Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В городе Виво Обнаружение сосудистой проницаемости в подчелюстной железе мыши

2.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64167

⸱

4 августа 2022 г.

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pathophysiology, Peking University School of Basic Medical Sciences, Key Laboratory of Molecular Cardiovascular Sciences, Ministry of Education, and Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Peking University School and Hospital of Stomatology & National Center of Stomatology & National Clinical Reseah Center for Oral Diseases & National Engineering Research Center of Oral Biomaterials and Digital Medical Devices, 3State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Peking University

В этой статье

Краткое содержание

В настоящем протоколе эндотелиальную барьерную функцию подчелюстной железы (SMG) оценивали путем введения различных молекулярно-взвешенных флуоресцентных индикаторов в угловые вены моделей испытуемых животных in vivo под двухфотонным лазерно-сканирующим микроскопом.

Аннотация

Слюна играет важную роль в здоровье полости рта и в целом. Интактная эндотелиальная барьерная функция кровеносных сосудов обеспечивает секрецию слюны, тогда как дисфункция эндотелиального барьера связана со многими нарушениями секрета слюнных желез. Настоящий протокол описывает метод обнаружения параклеточной проницаемости in vivo для оценки функции эндотелиальных плотных соединений (TJ) в подчелюстных железах мыши (SMG). Во-первых, флуоресцентно меченый декстранс с различной молекулярной массой (4 кДа, 40 кДа или 70 кДа) вводили в угловые вены мышей. После этого односторонний SMG был рассечен и зафиксирован в индивидуальном держателе под двухфотонным лазерным сканирующим микроскопом, а затем были получены изображения для кровеносных сосудов, ацинушек и протоков. Используя этот метод, в режиме реального времени контролировалась динамическая утечка индикаторов различного размера из кровеносных сосудов в базальные стороны ацину и даже через ацинарное эпителие в протоки для оценки изменения функции эндотелиального барьера в физиологических или патофизиологических условиях.

Введение

Различные слюнные железы вырабатывают слюну, которая в первую очередь выступает в качестве первой линии защиты от инфекций и помогает пищеварению, тем самым играя существенную роль в здоровье полости рта и в целом1. Кровоснабжение имеет решающее значение для секреции слюнных желез, поскольку оно постоянно обеспечивает воду, электролиты и молекулы, которые образуют первичную слюну. Эндотелиальная барьерная функция, регулируемая комплексом плотного соединения (TJ), строго и деликатно ограничивает проникновение капилляров, которые хорошо проницаемы для воды, растворенных веществ, белков и даже клеток, движущихся из циркулирующих кровеносных сосудов в ткани слюнной железы 2,3. Ранее мы обнаружили, что открытие эндотелиальных TJ в ответ на холинергический стимул облегчает секрецию слюны, тогда как нарушение эндотелиальной барьерной функции взаимосвязано с гипосекрецией и лимфоцитарной инфильтрацией в подчелюстных железах (SMG) при синдроме Шегрена4. Эти данные свидетельствуют о том, что вкладу эндотелиальной барьерной функции необходимо уделять достаточно внимания в отношении различных заболеваний слюнных желез.

Двухфотонный лазерно-сканирующий микроскоп является мощным инструментом для наблюдения за динамикой клеток в интактной ткани in vivo. Одним из преимуществ этого метода является то, что ближний инфракрасный свет (NIR) имеет более глубокое проникновение в ткани, чем видимый или ультрафиолетовый свет, когда образцы возбуждаются NIR и не вызывает очевидного светового повреждения тканей при соответствующих условиях 5,6. Действительно, слюнные железы представляют собой очень однородную и поверхностную ткань, в которой поверхностные ацинарные клетки находятся всего на расстоянии около 30 мкм от поверхности железы 7,8. Показано, что прижизненная конфокальная микроскопия может изучать экзокринную секрецию и актиновый цитоскелет в живых слюнных железах мыши при субклеточном разрешении8. Двухфотонная лазерно-сканирующая микроскопия, тем не менее, не только имеет преимущество обычной конфокальной микроскопии, но и может быть использована для более глубокого обнаружения ткани и изображения более четко. Здесь флуоресцентно-меченые декстрансы, которые часто используются в качестве индикаторов параклеточной проницаемости и имеют преимущество различных размеров, могут быть использованы для проверки величиныпоры TJ 9. В настоящем исследовании установлен метод прижизненной двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии в реальном времени для оценки in situ эндотелиальной барьерной функции у мышей SMG. Каждый этап работы по обнаружению проницаемости сосудов in vivo в SMG мыши описан в текущем протоколе. Вот пример обнаружения эндотелиальной барьерной функции в модели лигирования протоков SMG мыши.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по этике исследований на животных, Научным центром здравоохранения Пекинского университета, и соответствовали Руководству по уходу за лабораторными животными и их использованию (публикация NIH No 85-23, пересмотрена в 1996 году). Для настоящего исследования использовались самцы мышей дикого типа (WT) в возрастной группе 8-10 недель. Подопытных животных тщательно обрабатывали, чтобы свести к минимуму их боль и дискомфорт.

1. Процедуры для животных

  1. Подготовьте и введите анестетики и индикаторы.
    1. Поддерживать стерильные условия на протяжении всего исследования и стерилизовать инструменты путем автоклавирования. Разделите мышей на две группы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольную группу оставили без лечения, а другую группу с односторонним перевязкой протоков SMG в течение 1 дня служили экспериментальной группой. При группировке нужно отбирать мышей со схожей массой тела и возрастом, чтобы уменьшить влияние веса и возраста на проницаемость сосудов.
    2. Выберите подходящие индикаторы, такие как флуоресцеин изотиоцианат (FITC), меченый декстраном (молекулярная масса: 4 кДа; FD4) и родамин B-меченый декстран (молекулярная масса: 70 кДа; RD70) (см. Таблицу материалов) с различными спектрами возбуждения/излучения для минимизации помех между флуоресцентными сигналами (с использованием фильтра FITC или родамина B, соответственно) для анализа проницаемости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длины волн возбуждения FD4 и RD70 составляют 488 нм и 594 нм соответственно, а выбранные длины волн излучения составляют 511-564 нм и 617-669 нм соответственно.
    3. Разбавьте индикаторы в стерильном фосфатно-буферном физиологическом растворе (1x PBS) в запасы 100 мг/мл и храните аликвоты, защищенные от света, при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Декстран с молекулярной массой, такой как 4 кДа, будет быстро просачиваться из крови в мышиных SMG даже без патологических состояний10.
    4. Внутрибрюшинно вводят трибромэтанол (доза для мыши весом 25 г составляла около 600 мкл) для анестезии мышей. Обеспечьте анальгезию в соответствии с рекомендациями местного комитета по этике животных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После введения анестезии используйте ветеринарную мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость. Хорошо ухаживайте за животными11. Подождите, пока мышь не выдержит механическую стимуляцию, например, защемление пальца ноги без двигательной реакции.
    5. Вводят смесь двух индикаторов параклеточной проницаемости с разной молекулярной массой (FD4 и RD70) в угловую вену (0,5 мг/г массы тела). Вводят в каждую мышь смесь 100 мкл индикаторного раствора, причем 50 мкл каждого красителя смешивают в соотношении 1:1.
      1. После анестезии осторожно удерживайте голову и шею мыши, чтобы одна сторона глазного яблока слегка выступала. Вставьте инсулиновый шприц, содержащий флуоресцентные индикаторы (будьте осторожны, чтобы не вводить воздух в шприц) вдоль угла глаза под прямым углом к глазу.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если угловая вена вставлена правильно, раствор красителя будет легко введен в вену, и во время инъекции не будет сопротивления. Кроме того, инъекция хвостовой вены у мышей также может быть кандидатом на внутривенное введение молекул индикатора.
  2. Выполните изоляцию SMG, выполнив следующие действия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильные инструменты, в том числе тканевые ножницы и сепарационные никели, для операции.
    1. Отделите одностороннюю железу тщательно, чтобы не повредить окружающие кровеносные сосуды и нервы под стереоскопическим микроскопом.
      1. После инъекции индикаторов параклеточной проницаемости быстро поместите мышей на картон и поместите их в лежачее положение с заклеенными конечностями и головами. Нанесите крем для удаления волос на кожу шеи, чтобы удалить волосы мыши. Используйте 75% этанола для дезинфекции кожи перед операцией.
      2. Затем под стереомикроскопом разрезают эпидермис шеи общими тканевыми ножницами, чтобы обнажить обе стороны СМГ (правая железа лечилась в этом эксперименте). Затем используйте тупое отделение тканей никеля (см. Таблицу материалов), чтобы аккуратно отделить капсулу от поверхности железы, заботясь о том, чтобы не повредить ткань железы и кровеносные сосуды.
      3. Отделите капсулу от поверхности железы, не повреждая железистую структуру. Кроме того, убедитесь, что весь процесс удержания и разделения желез мышей выполняется в течение 10 минут.

2. Настройка двухфотонного микроскопа

  1. Подключите настроенный держатель к устройству отрицательного давления и заранее проверьте, правильно ли достигнут эффект отрицательного давления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель имеет форму миниатюрного увеличительного стекла с плоским куском круглого стекла в центре (диаметр: 4,32 мм, рисунок 1). Устройство отрицательного давления было спроектировано внутри компании таким образом, что держатель соединен с резиновой трубкой, которая связана с дренажной бутылкой, а бутылка прикреплена к регулятору отрицательного давления через короткую резиновую трубку. Таким образом, контроллер отрицательного давления может регулировать давление, чтобы гарантировать, что ткань всасывается в держатель.
    1. Соедините одну сторону держателя с устройством отрицательного давления. Чтобы проверить, является ли устройство отрицательного давления неповрежденным и подходящим, переверните держатель вверх дном, добавьте каплю воды и установите значение отрицательного давления равным 20 единицам. Если вода полностью и быстро всасывается, устройство отрицательного давления успешно устанавливается с держателем.
  2. Осторожно поместите открытый SMG мыши на настроенный держатель и всасывайте ткань путем всасывания отрицательного давления как можно дальше от тела мыши, чтобы уменьшить артефакты движения, вызванные дыханием и другими условиями.
  3. Изобразите вспомогательный материал, прикрепленный к сальнику под водомерным объективом 25x/NA 1.0 (специально для NIR).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте вертикальный двухфотонный микроскоп (см. Таблицу материалов) в этом эксперименте. Кровеносные сосуды должны быть видны сразу с явной флуоресценцией после инъекции индикатора.

3. Визуализация сосудов и обнаружение проницаемости

  1. Начать визуализацию вскоре после того, как был выбран вид железы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, временные ряды из 45-50 изображений за 20 с или более обычно захватываются в зависимости от экспериментального проекта.
  2. Получайте последовательные изображения вдоль оси Z, расположенной на расстоянии 2 мкм друг от друга, от поверхности железы до 70-140 мкм в ткань для создания трехмерной (3D) конструкции.
  3. Получите покадровую визуализацию сосудов для измерения проницаемости сосудов в SMG.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установите условия меню программы следующим образом после запуска программного обеспечения микроскопа (см. Таблицу материалов).
    1. В диалоговом окне Проводник нажмите кнопку Добавить новую папку и измените имя файла.
    2. Вернитесь к столбцу Приобретение . В XY формат равен 512 x 512, а скорость — 400 Гц. Включите двунаправленный X .
    3. Установите коэффициент Масштабирования равным 0,75 и 1,5 для Zoom.
    4. Чтобы получить покадровое изображение, выберите xyt в разделе Режим получения. Установите продолжительность на 20 с, 30 мин или дольше в соответствии с экспериментальной потребностью.
    5. Чтобы сделать 3D-конструкцию, установите режим получения на xyz. Размер Z-Step может быть установлен в соответствии с фактической ситуацией.
    6. После установки условий нажмите на Live , чтобы наблюдать за сосудистой визуализацией двух каналов и перекрывающихся каналов в фотообразующей рамке и выберите интересующие области.
    7. Нажмите кнопку Пуск , чтобы начать создание образа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь не должна оставаться без присмотра во время процесса визуализации под наркозом.

