Методическая статья

Фосфолипидный медиатор индуцированная трансформация в трехмерных культурах

DOI:

10.3791/64146

⸱

27 июля 2022 г.

 ,  ,  , 
1Biology Department, Indian Institute of Science Education and Research, 2Department of Biology, Center for Genomics and Systems Biology, New York University, 3Enveda Therapeutics India Pvt Ltd.

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол описывает создание 3D-культур «сверху» нетрансформированной эпителиальной клеточной линии молочной железы MCF10A, которая была модифицирована для изучения трансформации, вызванной активирующим фактором тромбоцитов (PAF). Иммунофлуоресценция была использована для оценки трансформации и подробно обсуждается.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для изучения рака было разработано несколько моделей, таких как модели грызунов и установленные клеточные линии. Ценная информация о канцерогенезе была получена в результате исследований с использованием этих моделей. Клеточные линии обеспечили понимание дерегуляции молекулярной сигнализации, связанной с опухолевым генезом молочной железы, в то время как модели грызунов широко используются для изучения клеточных и молекулярных характеристик рака молочной железы in vivo. Создание 3D-культур эпителиальных и раковых клеток молочной железы помогает преодолеть разрыв между моделями in vivo и in vitro , имитируя условия in vivo in vitro. Эта модель может быть использована для понимания дерегуляции сложных молекулярных сигнальных событий и клеточных характеристик во время канцерогенеза молочной железы. Здесь система 3D-культур модифицируется для изучения фосфолипидной медиатор-индуцированной (активирующий фактор тромбоцитов, PAF) трансформации. Иммуномодуляторы и другие секретируемые молекулы играют важную роль в инициации и прогрессировании опухоли в молочной железе. В настоящем исследовании 3D-ацинарные культуры эпителиальных клеток молочной железы подвергаются воздействию проявленных характеристик трансформации PAF, таких как потеря полярности и измененные клеточные характеристики. Эта система 3D-культур поможет пролить свет на генетические и / или эпигенетические возмущения, вызванные различными мелкомолекулярными образованиями в микроокружении опухоли. Кроме того, эта система также обеспечит платформу для идентификации новых, а также известных генов, которые могут быть вовлечены в процесс трансформации.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для изучения прогрессирования рака доступно множество моделей, каждая из которых уникальна и представляет собой подтип этого сложного заболевания. Каждая модель предоставляет уникальную и ценную информацию о биологии рака и улучшает средства для имитации фактического состояния заболевания. Установленные клеточные линии, выращенные как монослой, предоставили ценную информацию о жизненно важных процессах in vitro, таких как пролиферация, инвазивность, миграция и апоптоз1. Хотя двумерная (2D) клеточная культура была традиционным инструментом для исследования реакции клеток млекопитающих на несколько возмущений окружающей среды, экстраполяция этих результатов для прогнозирования реакций на тканевом уровне не кажется достаточно убедительной. Основным ограничением 2D-культур является то, что создаваемая микросреда в значительной степени отличается от микросреды самой ткани молочной железы2. 2D культуре не хватает взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом, что жизненно важно для роста любой ткани. Кроме того, силы растяжения, испытываемые клеткой в монослойных культурах, препятствуют полярности этих клеток, тем самым изменяя передачу сигналов и поведение клеток 3,4,5. Трехмерные (3D) системы культур открыли новый путь в области исследований рака с их способностью имитировать условия in vivo in vitro. Многие важные микроокружательные сигналы, которые теряются в 2D-культуре клеток, могут быть восстановлены с использованием 3D-культур богатого ламинином внеклеточного матрикса (lrECM)6.

Различные исследования выявили значение микроокружения опухоли в канцерогенезе 7,8. Факторы, связанные с воспалением, являются основной частью микросреды. Активирующий фактор тромбоцитов (PAF) является фосфолипидным медиатором, секретируемым различными иммунными клетками, который опосредует множественные иммунные реакции 9,10. Высокие уровни PAF секретируются различными клеточными линиями рака молочной железы и связаны с усиленной пролиферацией11. Исследования из нашей лаборатории показали, что длительное присутствие PAF в ацинарных культурах приводит к трансформации эпителиальных клеток молочной железы12. PAF активирует PAF-рецептор (PAFR), активируя сигнальную ось13 PI3K/Akt. Также сообщается, что PAFR связан с EMT, инвазией и метастазированием14.

