Методическая статья

Отбор аптамеров in vitro для дифференциации инфекционных вирусов от неинфекционных

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64127

⸱

7 сентября 2022 г.

 ,  ,  , 
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry, University of Texas at Austin

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы предоставляем протокол, который обычно может применяться к отдельным аптамерам, которые связываются только с инфекционными вирусами, а не с вирусами, которые стали неинфекционными с помощью метода дезинфекции, или с любыми другими подобными вирусами. Это открывает возможность определения инфекционного статуса в портативных и экспресс-тестах.

Аннотация

Вирусные инфекции оказывают серьезное влияние на общество; Большинство методов обнаружения испытывают трудности с определением того, является ли обнаруженный вирус заразным, что приводит к задержкам в лечении и дальнейшему распространению вируса. Разработка новых датчиков, которые могут информировать о заразности клинических образцов или образцов окружающей среды, позволит решить эту нерешенную задачу. Однако очень немногие методы могут получить чувствительные молекулы, которые могут распознавать интактный инфекционный вирус и отличать его от того же вируса, который был сделан неинфекционным методами дезинфекции. Здесь мы описываем протокол выбора аптамеров, которые могут различать инфекционные вирусы и неинфекционные вирусы, используя систематическую эволюцию лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX). Мы воспользуемся двумя особенностями SELEX. Во-первых, SELEX может быть адаптирован для удаления конкурирующих целей, таких как неинфекционные вирусы или другие подобные вирусы, с помощью встречного отбора. Кроме того, весь вирус может быть использован в качестве мишени для SELEX вместо, например, вирусного поверхностного белка. Цельный вирус SELEX позволяет подбирать аптамеры, которые связываются конкретно с нативным состоянием вируса, без необходимости разрушения вируса. Таким образом, этот метод позволяет получать агенты распознавания на основе функциональных различий на поверхности патогенов, которые не нужно знать заранее.

Введение

Вирусные инфекции оказывают огромное влияние на экономику и общество во всем мире, что становится все более очевидным в связи с недавней пандемией COVID-19. Своевременная и точная диагностика имеет первостепенное значение в лечении вирусных инфекций при предотвращении распространения вирусов среди здоровых людей. Несмотря на то, что было разработано множество методов обнаружения вирусов, таких как ПЦР-тесты1,2 и иммуноанализы3, большинство используемых в настоящее время методов не способны определить, действительно ли обнаруженный вирус заразен или нет. Это связано с тем, что наличие компонентов вируса само по себе, таких как вирусная нуклеиновая кислота или белки, не указывает на присутствие интактного инфекционного вируса, и уровни этих биомаркеров показали плохую корреляцию с инфекционностью 4,5,6. Например, вирусная РНК, обычно используемая для текущих тестов на COVID-19 на основе ПЦР, имеет очень низкие уровни на ранних стадиях инфекции, когда пациент заразен, в то время как уровень РНК часто все еще очень высок, когда пациенты выздоровели от инфекции и больше не заразны 7,8. Вирусный белок или антигенные биомаркеры следуют аналогичной тенденции, но обычно появляются даже позже, чем вирусная РНК, и, таким образом, еще менее прогностируют инфекционность 6,9. Чтобы устранить это ограничение, были разработаны некоторые методы, которые могут информировать о статусе инфекционности вируса, но основаны на методах микробиологии клеточных культур, которые требуют длительного времени (дни или недели) для получения результатов 4,10. Таким образом, разработка новых датчиков, которые могут информировать о заразности клинических образцов или образцов окружающей среды, может избежать задержек в лечении и дальнейшего распространения вируса. Тем не менее, очень немногие методы могут получить чувствительные молекулы, которые могут распознавать интактный инфекционный вирион и отличать его от того же вируса, который был признан незаразным.

В этом контексте аптамеры особенно хорошо подходят в качестве уникального биомолекулярного инструмента11,12,13,14. Аптамеры представляют собой короткие одноцепочечные молекулы ДНК или РНК со специфической нуклеотидной последовательностью, которая позволяет им формировать специфическую 3D-конформацию для распознавания мишени с высоким сродством и селективностью15,16. Они получены с помощью комбинаторного процесса отбора, называемого систематической эволюцией лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX), также известного как отбор in vitro, который проводится в пробирках с большой библиотекой случайной выборки ДНК из 10 14-10 15 последовательностей17,18,19. В каждом раунде этого итеративного процесса пул ДНК сначала подвергается давлению отбора путем инкубации с мишенью в желаемых условиях. Любые последовательности, которые не связаны с целью, затем удаляются, оставляя только те немногие последовательности, которые могут связываться при данных условиях. Наконец, последовательности, которые были выбраны на предыдущем шаге, амплифицироваются с помощью ПЦР, обогащая популяцию пула желаемыми функциональными последовательностями для следующего раунда отбора, и процесс повторяется. Когда активность пула отбора достигает плато (обычно после 8-15 раундов), библиотека анализируется с помощью секвенирования ДНК для выявления выигрышных последовательностей, проявляющих наибольшее сродство.

SELEX обладает уникальными преимуществами, которые могут быть использованы для повышения селективности по отношению к другим аналогичным мишеням 20,21, например, по инфекционному статусу вируса22. Во-первых, для селекции можно использовать широкий спектр различных типов мишеней, от малых молекул и белков до целых патогенов и клеток16. Таким образом, для получения аптамера, который связывается с инфекционным вирусом, в качестве мишени может быть использован интактный вирус вместо вирусного поверхностного белка19. Whole virus SELEX позволяет подбирать аптамеры, которые специфически связываются с нативным состоянием вируса, без необходимости разрушения вируса. Во-вторых, SELEX может быть адаптирован для удаления конкурирующих мишеней 21,23, таких как другие аналогичные вирусы или неинфекционные инактивированные вирусы, с использованием этапов встречного отбора в каждом раунде отбора22. Во время этапов отбора счетчиков пул ДНК подвергается воздействию мишеней, для которых связывание нежелательно, и любые последовательности, которые связываются, отбрасываются.

