Методическая статья

Стандартизированный преаналитический протокол жидкой биопсии для последующих применений ДНК без циркуляции

DOI:

10.3791/64123

⸱

16 сентября 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Liquid Biopsy and Biomarker Working Module, the Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Жидкая биопсия произвела революцию в нашем подходе к трансляционным исследованиям онкологии, при этом сбор, качество и хранение образцов являются важнейшими шагами для ее успешного клинического применения. Здесь мы описываем стандартизированный и проверенный протокол для последующих приложений ДНК без циркуляции, который может быть применен в большинстве трансляционных исследовательских лабораторий.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Термин жидкая биопсия (LB) относится к молекулам, таким как белки, ДНК, РНК, клетки или внеклеточные везикулы в крови и других жидкостях организма, которые происходят из первичной и / или метастатической опухоли. LB стал опорой в трансляционных исследованиях и начал становиться частью клинической онкологической практики, обеспечивая минимально инвазивную альтернативу твердой биопсии. LB позволяет контролировать опухоль в режиме реального времени с помощью минимально инвазивной экстракции образца, такого как кровь. Приложения включают раннее выявление рака, наблюдение за пациентами для выявления прогрессирования заболевания, оценку минимального остаточного заболевания и потенциальную идентификацию молекулярной прогрессии и механизма резистентности. Для того чтобы добиться достоверного анализа этих образцов, о которых можно сообщить в клинику, преаналитические процедуры следует тщательно обдумывать и строго соблюдать. Сбор, качество и хранение образцов являются важнейшими шагами, определяющими их полезность в последующих приложениях. Здесь мы представляем стандартизированные протоколы из нашего рабочего модуля жидкой биопсии для сбора, обработки и хранения образцов плазмы и сыворотки для последующего анализа жидкой биопсии на основе свободной от циркуляции ДНК. Представленные здесь протоколы требуют стандартного оборудования и достаточно гибки для применения в большинстве лабораторий, ориентированных на биологические процедуры.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Термин «жидкая биопсия» был определен в 2010году1 как присутствие молекул (например, белка, дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), рибонуклеиновой кислоты (РНК)), клеток или внеклеточных везикул (например, экзосом) в крови и других жидкостях организма, которые происходят из первичной опухоли. Использование образцов жидкой биопсии произвело революцию в трансляционных онкологических исследованиях, поскольку биопсия тканей, ограниченная определенной областью в определенный момент, может пропустить соответствующие клоны из-за гетерогенности опухоли. Кроме того, жидкая биопсия играет важную роль в типах опухолей, где первичная ткань скудна или недоступна, поскольку она может избежать инвазивной биопсии, снижая затраты и риск для пациентов. Кроме того, молекулярные характеристики опухоли постоянно развиваются в основном из-за терапевтического давления, и образцы жидкой биопсии могут захватывать клональную динамику опухоли, поскольку их можно брать продольно, в различные клинические и терапевтические периоды заболевания, такие как исходный уровень, лечение, наилучший ответ и прогрессирование заболевания или даже раньше. Концепция «жидкой биопсии в реальном времени» означает, что динамические изменения в опухоли могут контролироваться в режиме реального времени, что позволяет проводить прецизионную медицину при этом заболевании. Жидкая биопсия имеет множество потенциальных применений в клинике, включая скрининг и раннее выявление рака, мониторинг заболевания в режиме реального времени, выявление минимального остаточного заболевания, изучение механизмов резистентности к лечению и стратификацию пациентов на терапевтическом уровне1. Раннее выявление рецидива и прогрессирования заболевания является неудовлетворенной клинической потребностью во многих типах опухолей и является ключевым фактором повышения выживаемости и качества жизни больных раком. Обычные методы визуализации и растворимые опухолевые маркеры могут не иметь чувствительности и / или специфичности, необходимых для этой задачи. Таким образом, в клинике срочно необходимы новые прогностические маркеры, такие как те, которые основаны на циркулирующих свободных нуклеиновых кислотах.