4. Анализ данных

  1. Для оценки проницаемости сосудов используйте программное обеспечение Image J для расчета коэффициента интенсивности флуоресценции FD4 и RD70 между наружными и внутренними сосудами и обозначьте их как экстра- и внутрисосудистую интенсивность4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение проницаемости сосудов путем отслеживания транспорта декстранса отражает изменение эндотелиальной барьерной функции. Кроме того, наблюдают за морфологией и плотностью сосудов, вычисляя диаметр и количество изменений сосудов.
    1. Запустите программное обеспечение Image J (см. Таблицу материалов).
    2. Нажмите «Файл» и выберите «Открыть », чтобы открыть изображения кровеносных сосудов, полученные под двухфотонным микроскопом.
    3. Выберите «Изображение» и установите для параметра «Тип» значение «16-бит», чтобы преобразовать формат изображения.
    4. Выберите Анализ и выберите Область, Среднее, IntDen в разделе Набор измерений. Нажмите OK для подтверждения.
    5. В разделе Анализ выберите Инструменты, откройте Менеджер окупаемости инвестиций и выберите Показать все и Метки.
    6. Измерьте значение интенсивности внутрисосудистой флуоресценции: нажмите на инструмент лассо на главном интерфейсе, чтобы набросать контур кровеносного сосуда. Нажмите Добавить в менеджере ROI. Выполните этот шаг, чтобы продолжить выбор нескольких судов. Выберите все объекты менеджера ROI и нажмите « Измерить».
    7. Измерьте общее значение интенсивности флуоресценции: наметьте все изображение, нажмите « Измерить», и в результате получится общее значение интенсивности флуоресценции изображения.
    8. Рассчитайте значение интенсивности внесосудистой флуоресценции. Скопируйте данные в Excel для расчета. Коэффициент интенсивности внесосудистой флуоресценции = (1 − значение интенсивности внутрисосудистой флуоресценции/общее значение интенсивности флуоресценции) × 100%.

5. Последующие приложения

  1. Во время эксперимента рассчитайте скорость кровотока, измерив расстояние, которое красная клетка (показанная в виде черной точки под двухфотонным микроскопом)4 проходит за промежуток времени.
  2. Чтобы визуализировать движение клеток крови по эндотелиальным клеткам, пометьте клетки крови флуоресценцией. Затем вводите флуоресцентно-меченые клетки FD4 или RD70 через вену хвоста мыши. После циркуляции в течение 5 мин прослеживайте заинтересованные клетки в течение определенного периода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В общей сложности 2 x 106 CFSE (карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир, мембранопроницаемый флуоресцентный краситель), меченые лимфоцитами, полученными из селезенки мышей-доноров, были перенесены реципиентам путем инъекции в хвостовую вену, а инфильтрация лимфоцитов в SMG была исследована на экспериментальных моделяхживотных 4.

6. Уход за животными и их восстановление

  1. Хорошо заботьтесь о животных на протяжении всего эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что животное, перенесшее операцию, не возвращается в компанию других животных до полного выздоровления во время эксперимента.
  2. Не оставляйте животное без присмотра, пока оно не придет в достаточное сознание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за состоянием дыхания мышей непрерывно и держите их в тепле, положив их на грелку животного. Обеспечить послеоперационное восстановление боли и анальгезию, как рекомендовано местным комитетом по этике животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Следуя протоколу, односторонний SMG был прикреплен к изготовленному на заказ держателю, а железа хранилась как можно дальше от тела мыши, чтобы предотвратить дыхание от артефактов движения. Быстрое течение эритроцитов (черных точек) в кровеносных сосудах наблюдалось под микроскопом. После обнаружения поля ткани под глазной линзой необходимо переключиться на манипулирование программным обеспечением микроскопа. В контрольной группе оба индикатора существовали в кровеносных сосудах мышиного СМГ. В частности, благодаря своей...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Поддержание и регуляция эндотелиальной барьерной функции имеют важное значение для сосудистого гомеостаза. Эндотелиальные клетки и их межклеточные соединения играют решающую роль в поддержании и контроле целостности сосудов12. Сдвиговая сила кровотока, факторы роста и воспалительные факторы могут вызывать изменения проницаемости сосудов и, таким образом, участвовать в возникновении и развитии системных заболеваний, таких как гипертония, диабет, аутоиммунные заболевания 13,14,15.<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (гранты 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 и 81974151) и Пекинским фондом естественных наук (грант 7202082).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-фотонный микроскоп (TCS-SP8 DIVE)Leica, Германия
4 кДа FITC-меченый декстранSigma Aldrich46944
70 кДа родамин B-меченый декстранSigma AldrichR9379
Тупое разделение тканей никельBejinghuabo CompanyNZW28
Крем для депиляции Veet
Одноразовый стерильный шприцZhiyu Company1 мл
Image J программное обеспечениеНационального института здравоохранения
Инсулиновый шприцBecton, Dickinson and Company02533161 мл
Leica Application Suite X программное обеспечениеLeica Microsystems Microsystems
AxygenMCT-150-C1,5 мл
фосфат буферный солей 1xServicebioG4207-500
Ножницы для салфетокBejinghuabo CompanyM286-05
ТриброметанолJITIAN BioJT0781

Ссылки

  1. Carpenter, G. H. The secretion, components, and properties of saliva. Annual Review of Food Science and Technology. 4, 267-276 (2013).
  2. Garrett, J. R. The proper role of nerves in salivary secretion: A review. Journal of Dental Research. 66 (2), 387-397 (1987).
  3. Berndt, P., et al. Tight junction proteins at the blood-brain barrier: Far more than claudin-5. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (10), 1987-2002 (2019).
  4. Cong, X., et al. Disruption of endothelial barrier function is linked with hyposecretion and lymphocytic infiltration in salivary glands of Sjögren's syndrome. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1864 (10), 3154-3163 (2018).
  5. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  6. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  7. Masedunskas, A., Sramkova, M., Weigert, R. Homeostasis of the apical plasma membrane during regulated exocytosis in the salivary glands of live rodents. Bioarchitecture. 1 (5), 225-229 (2011).
  8. Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).
  9. Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of Cell Biology. 134 (4), 1031-1049 (1996).
  10. Enis, D. R., et al. Induction, differentiation, and remodeling of blood vessels after transplantation of Bcl-2-transduced endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (2), 425-430 (2005).
  11. Wang, X., et al. Application of digital subtraction angiography in canine hindlimb arteriography. Vascular. 30 (3), 474-480 (2022).
  12. Trani, M., Dejana, E. New insights in the control of vascular permeability: vascular endothelial-cadherin and other players. Current Opinion in Hematology. 22 (3), 267-272 (2015).
  13. Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertension Research. 31 (5), 873-879 (2008).
  14. Scheppke, L., et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. The Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2337-2346 (2008).
  15. Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 leads to exacerbated autoimmune arthritis through increased vascular permeability. Journal of Immunology. 184 (3), 1292-1299 (2010).
  16. Egawa, G., Ono, S., Kabashima, K. Intravital Imaging of vascular permeability by two-photon microscopy. Methods in Molecular Biology. 2223, 151-157 (2021).
  17. Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
  18. Schulte, D., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. The EMBO Journal. 30 (20), 4157-4170 (2011).
  19. Uhl, B., et al. A novel experimental approach for in vivo analyses of the salivary gland microvasculature. Frontiers in Immunology. 11, 604470(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Детекция in vivoэндотелиальный барьерплотные контактыдвухфотонная микроскопияфлуоресцентный декстранвизуализация кровеносных сосудовпарацеллюлярная проницаемостьтаймлапс-визуализация
В городе Виво Обнаружение сосудистой проницаемости в подчелюстной железе мыши
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.