Настоящий протокол демонстрирует модельную систему для изучения PAF-индуцированной трансформации с использованием 3D-культур эпителиальных клеток молочной железы, как было ранее описано Chakravarty et al.12. Эпителиальные клетки молочной железы, выращенные на внеклеточном матриксе (3D-культуры), имеют тенденцию образовывать поляризованные сфероиды, остановленные ростом. Они называются ацинами и очень напоминают ацины ткани молочной железы, наименьшую функциональную единицу молочной железы, in vivo15. Эти сфероиды (фиг.1А,В) состоят из монослоя плотно упакованных поляризованных эпителиальных клеток, окружающих полый просвет и прикрепленных к базальной мембране (фиг.1С). Этот процесс морфогенеза хорошо описан в литературе16. При посеве на lrECM клетки подвергаются делению и дифференцировке, образуя кластер клеток, которые затем поляризуются с 4-го дня. К 8-му дню ацины состоят из группы поляризованных клеток, которые находятся в прямом контакте с внеклеточным матриксом и скопления неполяризованных клеток, заключенных во внешние поляризованные клетки, без контакта с матрицей. Известно, что эти неполяризованные клетки подвергаются апоптозу на 12-й день культуры, образуя полый просвет. К 16-му дню формируется16 структур, остановленных ростом.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Ядра клеток в ацини, окрашенные ядерным пятном. (А) 3D конструкция ацини. (B) Фазоконтрастное изображение ацини MCF10A, выращенное на Matrigel в течение 20 дней. (C) Самая центральная секция показывает наличие полого просвета. Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В отличие от 2D-культур, ацинарные культуры помогают различать нормальные и трансформированные клетки через очевидные изменения морфологии. Нетрансформированные эпителиальные клетки молочной железы образуют ацинус с полым просветом, имитируя нормальные ацины молочной железы человека. Эти сфероиды при трансформации показывают нарушенную морфологию, характеризующуюся значительной потерей полярности (одним из признаков рака), отсутствием просвета или нарушением полого просвета (из-за уклонения от апоптоза), что может быть вызвано дерегуляцией различных генов 17,18,19,20 . Эти превращения могут быть изучены с использованием широко используемых методов, таких как иммунофлуоресценция. Таким образом, модель 3D-культуры клеток может функционировать как простой метод исследования процесса ацинарного морфогенеза молочной железы и канцерогенеза молочной железы. Создание системы 3D-культур для понимания эффекта медиатора фосфолипидов, PAF, поможет в высокопроизводительном доклиническом скрининге лекарств.

Эта работа адаптировала протокол 3D «на вершине» культуры 16,21 для изучения трансформации, вызванной PAF22. Фенотипические изменения, вызванные воздействием ацинумов на медиатор фосфолипидов, изучали с использованием иммунофлуоресценции. В исследовании использовались различные маркеры полярности и эпителиального перехода в мезенхимальный переход (ЭМТ) 12,16. В таблице 1 упоминается их нормальная локализация и ожидаемый фенотип при трансформации.

АнтителаЗнакиНормальная локализацияТрансформированный фенотип
α6-ИнтегринБазолатеральБазальный со слабым боковым пятномСильное боковое / апикальное пятно
β-КатенинКлеточно-клеточный переходБазолатеральАномальная / ядерная или цитоплазматическая локализация
ВиментинЭМТОтсутствующее/слабое присутствиеАп-регулирование

Таблица 1: Маркеры, использованные в исследовании. Используются различные маркеры с их локализацией при наличии и отсутствии лечения ПАФ.