Типы образцов, которые используются для исследований жидкой биопсии, включают, но не ограничиваются ими, образцы крови, мочи, слюны и стула. Другими опухолеспецифическими образцами могут быть клеточные аспираты, спинномозговая жидкость, плевральная жидкость, киста и асцит жидкости, мокрота и панкреатический сок2. Первые жидкости могут содержать различные типы материалов, полученных из рака, циркулирующие опухолевые клетки (CTC) или фрагменты, такие как экзосомы и бесклеточная циркулирующая опухолевая ДНК (ctDNA). Нуклеиновые кислоты могут быть инкапсулированы во внеклеточные везикулы (EV) или высвобождаться в жидкости организма из-за гибели и повреждения клеток. Циркулирующая свободная ДНК (cfDNA) в основном высвобождается в кровоток из апоптотических или некротических клеток и присутствует у всех людей, показывая повышенные уровни при воспалительных или онкологических заболеваниях3. Экзосомы представляют собой небольшие внеклеточные везикулы (~30-150 нм), секретируемые клетками, содержащими нуклеиновые кислоты, белки и липиды. Эти везикулы являются частью межклеточной коммуникационной сети и обычно встречаются во многих типах жидкостей организма2. Нуклеиновые кислоты, заключенные внутри электромобилей, защищены от суровой среды в жидкостях организма, что обеспечивает более надежный способ изучения этих молекул в условиях жидкой биопсии.

В целом, уровни циркулирующих нуклеиновых кислот в жидких образцах биопсии очень низкие, и поэтому для обнаружения необходимы чувствительные методы, такие как цифровая ПЦР или секвенирование следующего поколения (NGS). Преаналитическое управление образцом имеет решающее значение для предотвращения лизиса клеток крови и высвобождения интактной ДНК, вызывая загрязнение cfDNA геномной ДНК. Кроме того, при извлечении образцов необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать присутствия ингибиторов ферментных методов анализа.

Здесь мы представляем стандартизированный метод сбора и хранения образцов плазмы и сыворотки, который является важным первым шагом для последующих применений на основе жидкой биопсии, включая анализ циркулирующих нуклеиновых кислот.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предварительное этическое одобрение было получено от участвующих центров перед извлечением образцов крови. Следующие протоколы выделения сыворотки и плазмы были выполнены в соответствии с этическими принципами биомедицинских исследований.

ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие соображения перед началом протокола приведены здесь. Для использования образцов человека в биомедицинских исследованиях требуется предварительное этическое одобрение с соответствующего информированного согласия. Для обработки образцов крови требуется шкаф биобезопасности класса II. Лабораторное пальто, защитные перчатки и очки следует носить на протяжении всей процедуры, чтобы избежать заражения патогенами, передающимися через кровь. Минимум 30 минут требуется для обработки образцов сыворотки. После забора крови в пробирках без антикоагулянта выдерживают при комнатной температуре (РТ) в течение 30-45 мин, чтобы обеспечить образование сгустков. Для плазменной подготовки требуется не менее 40 мин, и образцы должны быть обработаны в течение 4 ч с момента экстракции при использовании пробирок этилендиаминовой тетра-уксусной кислоты (ЭДТА) или в течение 24-48 ч, если используются клеточные стабилизирующие трубки для сбора или специфические бесклеточные трубки для сбора ДНК. Однако, по мнению некоторых производителей, образцы стабильны до 2 недель в этих специализированных трубках. Важно проверить на гемолиз, который придаст плазме или сывороточной фракции красноватый вид. См. раздел устранения неполадок для гемолизованных образцов в обсуждении.

1. Подготовка сыворотки для исследований жидкой биопсии

ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время, необходимое для выполнения этого шага, составляет 30 минут (рисунок 1).

  1. Извлекают 4-10 мл крови в пробирках, не содержащих антикоагулянта (красный или красный/серо-черный колпачок), и выдерживают при РТ в течение 30-45 мин. Обработайте эти образцы в течение 4 часов с момента извлечения.
  2. Запишите время и дату извлечения образца и идентификацию субъекта (ID) в надлежащим образом разработанной базе данных образцов.
  3. Надев лабораторный халат, защитные перчатки и очки, центрифугируйте трубку, содержащую свежую кровь при РТ (15 °C-25 °C) в течение 10 мин при 1 600 (± 150) х г, с максимальным перерывом.
  4. После центрифугирования осторожно извлеките трубку из центрифуги; верхняя фаза сывороточного супернатанта будет казаться прозрачной и желтоватой (рисунок 2). Проверьте, есть ли в образце признаки гемолиза (рисунок 3) и запишите наличие гемолиза, когда это необходимо.
  5. В шкафу биобезопасности класса II перенесите сыворотку в пульверы в виде 250 мкл аликвот.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем аликвот должен быть скорректирован в соответствии с требованиями исследования.
  6. Немедленно заморозьте сыворотку в вертикальном положении в ящике для хранения при -80 °C и запишите время хранения образца.
  7. Убедитесь, что образцы были обработаны в течение требуемых 4 часов.

2. Препарат плазмы для исследований жидкой биопсии

ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время, необходимое для выполнения этого шага, составляет 40 минут (рисунок 4).

  1. Экстракт 4-10 мл крови в пробирках, содержащих этилендиамин тетра-уксусную кислоту (ЭДТА). Обрабатывайте образцы в течение 4 ч с момента извлечения.
  2. Запишите время и дату извлечения образца и идентификатор субъекта в надлежащим образом спроектированной базе данных образцов.
  3. Надев лабораторный халат, защитные перчатки и очки, центрифугируйте трубку ЭДТА при RT (15 °C-25 °C) в течение 10 мин при 1 600 (± 150) х г, с максимальным перерывом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к инструкциям производителя при использовании других сборных трубок.
  4. После центрифугирования супернатант плазмы будет казаться прозрачным и желтоватым. Проверьте, есть ли в образце признаки гемолиза (рисунок 3), и перенесите плазму (надводный материал) в центрифужную трубку объемом 15 мл, не нарушая клеточный слой, используя одноразовую серологическую пипетку (или одноразовую ламповую пипетку или пипетки p1000 с фильтрующим наконечником). Оставьте небольшой остаточный объем плазмы над клеточным слоем (примерно 5 мм).
  5. Если наблюдается гемолиз, выбросьте образец для дальнейших анализов. (Рисунок 5). См. раздел устранение неполадок в обсуждении, чтобы оценить гемолиз.
  6. Центрифугировать плазму в 15 мл центрифужной трубки при РТ (15 °C-25 °C) в течение 10-20 мин при 3000 (±150) х г. Выполните этот шаг, чтобы удалить любые остаточные неповрежденные клетки крови, перенесенные с первого этапа центрифугирования.
  7. После центрифугирования осторожно извлеките трубку из центрифуги и переведите 1-4 мл плазмы в 1-4 мл полипропиленовых криогенных флаконов с помощью одноразовой серологической пипетки (или одноразовой ламповой пипетки или пипетки p1000 с фильтрующим наконечником). Остаточный объем плазмы (приблизительно 0,3 мл или высота 7 мм) должен быть оставлен на дне трубки, чтобы избежать загрязнения плазмы клетками крови (рисунок 5).
  8. Немедленно заморозьте плазму в вертикальном положении в ящике для хранения при -80 °C и запишите время хранения образца. Убедитесь, что образцы были обработаны в течение требуемых 4 часов.
  9. Соберите клеточный слой (пушистый слой) с помощью P1000 и отфильтрованного наконечника и переложите его в трубку объемом 2 мл. Немедленно заморозить и хранить при -80 °C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После центрифугирования пробирок крови без антикоагулянта верхняя фаза выглядит бледно-желтой и соответствует сывороточной фракции (рисунок 2). Эта фракция тщательно удаляется и аликвотируется для последующего анализа.

Гемолиз может присутствовать как в плазме, так и в сывороточной фракции, а верхняя фаза будет иметь красноватый вид, что свидетельствует о наличии и степени гемолиза (рисунок 3).

После центри...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Жидкая биопсия имеет множество потенциальных применений в разное время во время лечения рака. Во-первых, при постановке диагноза идентифицировать молекулярные маркеры опухоли, которые бы предполагали наличие потенциального опухолевого поражения, которое может быть дополнительно исследовано клинически. Во-вторых, во время лечения для мониторинга заболевания в режиме реального времени, оценки молекулярного ответа лечения, клональной эволюции и раннего выявления рецидивов заболевания или резистентности к лечению. Наконец, п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Беатрис Беллосильо (BB): BB получила гонорар за роль спикера, консультанта или консультанта от Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer и BMS. Сара Лопес-Тарруэлла (SL): SL получила гонорар за роль спикера, консультанта или консультанта от Astra-Zeneca/Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline и Veracyte. Ноэлия Таразона (NT): NT получила гонорар за роль спикера, консультанта или консультанта от Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM и ESMO. Хавьер Эрнандес-Лоса (JHL): получил гонорар за роль спикера, консультанта или консультанта от Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly и Diaceutics. Родриго Толедо (RT) сообщает о получении исследовательских грантов, связанных с этим исследованием, от Novartis и исследовательских грантов, не связанных с этим исследованием от AstraZeneca и Beigene. Остальные авторы не имеют никаких раскрытий в отношении рукописи.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Сеть биомедицинских исследований в области рака (CIBERONC) за их поддержку и следующий грант проекта: LB CIBERONC PLATFORM: платформа CIBERONC для стандартизации и продвижения жидкой биопсии. ПИ Родриго Толедо, (CIBERONC), 2019-2021.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл пробирок EppendorfEppendorf0030 120.086Можно использовать любые стандартные пробирки/оборудование
10 мл серологических одноразовых пипетокBIOFILGSP010010Можно использовать любые стандартные пробирки/оборудование
10 мл Vacutainer K2 EDTA пробиркаBecton Dickinson367525Эти пробирки можно использовать для сбора плазмы
15 мл полипропиленовые центрифужные пробиркиBIOFILCFT411150Можно использовать любые стандартные пробирки/оборудование
3,5 мл BD Vacutainer tube без антикоагулянтаBecton Dickinson368965Для сбора сыворотки можно использовать как 8,5, так и 3,5 мл пробирки
мл полипропиленовый криогенный флакон, круглое дно, самостоятельныйCorning430662Можно использовать любые стандартные пробирки/оборудование 4
мл Vacutainer K2 EDTA tubeBecton Dickinson367864Эти пробирки могут быть использованы для сбора плазмы
4200 TapeStation SystemAgilentG2991BAДоступны несколько методов количественного определения с a  специфическое применение cfDNA
5 мл серологические одноразовые пипеткиBIOFILGSP010005Любые стандартные пробирки/оборудование могут быть использованы
8,5 мл BD Vacutainer tube без антикоагулянтаBecton Dickinson366468Для сбора сыворотки могут быть использованы пробирки объемом 8,5 или 3,5 мл
Центрифуга, способная выдержать ~3000 x <ем>г с поворотным ротором ведраThermo Fisher ScientificSorvall ST 16   10688725Любые стандартные тубы/оборудование могут быть использованы
Морозильные ящики для хранения на 1– Криогенные флаконы объемом 4 млCorning431120Эти коробки необходимы при использовании флаконов объемом 4 мл для хранения
наконечников для пипеток p1000CORNING4809Можно использовать любые стандартные пробирки/оборудование
QIAamp Circulating Nucleic Acid KitQiagen55114Любой коммерчески доступный набор, специфичный для выделения cfDNA, может быть использован с этим протоколом обработки крови.
Стрек  Бесклеточные пробирки ДНК BCT CE 10 млStreck218997Эти пробирки можно использовать для сбора плазмы
Температура морозильной камеры (-80 &d; C)ESCO2180104Можно использовать любые стандартные трубы/оборудование
4

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
  2. Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144(2020).
  3. Bettegowda, C., et al. Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA. Nature Medicine. 4 (6), (2014).
  4. Heitzer, E., et al. Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer. ESMO Open. 7 (2), 100399(2022).
  5. Gennari, A., et al. ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer. Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).
  6. Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. A simple method to monitor hemolysis in real time. Scientific Reports. 10 (1), 5101(2020).
  7. Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges. Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).
  8. Sidstedt, M., et al. Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).
  9. Maass, K. K., et al. From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube. Cancers. 13 (12), 3002(2021).
  10. Greytak, S. R., et al. Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).
  11. Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4 (7), 00699(2018).
  12. Boissier, E., et al. The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).
  13. Johansson, G., et al. Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078(2019).
  14. Casas-Arozamena, C., et al. Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer. Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585(2020).
  15. Alcoceba, M., et al. Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping. British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).
  16. Szpechcinski, A., et al. Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease. British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).
  17. Earl, J., et al. Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival. Cancers. 13 (7), 1612(2021).
  18. Lampignano, R., et al. Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows. Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).
  19. Febbo, P. G., et al. Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).
  20. De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. How to use liquid biopsies to treat patients with cancer. ESMO Open. 6 (2), 100060(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи