1713 (2003).
  4. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  5. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  6. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), e52483(2015).
  7. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194(2019).
  8. Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
  9. Finkbeiner, S. R., et al. Transcriptome-wide analysis reveals hallmarks of human intestine development and maturation in vitro and in vivo. Stem Cell Reports. 4 (6), 1140-1155 (2015).
  10. Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  11. Alganabi, M., Lee, C., Bindi, E., Li, B., Pierro, A. Recent advances in understanding necrotizing enterocolitis. F1000 Research. 8, (2019).
  12. Dame, M. K., et al. Human colonic crypts in culture: Segregation of immunochemical markers in normal versus adenoma-derived. Laboratory Investigation. 94 (2), 222-234 (2014).
  13. Hill, D. R., et al. Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium. eLife. 6, 29132(2017).
  14. Tsai, Y. H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
  15. Su, K., Asbrock, N., Chu, V., Hoffmann, S., Hewitt, P. In Vitro Differentiation of Human iPS Cells Into Colon Organoids in Serum-Free Cell Culture Conditions. Technology Networks. , https://www.technologynetworks.com/cell-science/white-papers/in-vitro-differentiation-of-human-ips-cells-into-colon-organoids-in-serum-free-cell-culture-328450 (2019).
  16. Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960(2017).
  17. Schoultz, I., Keita, A. V. The Intestinal Barrier and Current Techniques for the Assessment of Gut Permeability. Cells. 9 (8), 1909(2020).
  18. Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).
  19. Walker, R. W., Clemente, J. C., Peter, I., Loos, R. J. F. The prenatal gut microbiome: Are we colonized with bacteria in utero. Pediatric Obesity. 12, Suppl 1 3-17 (2017).
  20. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  21. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372(2020).
  22. Lueschow, S. R., McElroy, S. J. The Paneth cell: The curator and defender of the immature small intestine. Frontiers in Immunology. 11, 587(2020).
  23. In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (146), e59357(2019).
  24. Dheer, R., Young, V. B. Stem-cell-derived models: Tools for studying role of microbiota in intestinal homeostasis and disease. Current Opinion in Gastroenterology. 37 (1), 15-22 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

LPS

Похожие статьи