Этот метод может быть наилучшим образом использован для изучения / скрининга правдоподобных лекарств и генов-мишеней для различных подтипов рака молочной железы. Это может обеспечить данные о реакции на лекарства ближе к сценарию in vivo , помогая в более быстрой и надежной разработке лекарств. Также эта система может быть использована для изучения молекулярной сигнализации, связанной с лекарственной реакцией и лекарственной устойчивостью.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Посев клеток MCF10A в lrECM

  1. Поддерживать клетки MCF10A (адгезивные эпителиальные клетки молочной железы) в питательной среде. Проходите клетки каждые 4 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав питательной среды: высокая глюкоза DMEM без пирувата натрия, содержащая конскую сыворотку (5%), инсулин (10 мкг/мл), гидрокортизон (0,5 мкг/мл), эпидермальный фактор роста, EGF (20 нг/мл), холерного токсина (100 нг/мл) и пенициллин-стрептомицин (100 ед/мл) (см. Таблицу материалов).
  2. Оттаивание lrECM (см. Таблицу материалов) на льду за 20 мин до начала эксперимента. Днем посева клеток обычно считается День 0.
  3. Для трипсинизации клеток аспирируют среду и промывают 2 мл PBS. Добавьте 900 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубируйте при 37 °C в течение ~ 15 мин или до полного трипсинизации клеток.
  4. Подготовьте слой lrECM в восьми колодцах камерного покровного стекла (см. Таблицу материалов).
    1. Когда клетки трипсинизируются, покройте каждую лунку 60 мкл lrECM и поместите ее в инкубатор CO2 с температурой 37 °C максимум на 15 минут.
  5. Подготовьте клеточную суспензию, выполнив следующие действия.
    1. После полного смещения клеток добавляют 5 мл среды повторной суспензии для подавления активности трипсина и вращают клетки при 112 х г в течение 10 мин при 25 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состав среды повторной суспензии: ДМЭМ с высоким содержанием глюкозы без пирувата натрия, дополненный конской сывороткой (20%) и пенициллин-стрептомицином (100 ЕД/мл).
    2. Аспирировать отработанную среду и повторно суспендировать клетки в 2 мл пробирной среды. Хорошо перемешайте суспензию, чтобы обеспечить образование одноклеточной суспензии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состав исследуемой среды: высокий уровень глюкозы DMEM без пирувата натрия, дополненный конской сывороткой (2%), гидрокортизоном (0,5 мкг/мл), холерным токсином (100 нг/мл), инсулином (10 мкг/мл) и пенициллин-стрептомицином (100 ед/мл).
    3. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимый для посева 6 х 103 клеток в каждую лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно предпочтительно включать в расчет одну дополнительную скважину для учета любых ошибок пипетирования.
    4. В зависимости от количества необходимых лунок разбавляют клеточную суспензию в накладной среде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состав накладной среды для одной скважины выглядит следующим образом: 400 мкл пробирной среды, 8 мкл lrECM (2% финала) и 0,02 мкл 100 мкг/мл EGF (5 нг/мл финала).
  6. Выполните посев клеток.
    1. Добавьте 400 мкл разбавленной клеточной суспензии к подготовленным слоям lrECM (этап 1.4), тщательно следя за тем, чтобы не нарушить слой lrECM. Инкубировать при 37 °C в увлажненном 5% CO2 инкубаторе.

2. Лечение PAF

  1. Добавляют PAF 3 ч после посева клеток. Подготовьте 100 мкМ запас PAF в PBS и добавьте необходимый объем 0,2 мкл в каждую скважину (что соответствует 200 нМ).
  2. Добавляйте одинаковую концентрацию PAF при каждом изменении мультимедиа.

3. Повторное кормление свежими носителями

  1. Пополняйте клетки свежей средой каждые 4 дня (т.е. День 4, День 8, День 12 и День 16).

4. Иммунофлуоресцентное исследование для выявления фенотипических изменений, вызванных длительным воздействием PAF

  1. После 20 дней культивирования тщательно вытрите среду из каждой скважины и промывайте скважины 400 мкл предварительно подогретой ПБС.
  2. Зафиксируйте ацинарные структуры, добавив 400 мкл 4% параформальдегида (свежеприготовленного путем разбавления 16% параформальдегида в 1x PBS) и инкубации в течение 20 мин при комнатной температуре.
  3. Промыть скважины один раз ледяным PBS и пермеабилизировать PBS, содержащим 0,5% Triton X-100 в течение 10 мин при 4 °C.
  4. Через 10 мин немедленно, но осторожно вылейте раствор Triton-X 100 и промойте 400 мкл PBS-глицина (свежеприготовленного путем добавления щепотки глицина в 1x PBS). Это повторяется трижды в течение 15 минут каждый.
  5. Добавьте 400 мкл первичного блокирующего раствора, содержащего 10% козью сыворотку (см. Таблицу материалов) в буфер иммунофлуоресценции (ИФ) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 60 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав буфера ПЧ: 0,05% азида натрия, 0,1% BSA, 0,2% Triton-X 100 и 0,05% Tween (20 в 1 PBS).
  6. Удаляют первичный блокирующий раствор, добавляют 200 мкл 2% вторичного блокирующего антитела (F(ab')2 фрагмента антитела, выращенного у козы против мышиного антигена, см. Таблицу материалов), приготовленного в первичном блокирующем растворе, и оставляют его на 45-60 мин при комнатной температуре.
  7. Получают первичное антитело (см. Таблицу материалов) в 2% растворе вторичного блокирующего антитела в разведении 1:100. После удаления вторичного блокирующего раствора добавляют свежеприготовленное антитело и инкубируют в течение ночи при 4 °C.
  8. Предыдущая стадия может вызвать сжижение базальной мембраны. Прежде чем приступить к эксперименту, подождите, пока слайд не достигнет комнатной температуры. Осторожно пипетку раствора первичного антитела и трижды промыть его 400 мкл буфера ПЧ.
  9. Во время последней промывки буфером ПЧ готовят разведение флуорофорно-конъюгированного вторичного антитела (см. Таблицу материалов) в первичном блокирующем растворе в 1:200. Инкубируют слайды во вторичном растворе антител в течение 40-60 мин при комнатной температуре.
  10. Промойте слайды 400 мкл буфера ПЧ в течение 20 минут, затем две промывки PBS в течение 10 минут каждая.
  11. Противопоставлять ядра ПБС, содержащим 0,5 нг/мл ядерного пятна (см. Таблицу материалов) в течение 5-6 мин при комнатной температуре. Трижды вымойте слайды 400 мкл PBS, чтобы удалить лишние пятна.
  12. Аккуратно выложите всю PBS и обеспечьте удаление остаточного раствора. Добавьте одну каплю монтажного реагента (см. Таблицу материалов) в каждую лунку и дайте ей постоять при комнатной температуре в течение ночи.
  13. Храните слайды при комнатной температуре и изображения слайдов как можно скорее.
  14. Изображение под 40-кратным или 63-кратным увеличением на конфокальном микроскопе (см. Таблицу материалов), с получением оптических Z-сечений шагом 0,6 мм (NA = 1,4).
  15. Откройте полученные изображения с помощью программного обеспечения для обработки изображений (см. Таблицу материалов). Продемонстрируйте морфологические различия с помощью 3D-проекций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Самое центральное оптическое Z-сечение лучше всего использовать для отображения различий в локализации маркеров полярности. Они могут быть количественно определены вручную, чтобы представить процент сфероидов, показывающих этот конкретный рисунок окрашивания.
  16. Чтобы проиллюстрировать различия в экспрессии белков, выполните полуколичественный анализ, измеряя среднее значение серого цвета или вычисляя скорректированную общую флуоресценцию клеток (CTCF)23. Представьте данные в виде скрипичных или точечных графиков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки MCF10A при воздействии лечения PAF образуют ацинарные структуры с очень отчетливыми фенотипами. Было обнаружено, что α6-интегрин неправильно локализован с более апикальным окрашиванием. Некоторые ацины также показали прерывистое окрашивание (рисунок 2А). Оба этих фенотипа указывают на потерю базальной полярности, о чем свидетельствует литература 24,25. Более ранние сообщения указывают на спорную роль α6-интегрина в метастазиро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Установленные модели на основе клеточных линий широко используются для изучения процесса канцерогенеза. Однослойные культуры клеток продолжают давать представление о различных молекулярных сигнальных путях, которые опосредуют характерные изменения в раковых клетках32. Исследования роли хорошо известных онкогенов, таких как Ras, Myc и мутированный p53, были впервые зарегистрированы с использованием однослойных культур в качестве модельной системы 33,34,35,36

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии потенциальных конфликтов интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Центр микроскопии IISER в Пуне за доступ к оборудованию и инфраструктуре и поддержку экспериментов. Это исследование было поддержано грантом Департамента биотехнологии (DBT), правительства Индии (BT/PR8699/MED/30/1018/2013), Совета по научным и инженерным исследованиям (SERB), правительства Индии (EMR/2016/001974) и частично финансированием IISER, Pune Core. A.K. финансировался стипендией CSIR-SRF, L.A. финансировался через стипендию DST-INSPIRE, V.C финансировался DBT (BT/PR8699/MED/30/1018/2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05% Трипсин ЭДТАИнвитроген25300062
16% параформальдегидАльфа АэсарAA433689M
Анти Мышь Alexa Мука 488ИнвитрогенA11029
Антикролик Алекса Мука 488ИнвитрогенA-11008
BSASigmaA7030
Камерный покровный стаканNunc
Холерный токсинSigmaC8052-1MG1 мг/мл в dH2O
Конфокальный микроскопLeicaLeica SP8
DMEMGibco11965126
EDTASigmaE6758
EGFSigmaE9644-0,2MG100 мг/мл в dH2O
F(ab')2 фрагмента антитела, выращенного у козы против мышиного антигенаJackson Immunoresearch115-006-006
GM130 антителоAbcamab52649
Сыворотка для козAbcamab7481
HoechstInvitrogen33258
Сыворотка для лошадейGibco16050122
гидрокортизонSigmaH08881 мг/мл в этаноле
Программное обеспечение для обработки изображенийImageJ
ИнсулинSigmaI188210 мг/мл сток dH2O
lrECM (Matrigel)Corning356231
Монтажный реагент (Slow fade Gold Anti-fade)InvitrogenS36937
Nuclear Stain  (Хёхст)Invitrogen33258
PAFCayman Chemicals91575-58-5Метилкарбамил PAF C-16, закуплен в виде 10 мг/мл в этаноле
Пенициллин-стрептомицинLonza17-602E
Азид натрияSigmaS2002
Трис ОснованиеSigmaB9754
Triton X-100SigmaT8787
Tween 20SigmaP9416
антитело к виментинуAbcamab92547
α 6-интегриновое антителоMilliporeMAB1378
155409

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Research and Treatment. 83 (3), 249-289 (2004).
  2. Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
  3. Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
  4. Streuli, C. H., Bailey, N., Bissell, M. J. Control of mammary epithelial differentiation: basement membrane induces tissue-specific gene expression in the absence of cell-cell interaction and morphological polarity. Journal of Cell Biology. 115 (5), 1383-1395 (1991).
  5. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
  6. Bissell, M. J., Kenny, P. A., Radisky, D. C. Microenvironmental regulators of tissue structure and function also regulate tumor induction and progression: the role of extracellular matrix and its degrading enzymes. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 70, 343-356 (2005).
  7. Heinrich, E. L., et al. The inflammatory tumor microenvironment, epithelial mesenchymal transition and lung carcinogenesis. Cancer Microenvironment. 5 (1), 5-18 (2012).
  8. Gonda, T. A., Tu, S., Wang, T. C. Chronic inflammation, the tumor microenvironment and carcinogenesis. Cell Cycle. 8 (13), 2005-2013 (2009).
  9. Berdyshev, E. V., Schmid, P. C., Krebsbach, R. J., Schmid, H. H. Activation of PAF receptors results in enhanced synthesis of 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in immune cells. The FASEB Journal. 15 (12), 2171-2178 (2001).
  10. Rola-Pleszczynski, M., Stankova, J. Cytokine gene regulation by PGE(2), LTB(4) and PAF. Mediators of Inflammation. 1 (2), 5-8 (1992).
  11. Bussolati, B., et al. PAF produced by human breast cancer cells promotes migration and proliferation of tumor cells and neo-angiogenesis. The American Journal of Pathology. 157 (5), 1713-1725 (2000).
  12. Chakravarty, V., et al. Prolonged exposure to platelet activating factor transforms breast epithelial cells. Frontiers in Genetics. 12, 634938(2021).
  13. Chen, J., et al. Platelet-activating factor receptor-mediated PI3K/AKT activation contributes to the malignant development of esophageal squamous cell carcinoma. Oncogene. 34 (40), 5114-5127 (2015).
  14. Chen, J., et al. Feed-forward reciprocal activation of PAFR and STAT3 regulates epithelial-mesenchymal transition in non-small cell lung cancer. Cancer Research. 75 (19), 4198-4210 (2015).
  15. Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods in Molecular Biology. 945, 193-219 (2013).
  16. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  17. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  18. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  19. Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 9 (4), 297-310 (2004).
  20. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochemistry and Cell Biology. 74 (6), 833-851 (1996).
  21. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  22. Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells. BMC Cancer. 14, 287(2014).
  23. Banerjee, A., et al. A rhodamine derivative as a "lock" and SCN− as a "key": visible light excitable SCN− sensing in living cells. Chemical Communications. 49 (25), 2527-2529 (2013).
  24. Ren, G., et al. Reduced basal nitric oxide production induces precancerous mammary lesions via ERBB2 and TGFbeta. Scientific Reports. 9 (1), 6688(2019).
  25. Anandi, L., Chakravarty, V., Ashiq, K. A., Bodakuntla, S., Lahiri, M. DNA-dependent protein kinase plays a central role in transformation of breast epithelial cells following alkylation damage. Journal of Cell Science. 130 (21), 3749-3763 (2017).
  26. Sonnenberg, A., et al. Integrin alpha 6/beta 4 complex is located in hemidesmosomes, suggesting a major role in epidermal cell-basement membrane adhesion. Journal of Cell Biology. 113 (4), 907-917 (1991).
  27. Pignatelli, M., Cardillo, M. R., Hanby, A., Stamp, G. W. Integrins and their accessory adhesion molecules in mammary carcinomas: loss of polarization in poorly differentiated tumors. Human Pathology. 23 (10), 1159-1166 (1992).
  28. Natali, P. G., et al. Changes in expression of alpha 6/beta 4 integrin heterodimer in primary and metastatic breast cancer. British Journal of Cancer. 66 (2), 318-322 (1992).
  29. Davis, T. L., Cress, A. E., Dalkin, B. L., Nagle, R. B. Unique expression pattern of the alpha6beta4 integrin and laminin-5 in human prostate carcinoma. Prostate. 46 (3), 240-248 (2001).
  30. Liu, J. S., Farlow, J. T., Paulson, A. K., Labarge, M. A., Gartner, Z. J. Programmed cell-to-cell variability in Ras activity triggers emergent behaviors during mammary epithelial morphogenesis. Cell Reports. 2 (5), 1461-1470 (2012).
  31. Liu, C. Y., Lin, H. H., Tang, M. J., Wang, Y. K. Vimentin contributes to epithelial-mesenchymal transition cancer cell mechanics by mediating cytoskeletal organization and focal adhesion maturation. Oncotarget. 6 (18), 15966-15983 (2015).
  32. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures-a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  33. Schulze, A., Lehmann, K., Jefferies, H. B., McMahon, M., Downward, J. Analysis of the transcriptional program induced by Raf in epithelial cells. Genes & Development. 15 (8), 981-994 (2001).
  34. McCarthy, S. A., Samuels, M. L., Pritchard, C. A., Abraham, J. A., McMahon, M. Rapid induction of heparin-binding epidermal growth factor/diphtheria toxin receptor expression by Raf and Ras oncogenes. Genes & Development. 9 (16), 1953-1964 (1995).
  35. Willis, A., Jung, E. J., Wakefield, T., Chen, X. Mutant p53 exerts a dominant negative effect by preventing wild-type p53 from binding to the promoter of its target genes. Oncogene. 23 (13), 2330-2338 (2004).
  36. Haupt, S., Raghu, D., Haupt, Y. Mutant p53 drives cancer by subverting multiple tumor suppression pathways. Frontiers in Oncology. 6, 12(2016).
  37. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).
  38. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  39. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  40. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).
  41. Saraiva, D. P., Matias, A. T., Braga, S., Jacinto, A., Cabral, M. G. Establishment of a 3D co-culture with MDA-MB-231 breast cancer cell line and patient-derived immune cells for application in the development of immunotherapies. Frontiers in Oncology. 10, 1543(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи