Позитронно-эмиссионная томография клеточного транспорта: метод радиомечения клеток

Краткое содержание

Здесь представлен протокол радиоактивного мечения клеток радиоизотопом позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) 89 Zr (t_1/2 78,4 ч) с использованием готового к использованию синтона радиомечения, [89 Zr]Zr-p-изотиоцианатобензил-десферриоксамин ([⁸⁹Zr]Zr-DBN). Радиоактивное мечение клеток с помощью [⁸⁹Zr]Zr-DBN позволяет неинвазивно отслеживать и визуализировать введенные радиоактивно меченные клетки в организме с помощью ПЭТ в течение 7 дней после введения.

Аннотация

Т-клеточная терапия стволовыми клетками и химерными антигенными рецепторами (CAR) становится перспективной терапией для регенерации органов и иммунотерапии различных видов рака. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в этих областях, еще многое предстоит узнать, чтобы лучше понять фармакокинетику и фармакодинамику вводимых терапевтических клеток в живой системе. Для неинвазивного отслеживания клеток in vivo с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) был разработан новый [89 Zr]Zr-p-изотиоцианатобензил-десферриоксамин ([89 Zr]Zr-DBN)-опосредованный метод радиомечения клеток с использованием ⁸⁹Zr (t_1/2 78,4 ч). В настоящем протоколе описан [⁸⁹Zr]Zr-DBN-опосредованный, готовый к использованию, радиомечущий синтон для прямого радиоактивного мечения различных клеток, включая мезенхимальные стволовые клетки, кардиопоэтические стволовые клетки, управляемые линией, регенерирующие гепатоциты печени, лейкоциты, клетки меланомы и дендритные клетки. Разработанная методика позволяет проводить неинвазивную ПЭТ-визуализацию клеточного транспорта в течение 7 дней после введения, не влияя на природу или функцию радиоактивно меченных клеток. Кроме того, в этом протоколе описывается поэтапный метод радиосинтеза [89 Zr]Zr-DBN, биосовместимая формулировка [89 Zr]Zr-DBN, подготовка клеток к радиоактивному мечению и, наконец, радиомечение клеток с помощью [⁸⁹Zr]Zr-DBN, включая все сложные детали, необходимые для успешного радиомечения клеток.

Введение

Т-клеточная терапия стволовыми клетками и химерными антигенными рецепторами (CAR) набирает популярность и активно исследуется для лечения различных заболеваний, таких как недостаточность миокарда^1,2, дегенерация сетчатки 2^, дегенерация желтого пятна 2, диабет ², инфаркт миокарда 3,4,5 и рак ^6,7,8,9,10. Среди двух вероятных подходов терапии стволовыми клетками стволовые клетки могут быть либо непосредственно приживлены к очагу заболевания, чтобы вызвать терапевтический ответ, либо вызвать изменения в микроокружении очага заболевания без прилипания к очагу заболевания, чтобы инициировать непрямой терапевтический ответ. Непрямой терапевтический ответ может вызвать изменения в микроокружении очага заболевания путем высвобождения факторов, которые могут восстанавливать или лечить заболевание⁵. Эти подходы к лечению стволовыми клетками могут быть оценены с помощью неинвазивной визуализации радиомеченных стволовых клеток. Неинвазивная визуализация может соотнести поглощение радиоактивно меченных клеток в очаге заболевания с терапевтическим ответом, чтобы расшифровать прямой и непрямой терапевтический ответ.

Кроме того, для лечения различных видов рака разрабатывается терапия на основе иммунных клеток с использованием CAR-T-клеток 6,7,8,9,10 и иммунотерапии дендритными клетками ^11,12. Механистически при CAR-Т-клеточной иммунотерапии 6,7,8,9,10 Т-клетки сконструированы таким образом, чтобы экспрессировать эпитоп, который связывается со специфическим антигеном на опухолях^, которые необходимо лечить. Эти сконструированные CAR-Т-клетки при введении связываются со специфическим антигеном, присутствующим в опухолевых клетках, посредством взаимодействия эпитоп-антиген. После связывания связанные CAR-Т-клетки подвергаются активации, а затем пролиферируют и высвобождают цитокины, которые сигнализируют иммунной системе хозяина атаковать опухоль, экспрессирующую специфический антиген. В отличие от этого, в случае терапии дендритными клетками^11,12 дендритные клетки сконструированы таким образом^, чтобы представлять на своей поверхности специфический раковый антиген. Эти сконструированные дендритные клетки при введении оседают в лимфатических узлах и связываются с Т-клетками в лимфатических узлах. Т-клетки, связываясь со специфическими раковыми антигенами на введенных дендритных клетках, подвергаются активации/пролиферации и инициируют иммунный ответ хозяина против опухоли, экспрессирующей этот специфический антиген. Таким образом, оценка транспорта введенных CAR-Т-клеток к опухолевому очагу^9,10 и хоминг дендритных клеток к лимфатическим узлам^11,12 возможна с помощью визуализации радиоактивно меченных CAR T-клеток и дендритных клеток для определения эффективности иммунотерапии. Кроме того, неинвазивный транспорт клеток может помочь лучше понять терапевтический потенциал, прояснить прямой и непрямой терапевтический ответ, а также прогнозировать и контролировать терапевтический ответ как на терапию стволовыми клетками, так и на основе иммунных клеток.