В этой работе мы приводим протокол, который в целом может быть применен для выбора аптамеров, которые связываются с инфекционным вирусом, но не с тем же вирусом, который был сделан неинфекционным с помощью конкретного метода дезинфекции, или с другими родственными вирусами. Этот метод позволяет получать распознавающие агенты на основе функциональных различий поверхности вируса, которые не нужно знать заранее, и, таким образом, дает дополнительное преимущество для обнаружения вновь появившихся патогенов или для недостаточно изученных заболеваний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Приготовление реагентов и буферов

  1. Приготовьте 10x трис-борат ЭДТА (10x TBE), добавив 0,9 М трис-основания, 0,9 М борной кислоты, 20 мМ ЭДТА (динатриевая соль) и деионизированную воду до конечного объема 1 л. Перемешивайте до тех пор, пока все компоненты не растворятся.
  2. Приготовьте 10% денатурирующий раствор полиакриламида следующим образом. В стеклянную бутылку объемом 250 мл добавьте 120 г мочевины (8 М), 25 мл 10x TBE, 62,5 мл 40% раствора акриламида/бисакриламида (29:1) и достаточное количество дистиллированной воды для достижения конечного объема 250 мл. Перемешивайте до тех пор, пока все компоненты не растворятся.
  3. Подготовьте 2-кратный загрузочный буфер следующим образом. В пробирку объемом 50 мл добавьте 21,636 г мочевины (8 М), 1,675 г ЭДТА (1 мМ) и 4,5 мл 10x TBE. Залейте до 45 мл дистиллированной водой и перемешивайте до полного растворения всех компонентов.
  4. Приготовьте экстракционный буфер, добавив 100 мМ ацетата натрия и 1 мМ ЭДТА (динатриевая соль). Установите окончательный рН на 5.
  5. Готовят растворы для осаждения этанола следующим образом. Приготовьте 3 М ацетата натрия, отрегулируйте до pH 5,2 и храните при температуре 4 ° C. Приготовьте 70% этанол v/v и храните при -20 °C. Приготовьте 100% этанол и храните при температуре -20 °C.
  6. Приготовьте 500 мл буфера SELEX, содержащего 1x PBS, 2,5 мМ MgCl2 и 0,5 мМ CaCl2. Отрегулируйте до pH 7,4. Приготовьте 100 мл буфера SELEX с 8 М мочевиной, добавив 1x PBS, 2,5 мМ MgCl 2, 0,5 мМ CaCl2 и 8 М мочевины. Отрегулируйте до pH 7,4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор буфера SELEX имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы выбранный аптамер работал на конечном образце, на который будет применяться аптамер. Например, аптамеры, специфичные для SARS-CoV-2, будут использоваться в биологических образцах (например, мазки из слюны или носоглотки). Таким образом, важно выбрать концентрацию ионов, рН и буфер, которые точно имитируют эти условия в предполагаемых биологических образцах.
  7. Подготовьте буфер для обвязки и промывки следующим образом. В пробирке объемом 50 мл приготовьте 5 мМ триса, 0,5 мМ ЭДТА (динатриевая соль) и 2 М NaCl. Отрегулируйте до pH 7,5.

2. Разработка и синтез библиотеки ДНК и праймеров

  1. Разработайте исходную библиотеку ssDNA и праймеры со следующими критериями (см. Таблицу 1 для примера библиотеки ssDNA и набора праймеров, где N указывает случайное положение нуклеотидов).
    1. Убедитесь, что библиотека содержит центральную случайную область от 35 до 60 нуклеотидов, окруженную двумя постоянными последовательностями на концах 3' и 5', которые действуют как области праймера для амплификации. Типичная длина библиотеки составляет 45 случайных нуклеотидов.
    2. Убедитесь, что обратный праймер содержит модификацию биотина для отделения ssDNA от амплифицированных двухцепочечных продуктов ПЦР с использованием шариков с покрытием стрептавидина во время процесса отбора in vitro .
  2. Приобретайте олиго ДНК из коммерческих источников со стандартной обессоливающей очисткой. Очистите библиотеку ssDNA и праймеры 10%-ным денатурирующим электрофорезом полиакриламидного геля (dPAGE) с последующим осаждением этанола в соответствии со стандартными процедурами24.
    ВНИМАНИЕ: Акриламидный мономер и бромид этидия являются опасными химическими веществами (канцерогенами для человека), поэтому при выполнении PAGE используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (лабораторные халаты, перчатки и средства защиты глаз). По возможности избегайте использования бромида этидия и замените его более безопасным красителем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно заказать олиго с очисткой ВЭЖХ, чтобы избежать выполнения этого этапа очистки, хотя это не приведет к столь эффективному удалению коротких олигонуклеотидов.
  3. Добавьте воду без нуклеазы для ресуспендирования ssDNA после осаждения этанола до желаемой концентрации (100 мкМ). Определяют концентрацию библиотеки ssDNA и праймеров по УФ-поглощению при λ = 260 нм. Хранить при температуре -20 °C.
  4. Приобретите немодифицированный обратный праймер для использования для высокопроизводительной подготовки библиотеки секвенирования и количественного определения кПЦР.

3. Образцы инфекционных и неинфекционных вирусов

ВНИМАНИЕ: Образцы инфекционных и неинфекционных вирусов являются образцами уровня биобезопасности 2 (BSL2), которые требуют особой осторожности для безопасного и надлежащего обращения. Все этапы процедуры, включающие эти образцы, должны выполняться в шкафу биобезопасности, или раствор вируса должен находиться в герметичном контейнере (например, в закрытых пластиковых пробирках).

  1. Получите исходный раствор инфекционных вирусов или приготовьте их, следуя соответствующему протоколу для каждого вируса. Используемые здесь псевдовирусы SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 и H5N1 были предоставлены лабораторией профессора Лицзюнь Ронга (UIC) в буфере PBS и были подготовлены в соответствии с протоколами22,25,26.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для вирусов, для которых требуются средства уровня биобезопасности 3 для обработки интактного инфекционного вируса, можно работать с псевдовирусами. Псевдотипированный вирус генерируется из лентивируса (ВИЧ), который отображает поверхностные белки вируса в вирусной оболочке и, таким образом, близко имитирует поверхностный и входной механизм вируса, но имеет дефект в непрерывной репликации вируса.
  2. Приобретите неинфекционный исходный раствор вируса или приготовьте его, следуя процедуре дезинфекции. Использованный здесь материал псевдовируса SARS-CoV-2 (p-SARS-CoV-2), инактивированный ультрафиолетом, был предоставлен лабораторией профессора Ронга (UIC) в буфере PBS, а ранее описанный протокол использовался для УФ-инактивации22.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, проведите анализ, чтобы проверить инфекционность вируса, чтобы убедиться, что вирус был полностью инактивирован.
  3. Количественная оценка запасов вируса
    1. Количественно определите вирус с помощью анализа бляшек в соответствии со стандартными процедурами27,28,29. Этот анализ не только позволяет количественно определить вирус, но и указывает на инфекционный статус вируса, подтверждая концентрацию инфекционного вируса.
    2. Для псевдовирусов или вирусов, для которых анализ бляшек недоступен, количественно определите вирус с помощью коммерчески доступного количественного набора ИФА лентивируса.
    3. Приготовьте 1 x 108 копий/мл исходного раствора для p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 и p-H5N1. Разделите каждый исходный раствор на аликвоты, содержащие по 50 мкл каждый, и храните при -80 ° C. Размораживайте новую аликвоту перед каждым экспериментом.

4. Отбор in vitro или процесс SELEX: начальный раунд

ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех шагов с использованием инфекционного вируса работайте в шкафу BSL2.

  1. Денатурируйте библиотеку ssDNA. Возьмите 10 мкл 100 мкМ библиотеки ssDNA (1 нмоль) и смешайте с 240 мкл буфера SELEX. Нагрейте до 95 °C в течение 15 минут в сухой ванне, а затем поместите трубку на лед на 15 минут.
  2. Инкубируйте библиотеку ssDNA с инфекционным вирусом (этап положительного отбора) следующим образом. Смешайте 250 мкл библиотеки ssDNA в буфере SELEX с шага 4.1 с 50 мкл инфекционного вируса (1 x 108 копий/мл). Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре.
  3. Блокируйте неспецифические участки в центрифужных фильтрах следующим образом. В ожидании шага 4.2 подготовьте фильтры центрифуги к следующим шагам.
    1. Добавьте 400 мкл последовательности 1 мМ Т20 (таблица 1) к каждому центрифужному фильтру объемом 0,5 мл, который будет использоваться: один центрифужный фильтр с отсечкой 100 кДа и один с отсечкой 10 кДа.
    2. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре и центрифуге при 14 000 x g в течение 10 мин, чтобы удалить раствор Т20 из фильтра. Промойте 3 раза буфером SELEX, чтобы удалить лишние последовательности T20.
  4. Вымойте несвязанные последовательности следующим образом. Добавьте смесь, инкубированную на этапе 4.2, в заблокированный центрифужный фильтр мощностью 100 кДа и центрифугу при 14 000 x g в течение 10 мин. Промыть 3 раза, добавив 400 мкл буфера SELEX и центрифугируя при 14 000 x g в течение 10 мин. Держите фракцию в фильтре и отбрасывайте проточную.
  5. Элютные связанные последовательности, как описано ниже.
    1. На шаге 4.4 замените сборную трубку центрифужного фильтра и добавьте 300 мкл буфера SELEX, содержащего 8 М мочевины, в центрифужный фильтр. Нагрейте центрифужный фильтр при 95 °C в течение 15 мин в сухой ванне, а затем центрифугу при 14 000 x g в течение 10 мин.
    2. Соберите фракцию, которая протекала через фильтр, содержащий элюированные последовательности. Повторите еще три раза. Работайте в шкафу BSL2 и вымойте все материалы 10% отбеливателем, чтобы инактивировать вирус, прежде чем выбрасывать материалы.
  6. Сконцентрировать и обессолить следующим образом. Добавьте раствор, собранный в 4,5 кДа, в заблокированный центрифужный фильтр мощностью 10 кДа. Центрифуга при 14 000 x g в течение 15 мин. Откажитесь от фракции, которая протекала через фильтр.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку вирусы сохраняются и инактивируются 8 М мочевиной в фильтре на предыдущем этапе, этот и последующие этапы не нужно выполнять в шкафу биобезопасности. Эту процедуру необходимо повторить, если используется центрифужная пробирка объемом 0,5 мл до тех пор, пока весь раствор не будет собран, как на этапе 4,5, 1,2 мл проходит через фильтр.
  7. Промыть 3 раза 300 мкл буфера SELEX для удаления мочевины центрифугированием при 14 000 x g в течение 15 минут. Откажитесь от фракции, которая протекала через фильтр. Восстановите раствор в фильтре, перевернув его вверх дном в чистой сборной трубке и центрифугируя в течение 5 минут.
  8. Измерьте конечный объем восстановленного раствора от 4,7 с помощью пипетки в пластиковой трубке. Это решение называется R i a, где i соответствует круглому числу. Как правило, получаются объемы от 30 мкл до 50 мкл. Возьмите 1 мкл элюированной ссДНК для количественного определения количества ДНК с помощью кПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это возможная точка паузы, когда образец R1может поддерживаться при -20 ° C, чтобы продолжить в другое время.
  9. Выполните ПЦР-амплификацию, как описано ниже.
    1. В первом раунде возьмите 90% образца R1в качестве шаблона ПЦР. В следующих раундах возьмите 60% от общего объема на шаге 4.8 для выполнения ПЦР и храните другую фракцию при -20 ° C.
    2. Настройте реакцию ПЦР 50 мкл со следующей концентрацией, имеющей указанную конечную концентрацию: 1x буфер реакции ПЦР, 200 мкМ dNTP, 10 мкл матрицы ДНК (R 1 образец), 200 нМ каждый праймер и1,25U-полимеразы (запас 2,5 ЕД/мкл).
    3. Оптимизируйте условия ПЦР, включая количество циклов и температуру отжига для каждого набора праймеров и библиотеки ssDNA. Избегайте использования слишком большого количества циклов, которые могут привести к образованию нежелательных субпродуктов ПЦР, таких как праймеры-димеры. Испытайте различные температуры отжига в зависимости от температуры плавления грунтовок.
    4. Запустите ПЦР с использованием оптимизированных условий при 95 ° C в течение 5 мин, а затем 18 циклов по 1 мин при 95 ° C, 30 с при 52 ° C и 1 мин при 72 ° C с заключительным этапом расширения при 72 ° C в течение 10 мин, чтобы получить пул дцДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это еще одна возможная точка паузы, когда продукт ПЦР можно хранить при -20 ° C, чтобы продолжить в другое время.
  10. Восстановите ssDNA с помощью магнитных шариков, модифицированных стрептавидином.
    1. Возьмите 80% продукта ПЦР. Оставшуюся фракцию хранить при температуре -20 °C.
    2. Разделите продукт ПЦР на аликвоты по 50 мкл и добавьте их в микрофуговые пробирки, содержащие 50 мкл магнитных шариков (МБ), модифицированных стрептавидином. Инкубировать в течение 30 минут при легком перемешивании (например, с помощью вращающегося шейкера) при комнатной температуре. Затем поместите микрофугу на магнитную стойку, чтобы изолировать MB и удалить надосадочную жидкость путем пипетки (это должно быть прозрачное решение).
    3. Промыть, добавив в тюбик 200 мкл связующего и промывочного буфера. Извлеките трубку из магнитной стойки, постучите по трубке и ресуспендируйте MB до однородного раствора с помощью пипетки. Поместите микрофугу обратно на магнитную стойку, чтобы изолировать MB и удалить надосадочную жидкость с помощью пипетки. Повторите этот этап стирки дважды.
    4. После завершения промывки ресуспендируйте MB в 100 мкл буфера SELEX и нагрейте раствор до 95 °C в течение 10 минут. Немедленно поместите трубку в магнитную стойку, прежде чем трубка остынет, и возьмите надосадочную жидкость, содержащую пул ssDNA. Повторите этот шаг восстановления, добавив 50 мкл буфера SELEX.
  11. Измерьте конечный объем восстановленной фракции от 4,10 с помощью пипетки. Эта дробь называется R i x, где i соответствует круглому числу. Как правило, получаются объемы от 140 до 150 мкл. Возьмите 1 мкл R1x, чтобы количественно определить количество ДНК с помощью кПЦР.

5. Последующие отборочные туры

  1. Денатурируйте пул ssDNA. Возьмите 60% образца R1x и смешайте с 50 мкл буфера SELEX. Нагрейте при температуре 95 °C в течение 15 минут в сухой ванне. Поместите тюбик на лед на 15 минут.
  2. Инкубируйте пул ssDNA с неинфекционным вирусом и другими потенциально мешающими вирусами (шаг контротбора). Смешайте денатурированный пул ssDNA в буфере SELEX из 5.1 с 50 мкл каждого вируса (5 x 109 копий/мл; например, неинфекционный p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 и p-H5N1). Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
  3. Блокировка неспецифических участков в центрифужных фильтрах. В ожидании шага 5.2. подготовьте центрифужные фильтры к следующим шагам. Как правило, используют два центрифужных фильтра, один с отсечкой 100 кДа, а другой с отсечкой 10 кДа. Выполните ту же процедуру, что и в 4.3.
  4. Смойте последовательности, связанные с нецелевыми вирусами. Добавьте смесь, инкубированную на этапе 5.2, в заблокированный центрифужный фильтр мощностью 100 кДа. Центрифуга при 14 000 x g в течение 10 мин и извлекает фракцию, которая проходит через центрифужный фильтр. Промыть 2 раза, добавив 100 мкл буфера SELEX и центрифугируя при 14 000 x g в течение 10 мин. Сохраняйте ту фракцию, которая протекала через фильтр.
  5. Инкубируйте пул ssDNA с инфекционным вирусом (положительный этап отбора). Возьмите 300 мкл фракции из шага 5.4 и смешайте с 50 мкл инфекционного вируса (1 x 108 копий/мл). Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре. Выполните шаги с 4.4 по 4.11.

6. Мониторинг процесса SELEX

ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля обогащения пула кПЦР используется двумя способами. Во-первых, путем абсолютной количественной оценки можно проверить обогащение бассейнов (выход элюирования). Во-вторых, путем мониторинга кривой таяния можно оценить разнообразие бассейнов (конвергенцию видов аптамеров)30.

  1. Выполните все анализы кПЦР с реакционным объемом 10 мкл в 96-луночных планшетах, предназначенных для кПЦР.
  2. Приготовьте стандартную смесь для кПЦР, содержащую 5 мкл основной смеси, 0,3 мкл 500 нМ каждого немеченого праймера, 3,4 мкл H2O и 1 мкл матрицы ДНК.
    1. Подготовьте разведения очищенной библиотеки ssDNA (шаг 2.3) для запуска стандартной кривой.
    2. Разбавьте образцы ДНК, чтобы их концентрация соответствовала стандартной кривой. Для образцов Ria добавьте 1 мкл образца без разбавления и 1 мкл разбавления 1:10 в смесь для кПЦР. Для образцов Rix включите разведения 1:10 или 1:100.
  3. Запустите qPCR, установив следующий протокол. Сначала установите начальный этап денатурации при 98 °C в течение 2 минут. Затем установите 40 циклов денатурации при 98 ° C в течение 5 с и отжиг и расширение при 52 ° C в течение 10 с. Наконец, установите анализ кривой плавления от 65 до 95 ° C. Определите значения порогового цикла (Ct) с помощью автоматизированного анализа порогов.
  4. Используя стандартную кривую, количественно определите количество ssDNA в образцах Ri a и Rix.
  5. Рассчитайте выход элюирования как количество связанной ДНК (количество молей в R i a), деленное на количество исходной ДНК (количество молей в Ri-1x). Постройте график зависимости выхода элюирования от числа раундов, чтобы увидеть, наблюдается ли обогащение в раундах.
  6. Постройте кривые плавления для разных раундов. Ожидается переход к более высоким температурам плавления на пике около 75/85 ° C по мере увеличения количества раундов. Это означает, что разнообразие бассейна уменьшается.

7. Высокопроизводительное секвенирование

  1. Проконсультируйтесь с высокопроизводительным центром секвенирования о том, какие типы секвенирования и масштабы доступны, что определит метод подготовки библиотеки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом решении будет учитываться как длина пулов, подлежащих секвенированию (включая праймеры), так и количество пулов, которые должны быть представлены (как правило, стремитесь к тому, чтобы на пул приходилось не менее 1 x 105-10 6 последовательностей). Если определенная шкала последовательности не может считывать всю длину пула, можно использовать секвенирование с парным концом для чтения с обоих концов последовательности, в отличие от одностороннего, которое считывает только с одного конца.
  2. Выберите подходящий коммерчески доступный набор в зависимости от типа секвенирования по согласованию с центром секвенирования. Подготовьте несколько пулов отборочных раундов, представляющих высокое, среднее и низкое обогащение, а также окончательный пул, используя разные пары индексов в адаптерах для каждого пула, что позволило провести выборочный анализ всех раундов с использованием одной полосы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ПЦР-амплификация также может быть использована для включения адаптеров и индексов, необходимых для высокопроизводительного секвенирования, но это, как правило, стоит аналогично коммерческим наборам и не работает лучше.
    1. Выполните подготовку библиотеки, выполнив следующие действия: прекращение репарации фрагментированной ДНК, лигирование адаптеров и амплификация ПЦР для получения окончательных библиотек.
    2. Очистите продукт ПЦР с помощью магнитных шариков для очистки ДНК, следуя инструкциям производителя.
    3. Количественно определите ДНК с помощью набора для количественного определения на основе флуоресценции. Избегайте использования менее точных методов, таких как УФ-измерения малого объема.
    4. Смешайте примерно равные количества (по количеству ДНК, а не по объему) каждой библиотеки пула, содержащей определенные индексы.
    5. Проверьте качество конечной библиотеки с помощью количественного определения кПЦР и анализатора фрагментов ДНК. Этот шаг часто выполняется центром секвенирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Персонал центра секвенирования может предоставить полезную информацию о том, как подготовить библиотеку и какие меры контроля качества предлагаются. Перед подготовкой библиотек необходимо обсудить с ними.
  3. Отправьте подготовленную окончательную библиотеку в центр секвенирования в соответствии с их требованиями.

8. Анализ секвенирования

  1. Большая часть программного обеспечения, доступного для анализа последовательности, предназначена для запуска в командной строке в операционной системе Linux. Для небольших наборов данных настройте нужную операционную систему Linux и установите необходимые программы на персональный компьютер; для больших наборов данных HTS-анализ выполняется на высокопроизводительных вычислительных ресурсах или суперкомпьютерах (рекомендуется).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для использования высокопроизводительных вычислительных ресурсов потребуется доступ и обучение, получение которых может занять некоторое время. Кроме того, потребуются базовые знания об использовании командной строки UNIX. Многие бесплатные ресурсы по базовому использованию командной строки доступны в Интернете, и вычислительные ресурсы, вероятно, предоставят дополнительную информацию для использования их систем.
  2. Получите доступ к файлам виртуализации, обычно в сжатом формате файла FastQ, используя информацию, предоставленную средством виртуализации.
    1. Используйте FTP-клиент для передачи файлов на свой компьютер и/или высокопроизводительный вычислительный ресурс. Многие программы анализа последовательностей могут напрямую использовать сжатые файлы, поэтому держите файлы сжатыми, если это возможно, чтобы ограничить их размеры (большие последовательности, считывающие последовательности 50 M+, могут занимать 100 Гб+ файлового пространства в несжатом виде).
    2. Если файлы последовательностей необходимо распаковать, используйте функцию gzip, которая является стандартной для большинства установок Linux. Получите дополнительную информацию о gzip и его параметрах из установленного руководства, набрав «man gzip» в командной строке.
  3. Очистите последовательности перед анализом путем демультиплексирования, удаления адаптеров секвенирования, удаления считывания низкого качества и включения чтения как в прямом, так и в обратном направлении.
    1. Используйте программуFastQC 31 после каждого из следующих шагов, чтобы получить основную информацию о контроле качества последовательностей для оценки эффективности каждого этапа очистки.
    2. Демультиплексируйте последовательности, чтобы разделить все последовательности из одного файла чтения на разные пулы на основе индексов, включенных в адаптеры виртуализации. Этот шаг часто выполняется центром секвенирования, с которым следует проконсультироваться, поскольку точная процедура будет зависеть от используемой машины секвенирования.
    3. Удалите адаптеры виртуализации с помощью программы командной строки Cutadapt32. Используйте праймеры выделения (а не адаптеры виртуализации) в качестве входных данных в режиме связанного адаптера. Используйте параметр --discard-untrimmed, чтобы удалить все последовательности, не содержащие праймеры выделения.
    4. Задайте параметры максимальной частоты ошибок в соответствии с адаптерами, а также минимальную и максимальную длину принимаемых последовательностей. При использовании парного конечного чтения введите доступные параметры и укажите файлы последовательности чтения 1 и чтения 2. При необходимости установите дополнительные параметры, обратившись к руководствуCutadapt 32.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лигирование адаптеров секвенирования в пулы не зависит от направления и будет включать примерно 50% последовательностей в прямом направлении и 50% в обратном направлении. Чтобы избежать потери 50% последовательностей в обратном направлении, Cutadapt можно запустить во второй раз, используя обратное дополнение праймеров выделения в качестве входных данных.
    5. (Необязательно) Если используется парное секвенирование, объедините файлы Read 1 и Read 2 с программой PEAR33.
    6. Используйте программу34 FASTX-Toolkit для удаления некачественных последовательностей, которые имеют качество ниже определенного порога при любом нуклеотиде. Отсечка качества 30 является хорошей отправной точкой. Если общее качество в целом хорошее, этот шаг можно пропустить.
    7. Чтобы объединить файлы последовательностей в обратном направлении с файлами в прямом направлении, используйте функцию FASTX-Toolkit fastx_reverse_complement для файлов обратного направления. Затем используйте встроенную программу cat (стандартную для большинства установок Linux), чтобы объединить файлы forward и reverse-supplement - reverse в один файл.
  4. Для анализа обогащения последовательностей в различных пулах выборки используйте наборинструментов анализа FASTAptamer 35.
    1. Используйте FASTAptamer-Count, чтобы подсчитать, сколько раз появляется каждая последовательность. Затем ранжируйте и сортируйте последовательности по изобилию. Выходной файл count требуется в качестве входных данных для всех других программ FASTAptamer.
    2. Используйте FASTAptamer-Clust для группировки всех последовательностей в файле в кластеры тесно связанных последовательностей. Используйте параметр «расстояние», чтобы определить количество однонуклеотидных мутаций или инделов, которые могут сгруппироваться в кластер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программа FASTAptamer-Clust может быть очень вычислительно затратной, если присутствует большое количество уникальных последовательностей (особенно для ранних раундов), что может занять несколько дней или даже недель для полного завершения. Параметр фильтра отсечки можно использовать для исключения последовательностей с низкой численностью из кластеризации. Как правило, хорошо начинать с более высокого порогового значения, например, 10 или 5 чтений на миллион (RPM), и уменьшать его, если программа завершается быстро. Если пулы очень неоднородны, может оказаться невозможным сгруппировать последовательности в разумные сроки.
    3. Используйте FASTAptamer-Enrich, чтобы вычислить обогащение каждой последовательности, присутствующей более чем в одном раунде выборки. Сравните RPM последовательности из одной популяции с RPM в другой. Используйте программу Enrich для файлов Count или Cluster. На выходе получается файл с разделенными табуляцией значениями (.tsv), который можно открыть в любом программном обеспечении для работы с электронными таблицами для дальнейшего анализа и удобной сортировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программа FASTAptamer-Enrich также может быть очень вычислительно затратной, если присутствует большое количество уникальных последовательностей. Параметр фильтра отсечения можно использовать для исключения последовательностей с низким содержанием из выходных данных, чтобы избежать файлов, которые слишком велики для открытия в программном обеспечении для работы с электронными таблицами.
    4. (Необязательно) Если многие пулы слишком разнородны (много уникальных последовательностей и мало повторяющихся последовательностей), может оказаться невозможным использовать программы Clust или Enrich. В этом случае выполните ручную проверку обогащения с помощью выходного файла Count, который сортирует последовательности по количеству (наиболее распространенный вверху) и переименовывает идентификатор последовательности, чтобы включить важную информацию, такую как RPM.
      1. Используйте стандартную программу Linux «head» для файлов Count, чтобы получить список наиболее распространенных последовательностей. Затем используйте стандартную программу Linux "grep" для поиска каждой из наиболее распространенных последовательностей в файлах Count всех других соответствующих пулов. Если есть какие-либо совпадения, используйте измененный идентификатор последовательности, чтобы определить RPM в этом пуле, чтобы вручную создать сведения о обогащении.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Сценарии для всех этапов анализа секвенирования можно найти в файлах дополнительного кодирования 1-11.

9. Валидация и анализы связывания аптамеров

  1. На основе информации об обогащении, полученной в результате анализа последовательностей, определите последовательности аптамеров-кандидатов на основе последовательностей, которые имеют наибольшее обогащение в последующих раундах отбора и/или наиболее распространенные последовательности в окончательном раунде отбора. Выберите несколько различных последовательностей-кандидатов (по крайней мере, 10-20) для дальнейшего тестирования, поскольку наиболее высокообогащенные не обязательно могут быть наиболее эффективными аптамерами.
  2. Проведите первоначальный скрининг кандидатов на аптамеры с использованием связывающего анализа, который можно быстро выполнить для нескольких образцов. Ультрафильтрационный связывающий анализ36 на основе колонки или связанный с ферментом олигонуклеотидный анализ (ELONA) являются хорошими методами для этого первоначального скрининга.
  3. Проанализируйте специфичность и аффинность последовательностей, которые показывают наилучшую связывающую активность при первоначальном скрининге, используя, по крайней мере, два независимых анализа связывания (например, микромасштабный термофорез (MST)37,38, ферментно-связанный олигонуклеотидный анализ (ELONA)39, поверхностный плазмонный резонанс 40 или биослойная интерферометрия (BLI)41).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Поскольку ДНК-аптамеры могут быть получены с использованием SELEX в пробирке15, эта стратегия SELEX была тщательно разработана, чтобы включить как положительные этапы отбора к интактному, цельному инфекционному вирусу (т.е. сохранить молекулы ДНК, которые связываются с инфекционным вирусом), так и этапы встречного отбора для того же вируса, который был сделан неинфекционным с помощью конкретного метода дезинфекции. в частности, УФ-обработка, путем отказа от последовательностей ДНК, которые могут ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

SELEX позволяет не только идентифицировать аптамеры с высоким сродством, в диапазоне pM-nM 22,43,44,45, но и с высокой и перестраиваемой селективностью. Воспользовавшись встречным отбором, можно получить аптамеров со сложной селективностью. Например, группа Ли продемонстрировала способность получать последовательности, которые могут дифференцировать патогенные бактериальные штаммы от непатоген...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить г-жу Лауру М. Купер и д-ра Лицзюнь Ронга из Иллинойского университета в Чикаго за предоставление образцов псевдовируса, используемых в этом протоколе (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), а также д-ра Альваро Эрнандеса и д-ра Криса Райта из Центра ДНК-услуг Биотехнологического центра Роя Дж. и многие члены группы Lu, которые помогли нам с селекцией in vitro и методами характеристики аптамеров. Эта работа была поддержана грантом RAPID от Национального научного фонда (CBET 20-29215) и начальным грантом от Института устойчивого развития, энергетики и окружающей среды Университета Иллинойса в Урбана-Шампейн и Института Иллинойс-JITRI (JITRI 23965). A.S.P. благодарит Латиноамериканское братство PEW за финансовую поддержку. Мы также благодарим Фонд Роберта А. Уэлча (грант F-0020) за поддержку исследовательской программы группы Лу в Техасском университете в Остине.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% персульфат аммония (APS)BioRad1610700
100% этанолSigma-AldrichE7023
1x PBS без кальция и магнияCorning21-040-CM
40% акриламид/бисакриламид (29:1) растворBioRad1610146
Agencourt AMPure XP БусиныBeckman CoulterA63880ДНК Зачистка шариков - Раздел 7.2.2
Центробежный фильтрующий блок Amicon Ultra-0,5 Центробежный фильтрующий блокMerckUFC501024отсечка 10 кДа
Центробежный фильтрующий блок Amicon Ultra-0,5 Центробежный фильтрMerckUFC510024отсечка 100 кДа
Борная кислотаSigma-Aldrich100165
C1000 Touch Термоамплификатор с двойным модулем быстрой реакции 48/48BioRad1851148
Хлорид кальцияSigma-AldrichC4901
CFX Connect Система обнаружения ПЦР в реальном времениBioRad1855201
цифровые сухие ванны/блочные нагревателиThermo Scientific88870001
Dynabeads MyOne стрептавидин C1Thermo Fisher65001стрептавидин-модифицированные магнитные шарики - раздел 4.9
ЭДТА динатриевая сольSigma-Aldrich
Пробирки для микроцентрифуг Eppendorf Safe-LockSigma-AldrichT96611,5 мл
Lenti-X p24 Rapid Titer KitTakara Bio США, Inc.632200Набор для количественного определения лентивирусов - раздел 3.3.2.1
Разделительный штатив MagJET, 12 пробирок по 1,5 млThermo ScientificMR02
Хлорид магнияSigma-AldrichM8266
Microseal 'B' ПЦР-планшет Герметизирующая пленка, адгезив, оптическийBioRadMSB1001не поглощающий ультрафиолетовое излучение
Mini-PROTEAN Tetra Cell для готового геля сборного железобетонаBioRad1658004EDU
Мини-ПРОТЕАН Короткие планшетыBioRad1653308
Мини-ПРОТЕАН Спейсерные пластины со встроенными прокладками 0,75 ммBioRad1653310
Молекулярная биология Класс ВодаLonza51200
Мультитарелка 96-луночные ПЦР-планшеты, высокопрофильные, без юбки, прозрачныеBioRadMLP9611
Nanodrop OneThermo ScientificND-ONE-W
OneTaq DNA PolymeraseNew England BioLabM0480S
Ovation Ultralow v2 + UDITecan0344NB-A01Набор для подготовки библиотеки секвенирования с высоким желобом - раздел 7.2.
ПИПЕТМАН Г (100-1000 &; L, 20-200 &; L, 2-20 и микро; L и 0,2-2 & микро; L)GilsonF144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Очиститель Logic+ класс II, тип A2 Шкафы биобезопасностиLabconco4261
Qubit dsDNA BR Assay KitInvitrogenQ32850на основе флуоресценции  dsDNA quantification  kit - Раздел 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Tips Pipet Tips (10 мкл, 200 мкл, 1000 мкл)Thomas Scientific1158U43, 1159M44, 1158U40
Ацетат натрияSigma-AldrichS2889
Хлорид натрияSigma-AldrichS7653
Sorvall Legend Micro 17R МикроцентрифугаThermo Scientific75002440
SsoFast EvaGreen SupermixBioRad1725201qPCR mastermix - Раздел 6.2.
Трис(гидроксиметил)аминометанSigma-AldrichT1503
пробирки и ультра прозрачные колпачки, стрипы из 8ПЦР пробирокСШАAB1183
мочевинаSigma-AldrichU5128
324503 научных

Ссылки

  1. Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Central Science. 6 (5), 591-605 (2020).
  2. Ranoa, D. R. E., et al. Saliva-based molecular testing for SARS-CoV-2 that bypasses RNA extraction. bioRxiv. , 1-35 (2020).
  3. Tang, Z., et al. A materials-science perspective on tackling COVID-19. Nature Reviews Materials. 5 (11), 847-860 (2020).
  4. Cook, N., Cliver, D. O. VIRUSES | Detection. Encyclopedia of Food Microbiology. 3, 727-731 (2014).
  5. Weissleder, R., Lee, H., Ko, J., Pittet, M. J. COVID-19 diagnostics in context. Science Translational Medicine. 12 (546), 1-7 (2020).
  6. Joynt, G. M., Wu, W. K. Understanding COVID-19: what does viral RNA load really mean. The Lancet Infectious Diseases. 3099 (20), 19-20 (2020).
  7. Wölfel, R., et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature. 581 (7809), 465-469 (2020).
  8. Perera, R. A. P. M., et al. SARS-CoV-2 virus culture and subgenomic RNA for respiratory specimens from patients with mild coronavirus disease. Emerging Infectious Diseases. 26 (11), 2701-2704 (2020).
  9. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2. JAMA - Journal of the American Medical Association. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  10. Basile, K., et al. Cell-based culture informs infectivity and safe de-isolation assessments in patients with coronavirus disease 2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (9), 2952-2959 (2021).
  11. Xing, H., Hwang, K., Li, J., Torabi, S. -F., Lu, Y. DNA aptamer technology for personalized medicine. Current Opinion in Chemical Engineering. 4, 79-87 (2014).
  12. Xiong, Y., et al. Functional DNA regulated CRISPR-Cas12a sensors for point-of-care diagnostics of non-nucleic-acid targets. Journal of the American Chemical Society. 142 (1), 207-213 (2020).
  13. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  14. Chakraborty, B., et al. Aptamers for viral detection and inhibition. ACS Infectious Diseases. 8 (4), 667-692 (2022).
  15. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chemical Reviews. 109 (5), 1948-1998 (2009).
  16. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1 (10), 1-16 (2017).
  17. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  18. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  19. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
  20. Bruesehoff, P. J., Li, J., Augustine, A. J., Lu, Y. Improving metal ion specificity during in vitro selection of catalytic DNA. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 5 (4), 327-335 (2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angewandte Chemie International Edition. 55 (7), 2431-2434 (2016).
  22. Peinetti, A. S., et al. Direct detection of human adenovirus or SARS-CoV-2 with ability to inform infectivity using DNA aptamer-nanopore sensors. Science Advances. 7 (39), (2021).
  23. Ihms, H. E., Lu, Y. In vitro selection of metal ion-selective DNAzymes. Ribozymes: Methods and Protocols. , 297-316 (2012).
  24. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485(2009).
  25. Cui, Q., et al. Identification of diaryl-quinoline compounds as entry inhibitors of Ebola virus. Viruses. 10 (12), 678(2018).
  26. Guo, Y., et al. Identification of a new region of SARS-CoV S protein critical for viral entry. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 600-605 (2009).
  27. Panec, M., Katz, D. S. Plaque assay protocols. Protocols American Society for Microbiology. 7, 1-5 (2011).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), 1-10 (2014).
  29. Mendoza, E. J., Manguiat, K., Wood, H., Drebot, M. Two detailed plaque assay protocols for the quantification of infectious SARS-CoV-2. Current Protocols in Microbiology. 57 (1), 1-15 (2020).
  30. Luo, Z., He, L., Wang, J., Fang, X., Zhang, L. Developing a combined strategy for monitoring the progress of aptamer selection. The Analyst. 142 (17), 3136-3139 (2017).
  31. Babraham bioinformatics - FastQC a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2022).
  32. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10(2011).
  33. Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. P. E. A. R. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics. 30 (5), 614-620 (2014).
  34. FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2022).
  35. Alam, K. K., Chang, J. L., Burke, D. H. FASTAptamer: A bioinformatic toolkit for high-throughput sequence analysis of combinatorial selections. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4 (3), 230(2015).
  36. McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
  37. Entzian, C., Schubert, T. Mapping the binding site of an aptamer on ATP using MicroScale Thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55070(2017).
  38. Romain, M., Thiroux, B., Tardy, M., Quesnel, B., Thuru, X. Measurement of protein-protein interactions through microscale thermophoresis (MST). Bio-Protocol. 10 (7), 1-10 (2020).
  39. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction. Journal of Visualized Experiments. (132), e57334(2018).
  40. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Analytical Chemistry. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  41. Lou, X., Egli, M., Yang, X. Determining functional aptamer-protein interaction by biolayer interferometry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 67 (1), 7-25 (2016).
  42. Cheng, H., et al. Identification of a coumarin-based antihistamine-like small molecule as an anti-filoviral entry inhibitor. Antiviral Research. 145, 24-32 (2017).
  43. Sun, M., et al. Aptamer blocking strategy inhibits SARS-CoV-2 virus infection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (18), 10266-10272 (2021).
  44. Li, J., et al. Diverse high-affinity DNA aptamers for wild-type and B.1.1.7 SARS-CoV-2 spike proteins from a pre-structured DNA library. Nucleic Acids Research. 49 (13), 7267-7279 (2021).
  45. Zhang, L., et al. Discovery of sandwich type COVID-19 nucleocapsid protein DNA aptamers. Chemical Communications. 56 (70), 10235-10238 (2020).
  46. Hamula, C. L. A., et al. An improved SELEX technique for selection of DNA aptamers binding to M-type 11 of Streptococcus pyogenes. Methods. 97, 51-57 (2016).
  47. Liu, J., Lu, Y. Rational design of "turn-on" allosteric DNAzyme catalytic beacons for aqueous mercury ions with ultrahigh sensitivity and selectivity. Angewandte Chemie International Edition. 46 (40), 7587-7590 (2007).
  48. Liu, J., Mazumdar, D., Lu, Y. A simple and sensitive "dipstick" test in serum based on lateral flow separation of aptamer-linked nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 45 (47), 7955-7959 (2006).
  49. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nature Chemistry. 3 (9), 697-703 (2011).
  50. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  51. Li, N., et al. Overcoming the limitations of COVID-19 diagnostics with nanostructures, nucleic acid engineering, and additive manufacturing. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 26, 100966(2022).
  52. Li, N., et al. Label-free digital detection of intact virions by enhanced scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (4), 1498-1502 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SELEX

Похожие статьи