Были изучены различные методы визуализации для транспортировки клеток 3,4,9,10,12, включая оптическую визуализацию^, магнитно-резонансную томографию (МРТ), однофотонную эмиссионную компьютерную томографию (ОФЭКТ) и позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ). Каждая из этих методик имеет свои преимущества и недостатки. Среди них ПЭТ является наиболее перспективным методом благодаря своей количественной природе и высокой чувствительности, которые необходимы для надежного количественного определения клеток при транспортировке клеток на основе визуализации 3,4,9,10.

Позитронно-излучающий радиоизотоп ⁸⁹Zr с периодом полураспада 78,4 ч пригоден для мечения клеток. Он позволяет проводить ПЭТ-визуализацию клеток в течение более 1 недели и легко производится с помощью широко доступных низкоэнергетических медицинских циклотронов 13,14,15,16,17. Кроме того, коммерчески доступен соответствующим образом функционализированный хелатор-изотиоцианатобензилдесфериоксамина (DFO-Bn-NCS) для синтеза 89-Zr-меченного, готового к использованию синтона, мечущего клетки, [89 Zr]Zr-p-изотиоцианатобензил-деферриоксамин, также известного как [⁸⁹Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24 ^,25. Принцип [89 Zr]Zr-DBN-опосредованного мечения клеток основан на реакции между первичными аминами белков клеточной мембраны и изотиоцианатным (NCS) фрагментом [⁸⁹Zr]Zr-DBN с образованием стабильной ковалентной тиомочевинной связи.

[⁸⁹зр] Для отслеживания различных клеток, включая стволовые клетки 18,23,25, дендритные клетки¹⁸, кардиопоэтические стволовые клетки¹⁹, децидуальные стромальные клетки 20, макрофаги костного мозга 20, мононуклеарные клетки периферической крови 20, Т-клетки^21, гепатоциты^22,24 и лейкоциты ²⁵. В следующем протоколе представлены пошаговые методы подготовки и радиоактивного мечения клеток с помощью [⁸⁹Zr]Zr-DBN и описаны изменения, которые могут потребоваться в протоколе радиомечения для конкретного типа клеток. Для большей наглядности представленный здесь метод радиомечения клеток разделен на четыре раздела. Первый раздел посвящен получению [89 Zr]Zr-DBN путем хелатирования ⁸⁹Zr с DFO-Bn-NCS. Во втором разделе описывается приготовление биосовместимой формулы [⁸⁹Zr]Zr-DBN, которая может быть легко использована для мечения клеток радиотерапией. В третьем разделе описываются этапы, необходимые для предварительной подготовки клеток к радиоактивному мечению. Предварительное кондиционирование клеток включает в себя промывание клеток безбелковым фосфатно-солевым буфером (PBS) и сбалансированным солевым раствором HEPES (H-HBSS) для удаления внешних белков, которые могут мешать или конкурировать с реакцией [⁸⁹Zr]Zr-DBN с первичными аминами, присутствующими на белках клеточной поверхности во время радиоактивного мечения. В заключительном разделе описаны этапы, связанные с фактическим радиоактивным мечением клеток и анализом контроля качества.

Протокол

Дендритные клетки и клетки меланомы были получены коммерчески¹⁸. Гепатоциты выделяли из печени свиней после лапароскопической частичной гепатэктомии^22,24. Стволовые клетки выделяли из аспиратов костного мозга^18,19,26. Стволовые клетки, полученные из жировой ткани, были получены из Лаборатории клеточной терапии человека, клиника Майо, Рочестер²³. Лейкоциты человека были выделены из собранной крови, полученной из отделения трансфузионной медицины, клиники Майо Рочестер²⁵. Различные клетки, используемые для радиоактивного мечения, были получены и использованы в соответствии с рекомендациями, рекомендованными Комитетом по уходу за животными и их использованием, Подкомитетом по надзору за исследованиями стволовых клеток клиники Майо, Комитетом по исследованиям в области трансфузионной медицины, Институциональным комитетом по биобезопасности и Комитетом по радиационной безопасности.

1. Получение [ 89 Zr ]Zr-p-изотиоцианатобензилдесферриоксамин ([ ⁸⁹Zr ]Zr-DBN)

Хронометраж: ~160-220 мин
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения [89 Zr]Zr-DBN изолируйте 89 Zr в форме [89 Zr]Zr-гидрофосфата ([89 Zr]Zr(HPO 4)₂) или [89 Zr]Zr-хлорида ([⁸⁹Zr]ZrCl₄), как указано на этапе 1.1.

1. Изолируют 89 Zr от родительского ⁸⁹Y, используя установленный метод очистки на основе гидроксаматной смолы^13,17. Вкратце, сначала приготовьте колонку с ~100 мг гидроксаматной смолы, затем активируйте гидроксаматную смолу, промыв колонку 8,0 мл чистого безводного ацетонитрила, а затем промыв 5,0-6,0 мл воздуха. Затем промывают колонку 15 мл деионизированной воды, после чего проводят еще одну промывку 5,0-6,0 мл воздуха, а затем 2,0 мл 0,50 N HCl (следы металлов на основе) с последующей дополнительной промывкой 5,0-6,0 мл воздуха. Затем медленно загружают раствор, содержащий ⁸⁹Zr и 89 Y, в гидроксаматную смолу и промывают несвязанный ⁸⁹Y от гидроксаматной смолы 20 мл 2,0 N HCl, затем 10 мл деионизированной воды и промывают 5,0-6,0 мл воздуха.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После промывки воздухом элюирование ⁸⁹Zr можно выполнить, как показано ниже.
   1. Для элюирования 89 Zr в форме [89 Zr]Zr(HPO 4)2 сначала добавьте 0,50 мл буфера 1,2 M K 2 HPO 4/KH 2 PO 4 (pH 3,5) в колонку изшага 1.1 и дайте ей постоять на колонке в течение 30 мин, чтобы способствовать высвобождению 89 Zr в виде [⁸⁹Zr]Zr(HPO ₄)₂ из смолы. Затем элюируют ⁸⁹Zr из колонки с дополнительными 1,50 мл буфера 1,2 M K 2 HPO 4/KH₂PO₄ (pH 3,5). После элюирования [89 Zr]Zr(HPO 4)2 выполните шаги 1.2, 1.2.1 и 1.2.2 для получения [89 Zr]Zr-DBN с использованием [⁸⁹Zr]Zr(HPO₄)₂, как показано на рисунке 1.
   2. Для получения 89 Zr в виде [89 Zr]ZrCl₄ сначала элюируют 89 Zr в виде [⁸⁹Zr]Zr-оксалата.
      1. Для элюирования 89 Zr в форме [89 Zr]Zr-оксалата добавьте 0,50 мл 1,0 M щавелевой кислоты в колонку из шага 1.1 и дайте ей постоять на колонке в течение 1 мин, чтобы способствовать высвобождению 89 Zr в виде [⁸⁹Zr]-оксалата из смолы. Затем элюируют ⁸⁹Zr из колонки с дополнительными 2,50 мл 1,0 М щавелевой кислоты (всего 3,0 мл)¹⁷.
      2. Для превращения [89 Zr]Zr-оксалата в [⁸⁹Zr]ZrCl₄ с помощью анионообменной колонки, как описано Larenkov et ^al.14, сначала активируют колонку промывкой 6,0 мл ацетонитрила, а затем промывают 5,0-6,0 мл воздуха. Затем промойте колонку 10,0 мл физиологического раствора, после чего еще раз промойте 5,0-6,0 мл воздуха. Наконец, пропустите 10,0 мл деионизированной воды, а затем промойте 5,0-6,0 мл воздуха.
      3. Медленно загружают 3,0 мл раствора, содержащего [⁸⁹Zr]Zr-оксалат, на активированную анионообменную колонку, после чего продувают 5,0-6,0 мл воздуха. Затем промывают колонку, загруженную ⁸⁹Zr, 50,0 мл деионизированной воды для удаления несвязанного оксалат-иона, после чего промывают 5,0-6,0 мл воздуха.
      4. Для элюирования 89 Zr в форме [89 Zr]ZrCl 4 добавьте 0,10 мл 1,0 N HCl в колонку, дайте ей постоять на колонке в течение 1,0 мин, чтобы способствовать высвобождению 89 Zr в виде [89 Zr]ZrCl₄ из смолы, и элюируйте ⁸⁹Zr из колонки с дополнительными 0,40 мл 1,0 N HCl (всего 0,5 мл). Элюированный [⁸⁹Zr]ZrCl₄ высушить в V-образном флаконе, поместив его в нагревательный блок при 65 °C под постоянным потоком газообразного азота в течение 10-30 мин. После высыхания восстановите высушенный [89 Zr]ZrCl 4 в воде и выполните шаги 1.3 и 1.3.1 для приготовления [89 Zr]Zr-DBN с использованием [⁸⁹Zr]ZrCl₄, как показано на рисунке 1.
2. Возьмите ~120 мкл [⁸⁹Zr]Zr(HPO 4)2, разработанного в 1,2 M K 2 HPO 4/KH 2 PO ₄ (pH 3,5) (10-25 MBq) из стадии 1.1.1, и нейтрализуйте раствор для достижения pH 7,5-8,0 с ~100 мкл 1,0 M HEPES-KOH (pH 7,5) и ~65 мкл 1,0 M K₂CO₃.
   1. Для получения соответствующего количества DFO-Bn-NCS для стадий 1.2.2 или 1.3.1 для различных рецептур 89 Zr с различной кажущейся удельной активностью 89 Zr проводят набор хелатных реакций с использованием фиксированного объема нейтрализованной рецептуры [89 Zr]Zr(HPO 4)₂ или [⁸⁹Zr]ZrCl₄ с диапазоном DFO-Bn-NCS (7,5-15 мкг). В случае [⁸⁹Zr]Zr(HPO₄)₂ инкубируют реакцию хелатирования при 37 °C в шейкере при ~550 об/мин в течение 60 мин. Принимая во внимание, что в случае [⁸⁹Zr]ZrCl₄ реакцию хелатирования инкубируют при 25 °C в шейкере при ~550 об/мин в течение 30 мин. Откажитесь от хелатной реакции, которая выпадает в осадок во время или в конце инкубации. В конце инкубации проводят радиоактивную тонкослойную хроматографию (rad-TLC) с 100 мМ диэтилентриамина пентаацетатом (ДТПА), рН 7,0, в качестве подвижной фазы, чтобы оценить эффективность хелатирования DFO-Bn-NCS для каждой хелатной реакции, как описано ниже на шаге 1.5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исходя из эффективности хелатирования, используйте минимальное количество DFO-Bn-NCS на этапах 1.2.2 или 1.3.1, необходимое для достижения эффективности хелатирования ≥97%, не вызывая осаждения DFO-Bn-NCS в нейтрализованном составе [89 Zr]Zr(HPO 4)₂ или [⁸⁹Zr]ZrCl₄. При этом синтезирован [⁸⁹Zr]Zr-DBN с радиохимической чистотой ≥97%.
   2. Приготовьте свежий 5,0 мМ DFO-Bn-NCS в безводном ДМСО (3,76 мг/мл) и добавьте 4,0 мкл 5,0 мМ DFO-Bn-NCS (20 нмоль или 15 мкг) к ~285 мкл нейтрализованного [⁸⁹Zr]Zr(HPO₄)2 (10-25 MBq) из стадии _1.2 и перемешайте раствор путем пипетирования. Конечную концентрацию ДМСО в хелатной смеси следует держать ниже 2% от общего объема.
3. Возьмите ~180 мкл [⁸⁹Zr]ZrCl 4, разработанного в 0,1 N HCl (40-80 MBq) из стадии 1.1.2.4, и нейтрализуйте полученный раствор для достижения pH 7,5-8,0 с ~25 мкл 1,0 M Na₂CO₃.
   1. Приготовьте свежий 2,5 мМ DFO-Bn-NCS в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО) (1,88 мг/мл) и добавьте 4,0 мкл 2,5 мМ DFO-Bn-NCS (10 нмоль или 7,5 мкг) к ~205 мкл нейтрализованного [89 Zr]ZrCl₄ (40-80 MBq) из этапа 1.3. Перемешайте раствор пипетированием. Конечную концентрацию ДМСО в хелатной смеси следует держать ниже 2% от общего объема.
4. Продолжайте хелатирование 89 Zr при 37 °C в шейкере при ~550 об/мин в течение 60 мин в случае [89 Zr]Zr(HPO 4)₂ или при 25 °C в шейкере при ~550 об/мин в течение 30 мин в случае [⁸⁹Zr]ZrCl₄.
5. Определяют эффективность хелатирования ⁸⁹Zr с помощью rad-TLC с DTPA 100 мМ (pH 7,0) в качестве мобильного растворителя rad-TLC. Ожидается, что [89 Zr]Zr-DBN покажет R f ~0,021-0,035, [89 Zr]ZrCl 4 покажет R f ~1,0, а [⁸⁹Zr]Zr(HPO₄)₂ покажет R _f ~1,0. Рассчитайте эффективность хелатирования (%) по уравнению (1):
   Процентное содержание 89 Zr, хелатированного к DFO-NCS с образованием [89 Zr]Zr-DBN = [ (Радиоактивность при R f [89 Zr]Zr - DBN) / (Сумма радиоактивностей при R f [89 Zr]Zr - DBN и при R   _f [89 Zr]Zr(HPO 4)₂ или [⁸⁹Zr]ZrCl₄) ] × 100 (1)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приемлемая эффективность хелатирования ⁸⁹Zr для продолжения радиоактивного мечения клеток, определяемая с помощью rad-TLC, составляет ≥97%. Рекомендуемая радиохимическая чистота [⁸⁹Zr]Zr-DBN ≥97% была установлена в соответствии со стандартными требованиями к радиохимической чистоте для других радиофармацевтических препаратов, используемых в полевых условиях. Репрезентативный rad-TLC см. на дополнительном рисунке S1 и дополнительном рисунке S2.

Рисунок 1: Схема получения [⁸⁹Zr]Zr-DBN. Для получения [89 Zr]Zr-DBN нейтрализуют предварительно приготовленный [89 Zr]Zr(HPO 4)₂ или [⁸⁹Zr]ZrCl₄ до рН 7,5-8,0. Инкубируют нейтрализованный раствор с ДФО-Бн-НКС. Проверьте эффективность хелатирования ⁸⁹Zr к DFO-Bn-NCS с помощью rad-TLC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

2. Биосовместимая формула [ ⁸⁹Zr ]Zr-DBN для клеточного радиомечения (рис. 2)

Хронометраж: ~35 мин
ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая время, необходимое для подготовки клеток на этапе 3, начните шаг 3 примерно за 20 минут до начала шага 2 для инкубации ~30 минут. Это позволяет начать радиомечение клеток на шаге 4 в течение ~5-10 минут после завершения шагов 2-3.2.2.

1. Для состава [89 Zr]Zr-DBN, изготовленного из [89 Zr]ZrCl 4, добавьте 50,0 мкл совместимой с клеткой смеси, содержащей ~27,0 мкл 1,2 М К 2 HPO 4/KH₂PO ₄ (рН 3,5) + ~23,0 мкл 1,0 м буфера HEPES-KOH (PH 7,5) к 50,0 мкл [89 Zr]Zr-DBN. Инкубируйте смесь, совместимую с клетками [⁸⁹Zr]Zr-DBN, в течение ~30 мин при комнатной температуре (25 °C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Препарат [89 Zr]Zr-DBN, изготовленный из [⁸⁹Zr]Zr(HPO₄)2, является биосовместимым для радиомечения клеток и не требует шага ₂.

Рисунок 2: Приготовление биосовместимой формулы [⁸⁹Zr]Zr-DBN для мечения клеточной радиометки. Для приготовления готовой к использованию биосовместимой формулы радиомеченого _{синтона} добавьте равный объем совместимой с клеткой смеси, содержащей 1,2 М К 2 ГПО 4/КХ₂РО₄ (рН 3,5) + 1,0 М ГЕПЕС-КОУ до равного объема [⁸⁹Zr]Zr-DBN. Инкубировать при 25 °C ~30 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

3. Подготовка клеток к радиоактивному мечению

Хронометраж: ~40-50 мин

1. Трипсинизировать ~12 × 10⁶ адгезивных клеток (стволовые клетки, клетки рака меланомы, кардиопоэтические стволовые клетки, дендритные клетки или гепатоциты) и центрифугировать клетки в конической центрифужной пробирке объемом 15,0 мл при ~96 × g в течение 10 мин при 4 °C.
   1. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клеточную гранулу в ~500 мкл PBS и перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Центрифугируют клетки в микроцентрифуге при температуре ~96 × g в течение 10 мин при 4 °C.
   2. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в ~500 мкл H-HBSS. Центрифугируют клетки в микроцентрифуге объемом 1,5 мл при температуре ~96 × г в течение 10 мин при 4 °C. Повторите шаг 3.1.2 еще раз и перейдите к шагу 4.1.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: H-HBSS - это сбалансированный раствор соли Хэнкса с 0,01 М HEPES (pH 8,0).
2. В случае неадгезивных клеток, таких как лейкоциты человека (свежевыделенные лейкоциты человека из крови), пропускают трипсинизацию и центрифугируют клеточную суспензию, содержащую ~12 × 10⁶ клеток, в микроцентрифуге объемом 1,5 мл при ~96 × г в течение 10 мин при 4 °C.
   1. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клеточную гранулу в ~500 мкл PBS и центрифугируйте клетки в микроцентрифуге объемом 1,5 мл при ~96 × g в течение 10 мин при 4 °C.
   2. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в ~500 мкл H-HBSS. Центрифугируют клетки в микроцентрифуге объемом 1,5 мл при температуре ~96 × г в течение 10 мин при 4 °C. Повторите шаг 3.2.2 еще раз и перейдите к шагу 4.1.1.

4. Радиомечение клеток

Хронометраж: ~125-155 мин

1. Начало радиоактивного мечения клеток (рис. 3)
   1. Используйте клеточную суспензию из этапа 3.1.2 или этапа 3.2.2 для приготовления клеточной суспензии ~500 мкл примерно с ~6 × 10⁶ клеток в ~500 мкл H-HBSS при pH 7,5-8,0 в пробирке микроцентрифуги объемом 1,5 мл.
   2. К этому добавьте ~100 мкл биосовместимого [⁸⁹Zr]Zr-DBN из шага 2.
2. Клеточная инкубация для радиоактивного мечения (рис. 4)
   1. Смешайте биосовместимую формулу [89 Zr]Zr-DBN и клеточную суспензию, осторожно пипетируя вверх и вниз с помощью микропипетки, установленной на ~500 мкл. Измерьте количество радиоактивности в инкубационной пробирке с помощью калибратора дозы радиоактивности при настройке 489 для ^{изотопа 89}Zr¹⁶.
   2. Инкубируют клетки и смесь [⁸⁹Zr]Zr-DBN в шейкере при ~550 об/мин при 25-37 °C в течение 30-45 мин для мечения клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Температура инкубации будет варьироваться в зависимости от типа клеток, используемых для радиоактивного мечения, как показано в таблице 1.
   3. После инкубации на стадии 4.2.2 проводят рад-ТСХ на клеточной реакции радиоактивного мечения с использованием свежеприготовленного растворителя рад-ТСХ (20 мМ цитрата натрия [рН 4,9-5,1]:метанол [1:1, V:V]). После прогона rad-TLC ищите [89 Zr]Zr-DBN и [89 Zr]ZrCl₄ вокруг R _f = ~0,73-0,81 и R_f = ~0,01-0,02 для радиоактивно меченных клеток. Рассчитайте процент радиоактивности при R_f = ~0,01-0,02 по уравнению (2).
      Процент радиоактивности при R f = ~0,01-0,02 = [ (Радиоактивность при R f= ~0,01 - 0,02) / (Сумма радиоактивностей при R _f = ~0,01 - 0,02 и R _f= ~0,73 - 0,81) ] × 100 (2)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы понять пики, визуализированные при R _f = ~0,01-0,02 и R_f = ~0,73-0,81, см. rad-TLC для реакции радиоактивного мечения лейкоцитов на дополнительном рисунке S3.
   4. В отдельной пробирке для микроцентрифуги объемом 1,5 мл смешайте ~100 мкл биосовместимого [⁸⁹Zr]Zr-DBN с ~500 мкл H-HBSS при pH 7,5-8,0 для использования в качестве бесклеточного контроля для коррекции фона на этапе 4.2.5. После инкубации при температуре и времени, аналогичных тем, которые использовались на этапе 4.2.2, проводят рад-ТСХ. После прогона rad-TLC ищите [89 Zr]Zr-DBN и [89 Zr]ZrCl₄ в районе R_f = ~0,73-0,81. Рассчитайте процент радиоактивности при R_f = ~0,01-0,02 по уравнению (3).
      Радиоактивность при R _f = ~0,01-0,02 = [ (Радиоактивность при R f= ~0,01 - 0,02) / (Сумма радиоактивностей при R f= ~0,01 - 0,02 и R _f= ~0,73 - 0,81) ] × 100 (3)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы понять пики, визуализируемые при R_f = ~0,01-0,02 и ~0,73-0,81, см. rad-TLC реакции бесклеточного контроля на дополнительном рисунке S4.
   5. Рассчитайте эффективное радиоактивное мечение клеток (%) путем вычитания процента радиоактивности при R f = ~0,01-0,02 (из rad-TLC из шага 4.2.4) из процента радиоактивности при R _f = ~0,01-0,02 (из rad-TLC из шага 4.2.3).
3. Тушение радиоактивного мечения и промывка ячеек (рис. 5)
   1. После подтверждения завершения радиоактивного мечения с помощью rad-TLC на этапе 4.2.5 проводят гашение реакции радиоактивного мечения путем добавления ~600 мкл охлажденной, соответствующей клетке полной среды или путем добавления H-HBSS, как показано в таблице 1.
   2. Центрифугируют клетки в микроцентрифуге при температуре ~96 × g в течение 10 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
   3. Осторожно ресуспендируйте гранулированные клетки в ~500 мкл охлажденной среды (модифицированная орлиная среда (DMEM) Дульбекко + 10% фетальной бычьей сыворотки + 5% пенициллин/стрептомицин или Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) + 10% фетальной бычьей сыворотки + 5% пенициллина/стрептомицина или H-HBSS для конкретного типа клеток, как показано в таблице 1. Выполните ресуспендирование клеточной гранулы, осторожно пипетируя вверх и вниз с помощью микропипетки, установленной на ~500 мкл.
   4. Центрифугируют клетки в микроцентрифуге при температуре ~96 × g в течение 10 мин при 4 °C.
   5. Повторите шаги 4.3.2-4.3.4 дважды, чтобы смыть несвязанную радиоактивность.
   6. Переложите гранулу в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с DMEM + 10% фетальной бычьей сыворотки + 5% пенициллина/стрептомицина в случае стволовых клеток или H-HBSS и измерьте радиоактивность в клеточной грануле с помощью калибратора дозы при настройке 489 для ⁸⁹Zr-изотопа¹⁶.
   7. Рассчитайте окончательную эффективность радиомечения после всех промывок, используя уравнение (4).
      Эффективность радиоактивного мечения = [(Радиоактивность в гранулах с поправкой на распад на этапе 4.3.6) / (Радиоактивность с поправкой на распад в гранулах и H-HBSS на этапе 4.2.1) ] × 100 (4)
   8. Чтобы убедиться в качестве радиоактивно меченных клеток, сначала визуально осмотрите окончательную суспензию радиоактивно меченных клеток на наличие каких-либо скоплений. Если комков нет, переходите от этой окончательной подвески к следующему шагу. Если есть комки, но их можно повторно суспендировать пипеткой или легким встряхиванием, сделайте это и переходите к следующему этапу, так как он пройдет визуальный осмотр. Однако, если комки не были ресуспендированы ни пипетированием, ни легким встряхиванием, выбросьте суспензию и начните сначала.
   9. Если визуальный осмотр пройден, проводят тест на эксклюзионную жизнеспособность трипанового синего с использованием 0,4% раствора трипанового синего, приготовленного в PBS, в течение 1 ч после радиоактивного мечения и этапов промывки (4.3.3-4.3.7) для оценки жизнеспособности радиоактивно меченных клеток.
      1. Для проведения теста добавляют 10,0 мкл 0,4% раствора трипанового синего к 10,0 мкл клеточной суспензии как радиоактивно меченных, так и немеченых клеток и перемешивают их путем пипетирования суспензии трипановых синих клеток вверх и вниз с помощью микропипетки, установленной на 10,0 мкл.
      2. Загрузите в гемацитометр ~10,0 мкл трипановой суспензионной суспензии синих клеток, сразу подсчитают количество окрашенных синим цветом клеток и общее количество клеток в гемацитометре под микроскопом при малом увеличении или с помощью автоматизированного счетчика клеток. Рассчитайте процент жизнеспособных клеток, используя уравнение (5).
         Процент жизнеспособных клеток = 100 - [(Количество клеток, окрашенных синим цветом) / (Общее количество клеток)] × 100 (5)
   10. Используйте радиоактивно меченные клетки, если процентное соотношение жизнеспособных клеток в радиоактивно меченной клеточной суспензии не изменилось по сравнению с немеченым аналогом. Отбракуйте радиоактивно меченные клетки, если процент жизнеспособных клеток меньше, чем у немеченых аналогов.

Рисунок 3: Схема инициирования радиоактивного мечения клеток. Инициируйте радиоактивное мечение клеток путем добавления биосовместимого [⁸⁹Zr]Zr-DBN к клеточной суспензии, приготовленной в сбалансированном растворе соли HEPES с буфером Хэнкса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Схема клеточной инкубации для радиомечения. Тщательно перемешайте биосовместимую формулу [⁸⁹Zr]Zr-DBN с клеточной суспензией и инкубируйте клеточную суспензию в нагревательном блоке с регулируемой температурой на шейкере в течение 30-60 минут. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Схема тушения радиоактивного мечения и промывки клеток. Погасить радиоактивное мечение клеток путем добавления охлажденной клеточной среды или H-HBSS с последующим центрифугированием при 4 °C. Для промывки клеток выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в ~500 мкл охлажденной клеточной среды или H-HBSS. Повторите цикл выброса надосадочной жидкости и повторного суспендирования клеточной гранулы в свежей среде, чтобы удалить несвязанный синтон, мечущий радио. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

Репрезентативные результаты, представленные в этой рукописи, были собраны из предыдущих исследований [⁸⁹Zr]Zr-DBN по синтезу и радиоактивному мечению клеток 18,19,22,23,24,25. Короче говоря, ⁸⁹Zr может быть успешно комплексирован с DFO-Bn-NCS за ~30-60 мин при 25-37 °C с использованием 7,5-15 мкг DFO-Bn-...

Обсуждение

Ниже приведены важнейшие этапы протокола, которые необходимо оптимизировать для эффективного клеточного радиомечения. На этапах протокола 1.2 и 1.3, в зависимости от используемого объема [89 Zr]Zr(HPO 4)₂ или [⁸⁹Zr]ZrCl₄, необходимо использовать соответствующий объем (микролитра) основания; Для нейтрализации [89 Zr]Zr(HPO 4)2 необходимо использовать 1,0 М раствор K 2 CO₃ и 1,0 M Na ₂ CO₃ для нейтрализации [^8...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ацетонитрил	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, США	A996-4
Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, США	12571063
Анионная обменная колонка	Macherey-Nagel, Inc., Dü ren, Германия	731876	Chromafix 30-PS-HCO3  SPE картридж 45 мг
Конические центрифужные пробирки (15 мл)	Corning Inc., Глендейл, Аризона, США 352096		Falcon 15 мл Высокопрозрачные полипропиленовые (ПП) конические центрифужные пробирки
Дендритные клетки	Американская коллекция типовых культур, Манассас, Вирджиния, США	CRL-11904
DFO-Bn-NCS	Macrocyclics, Inc., Плано, Техас, США	B-705	p-SCN-Bn-Дефероксамин
ДМСО	Sigma-Aldrich, Inc., Сент-Луис, Миссури	276855
Калибратор дозы	Mirion Technologies (Capintec), Inc., Флорхэм Парк, Нью-Джерси, США	5130-3234	CRC -55tR Калибратор дозы
Дульбекко s модифицированный Eagle' s medium	Американская коллекция типовых культур, Манассас, Вирджиния, США	30-2002
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)	Американская коллекция типовых культур, Манассас, Вирджиния, США	30-2020
Сбалансированный раствор соли Хэнкса (HBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Уолтем, Массачусетс, США	14025092	H-HBSS
(марка на основе микропримесей металлов)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Уолтем, Массачусетс, США	A508P212
Клетки меланомы	Американская коллекция типовых культур, Манассас, Вирджиния, США	CRL-6475
Метанол	Sigma-Aldrich, Inc., Сент-Луис, Миссури	34860
Микроцентрифужная трубка	Eppendorf, Гамбург, Германия	30108442	микроцентрифужная трубка Protein LoBind
Murine GM-CSF	R& D Systems, Inc., Миннеаполис, Миннесота США	415-ML-010
Пенициллин/стрептомицин	Thermo Fisher Scientific, Inc., Уолтем, Массачусетс, США	15140-122
Фосфатный буферный физиологический раствор без Ca2+ и Mg2+	Thermo Fisher Scientific, Inc., Уолтем, Массачусетс, США 10010023		Для промывки клеток
Saline	Covidien LLC, Мэнсфилд, Массачусетс, США	1020	0,9% шейкер стерильного физиологического раствора
	Eppendorf, Гамбург, Германия	T1317	Термомиксер
Силикагель-рад-TLC бумажный лист	Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, Калифорния, США	SGI0001	iTLC-SG