Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Дальнекрасный флуоресцентный датчик старения, связанный с β-галактозидазой для идентификации и обогащения стареющих опухолевых клеток с помощью проточной цитометрии

5.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64176

⸱

13 сентября 2022 г.

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

В этой статье

Краткое содержание

Представлен протокол флуоресцентной, проточной цитометрической количественной оценки стареющих раковых клеток, индуцированных химиотерапевтическими препаратами в клеточной культуре или в моделях опухолей мышей. Необязательные процедуры включают совместное иммуноиммунтирование, фиксацию образца для облегчения анализа больших партий или временных точек и обогащение жизнеспособных стареющих клеток путем проточной цитометрической сортировки.

Аннотация

Клеточное старение - это состояние пролиферативной остановки, вызванное биологическим повреждением, которое обычно накапливается в течение многих лет в стареющих клетках, но также может быстро возникать в опухолевых клетках в ответ на повреждение, вызванное различными методами лечения рака. Старение опухолевых клеток, как правило, считается нежелательным, так как стареющие клетки становятся устойчивыми к смерти и блокируют ремиссию опухоли, усугубляя злокачественность опухоли и резистентность к лечению. Поэтому идентификация стареющих опухолевых клеток представляет постоянный интерес для сообщества исследователей рака. Существуют различные анализы старения, многие из которых основаны на активности хорошо известного маркера старения, бета-галактозидазы, связанной со старением (SA-β-Gal).

Как правило, sa-β-Gal проводится с использованием хромогенного субстрата (X-Gal) на фиксированных клетках, с медленным и субъективным перечислением «синих» стареющих клеток с помощью световой микроскопии. Улучшенные анализы с использованием проникающих в клетки флуоресцентных субстратов SA-β-Gal, включая C12-FDG (зеленый) и DDAO-галактозид (DDAOG; дальний красный), позволили анализировать живые клетки и позволили использовать высокопроизводительные флуоресцентные аналитические платформы, включая проточные цитометры. C12-FDG является хорошо документированным зондом для SA-β-Gal, но его зеленое флуоресцентное излучение перекрывается с внутренней клеточной автофлуоресценцией (AF), которая возникает во время старения из-за накопления агрегатов липофусцина. Используя дальний красный зонд SA-β-Gal DDAOG, зеленая клеточная автофлуоресценция может быть использована в качестве вторичного параметра для подтверждения старения, добавляя надежность анализу. Остальные флуоресцентные каналы могут быть использованы для окрашивания жизнеспособности клеток или необязательной флуоресцентной иммуномаркировки.

Используя проточную цитометрию, мы демонстрируем использование автофлуоресценции DDAOG и липофусцина в качестве двухпараметрического анализа для идентификации стареющих опухолевых клеток. Проводится количественное определение процента жизнеспособных стареющих клеток. При желании может быть включен необязательный этап иммуномаркировки для оценки интересующих антигенов клеточной поверхности. Идентифицированные стареющие клетки также могут быть цитометрически отсортированы и собраны для последующего анализа. Собранные стареющие клетки могут быть немедленно лизированы (например, для иммуноанализа или анализа омики) или дополнительно культивированы.

Введение

Стареющие клетки обычно накапливаются в организмах в течение многих лет во время нормального биологического старения, но также могут быстро развиваться в опухолевых клетках в ответ на повреждение, вызванное различными методами лечения рака, включая лучевую и химиотерапию. Хотя опухолевые клетки больше не размножаются, вызванные терапией стареющие (ТИС) опухолевые клетки могут способствовать резистентности к лечению и вызывать рецидив 1,2,3. Факторы, секретируемые клетками TIS, могут усугубить злокачественность опухоли, способствуя иммунному уклонению или метастазированию 4,5. Клетки TIS развивают сложные, контекстно-зависимые фенотипы, измененные метаболические профили и уникальные иммунные реакции 6,7,8. Поэтому идентификация и характеристика опухолевых клеток TIS, индуцированных различными подходами к лечению рака, является темой, представляющей постоянный интерес для сообщества исследователей рака.

Для обнаружения опухолевых клеток ТИС широко используются обычные анализы старения, в первую очередь основанные на обнаружении повышенной активности фермента маркера старения, лизосомальной бета-галактозидазы GLB19. Обнаружение при почти нейтральном (а не кислом) лизосомальном рН позволяет специфическо обнаруживать бета-галактозидазу, связанную со старением (SA-β-Gal)10. Стандартный анализ SA-β-Gal, который использовался в течение нескольких десятилетий, использует X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид), синюю хромогенную субстрату бета-галактозидазы, для обнаружения SA-β-Gal в фиксированных клетках с помощью световой микроскопии11. Анализ X-Gal позволяет качественно визуально подтвердить ТИС с использованием общедоступных реагентов и лабораторного оборудования. Базовый микроскоп пропускаемого света является единственным прибором, необходимым для оценки присутствия синего хромогена. Тем не менее, процедура окрашивания X-Gal может не иметь чувствительности, иногда требуется более 24 часов для развития цвета. Окрашивание сопровождается низкопроизводительным, субъективным подсчетом отдельных стареющих клеток на основе подсчета клеток, демонстрирующих некоторый уровень интенсивности синего хромогена под световым микроскопом. Поскольку X-Gal непроницаем, для этого анализа требуются ячейки, фиксированные растворителем, которые не могут быть восстановлены для последующего анализа. При работе с ограниченными образцами от животных или пациентов это может быть серьезным недостатком.

Улучшенные анализы SA-β-Gal с использованием клеточно-проникающих, флуоресцентных ферментных субстратов, включая C12-FDG (5-додеканоиламинофлуоресцеин Ди-β-D-галактопиранозид, зеленый) и DDAOG (9H-(1,3-дихлор-9,9-диметилакридин-2-один-7-ил) β-D-галактопиранозид, дальний красный) ранее появлялись в литературе 12,13,14,15. Структура химического зонда и оптические характеристики DDAOG показаны на дополнительном рисунке S1. Эти зонды, пронизывающие клетки, позволяют анализировать живые (а не фиксированные) клетки, а флуоресцентные, а не хромогенные зонды облегчают использование быстрых высокопроизводительных флуоресцентных аналитических платформ, включая инструменты скрининга с высоким содержанием и проточные цитометры. Сортировочные проточные цитометры позволяют восстанавливать обогащенные популяции живых стареющих клеток из клеточных культур или опухолей для последующего анализа (например, вестерн-блоттинг, ИФА или «омикс»). Флуоресцентный анализ также обеспечивает количественный сигнал, позволяющий более точно определить процент стареющих клеток в данном образце. Дополнительные флуоресцентные зонды, включая зонды жизнеспособности и флуорофорные антитела, могут быть легко добавлены для мультиплексированного анализа мишеней за пределами SA-β-Gal.

Подобно DDAOG, C12-FDG является флуоресцентным зондом для SA-β-Gal, но его зеленое флуоресцентное излучение перекрывается с внутренней клеточной ФП, которая возникает во время старения из-за накопления агрегатов липофусцина в клетках16. Используя дальний красный зонд DDAOG, зеленая клеточная AF может быть использована в качестве вторичного параметра для подтверждения старения17. Это повышает надежность анализа за счет использования второго маркера в дополнение к SA-β-Gal, который часто может быть ненадежным в качестве одного маркера старения18. Поскольку обнаружение эндогенной ФП в стареющих клетках является подходом без меток, это быстрый и простой способ расширить специфичность нашего анализа на основе DDAOG.

В этом протоколе мы демонстрируем использование DDAOG и AF в качестве быстрого двухпараметрического анализа проточной цитометрии для идентификации жизнеспособных опухолевых клеток TIS из культур in vitro или выделенных из обработанных лекарственными средствами опухолей, установленных у мышей (рисунок 1). Протокол использует флуорофоры, совместимые с широким спектром стандартных коммерческих анализаторов и сортировщиков проточной цитометрии (таблица 1). Возможность количественного определения процента жизнеспособных стареющих клеток с помощью стандартного анализа проточной цитометрии. При желании может быть выполнен необязательный этап иммуномаркировки для оценки интересующих антигенов клеточной поверхности одновременно со старением. Идентифицированные стареющие клетки также могут быть обогащены с использованием стандартной методологии флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS).

figure-introduction-1
Рисунок 1: Экспериментальный рабочий процесс. Схема, обобщающая ключевые моменты анализа DDAOG. (A) Препарат, индуцирующий ТИС, добавляют к культивируемым клеткам млекопитающих или вводят мышам, несущим опухоль. Затем допускается время для начала ТИС: для клеток - 4 дня после лечения; для мышей , всего 22 дня, с тремя процедурами каждые 5 дней плюс 7 дней восстановления. Клетки собираются или опухоли диссоциируют на суспензию. (B) Образцы обрабатываются Baf для регулировки лизосомального рН для обнаружения SA-β-Gal в течение 30 минут; затем зонд DDAOG добавляется в течение 60 минут для обнаружения SA-β-Gal. Образцы промывают 2 раза в PBS, и ненадолго добавляется пятно жизнеспособности (15 мин). Необязательно образцы могут быть окрашены флуоресцентными антителами в открытых флуоресцентных каналах и/или зафиксированы для последующего анализа. (C) Образцы анализируются с использованием стандартного проточного цитометра. Жизнеспособные клетки визуализируются на точечных графиках, показывающих красный DDAOG (указывающий на SA-β-Gal) по сравнению с зеленой автофлуоресценцией (липофусцин). Затвор для определения процента клеток TIS устанавливается на основе необработанных контрольных образцов (не показан). Если используется сортировочный цитометр (FACS), клетки TIS могут быть собраны и помещены обратно в культуру для дальнейших анализов in vitro или лизированы и обработаны для анализов молекулярной биологии. Сокращения: DDAO = 9H-(1,3-дихлор-9,9-диметилакридин-2-он); DDAOG = DDAO-галактозид; TIS = старение, вызванное терапией; FL-Ab = флуорофор-конъюгированное антитело; Baf = Бафиломицин A1; SA-β-Gal = бета-галактозидаза, связанная со старением; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ФлуорофорОбнаруживаетEx/Em (нм)Цитометр лазерный (нм)Детектор цитометра / полосовой фильтр (нм)
ДДАОГСА-β-Гал645/6601 руб.640670 / 30
АвтофокусировЛипофусцин< 600488525 / 50
CV450Жизнеспособность408/450405450 / 50
ЧПМаркер антител/поверхности565/578561582 / 15

Таблица 1: Оптические характеристики флуорофоров и цитометров. Спецификации цитометра, используемые в этом протоколе, перечислены для прибора с 4 лазерами и 15 детекторами излучения. DDAOG, обнаруженный при 645/660 нм, является формой зонда, расщепленного SA-β-Gal1. Неочищенный DDAOG может проявлять флуоресценцию низкого уровня при 460/610 нм, но удаляется шагами промывки в протоколе. Сокращения: DDAO = 9H-(1,3-дихлор-9,9-диметилакридин-2-он); DDAOG = DDAO-галактозид; AF = автофлуоресценция; ПЭ = фикоэритрин; SA-β-Gal = бета-галактозидаза, связанная со старением.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные работы с животными были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Чикагском университете.

1. Подготовка и хранение стоковых растворов

ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки будут отсортированы потоком, все растворы должны быть приготовлены с использованием стерильных методов и отфильтрованы через фильтрующее устройство 0,22 мкм.

  1. Готовят стандартный раствор DDAO-галактозида в дозе 5 мг/мл в ДМСО. Аликвота при 50 мкл на пробирку (или желаемый объем). Хранить при температуре −20 °C в темноте до 1 года.
  2. Готовят стоковый раствор бафиломицина А1 на 1 мМ в ДМСО. Аликвота при 50 мкл на пробирку (или желаемый объем). Хранить при температуре −20 °C до 6 месяцев.
  3. Приготовьте запасной раствор Calcein Violet 450 AM при 1 мМ в ДМСО. Аликвота при 50 мкл на пробирку (или желаемый объем). Хранить при температуре −20 °C в темноте до 1 года.
  4. Для обработки культивируемых клеток in vitro готовят 10 мМ концентрированных растворов агента (агентов), вызывающего старение, в соответствующем растворителе и стерилизуют с использованием шприцевых фильтров 0,2 мкм. Хранить при температуре −20 °C или по указанию производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для доставки вызывающих старение химиотерапевтических агентов in vivo (мышам с установленными опухолями) агенты должны быть класса USP и разбавляться в физиологический раствор из концентрированного запаса непосредственно перед инъекцией.
  5. Подготовьте полную питательную среду для используемой клеточной линии (линий).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, подготовьте среду для клеток B16-F10 или A549 с DMEM 1x + 10% FBS + 1x заменитель глутамина + 1x пенициллин/стрептомицин. Носители должны быть стерильными. Могут быть использованы и другие специфические для клеточных линий составы сред. Некоторые компоненты, такие как глутатион, могут, в некоторых случаях, мешать наступлению старения. Эмпирическое тестирование различных составов сред должно проводиться, если начало старения ниже, чем ожидалось, или не наблюдается с контрольными химиотерапевтическими агентами.
  6. Подготовьте фильтры для окрашивания и стирки.
    1. Приготовьте 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 1x PBS для использования в процедурах окрашивания. Растворить 2 г BSA в 200 мл PBS и перемешивать в течение 10 мин или до полного растворения при комнатной температуре.
    2. Приготовьте 0,5% BSA в 1x PBS в качестве промывочного буфера. Разбавить 100 мл 1% BSA, полученного на стадии 1.6.1, в 100 мл 1x PBS для 0,5% BSA.
    3. Храните буферы при температуре 4 °C в течение 1 месяца.
  7. Приготовьте 4% параформальдегида в 1x PBS. Используйте коммерчески доступные, герметичные ампулы параформальдегида (например, 16% v/v) для удобства и стабильности: 2,5 мл 16% PFA + 7,5 мл 1x PBS (= 10 мл 4% PFA). Отрегулируйте подготовленный объем в зависимости от общего объема, необходимого для эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости подготовьтесь только к фиксации клеток; каждый раз готовьте свежим.
  8. Подготовьте сортировочный буфер FACS: 1x PBS, 1 мМ EDTA, 25 мМ HEPES, 1% BSA (pH 7,2). Стерильный фильтр через фильтрующее устройство 0,22 мкм и хранить при 4 °C до 1 месяца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости подготовьтесь только к сортировке FACS. Составы буферов для сортировки потоков могут различаться в зависимости от приборов FACS. Приведенная выше формулировка совместима с прибором, используемым в данном исследовании (см. Таблицу материалов). Ознакомьтесь с рекомендациями производителя.
  9. Приготовьте раствор для диссоциации опухоли: 20 мкг/мл Liberase TL + 100 мкг/мл DNAse I в среде RPMI-1640 (без FBS или других добавок). Стоковые растворы полезно держать под рукой Liberase TL (приготовленный и хранящийся по указанию производителя) и DNAse I (100 мг/мл в двойной дистиллированной воде [ddH2O], хранящийся при −20 °C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте по мере необходимости, если используете только опухоли; каждый раз готовьте свежим.

2. Индукция старения химиотерапевтическими препаратами в культивируемых раковых клетках

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы клеточных манипуляций в этом разделе должны выполняться в шкафу биобезопасности с использованием стерильной практики. Этот раздел написан для адгезивных типов клеток. Суспензионные элементы могут использоваться с соответствующими модификациями, как указано выше.

  1. Вырастите линию (линии) раковых клеток в соответствии со стандартным протоколом от поставщика или лаборатории, которая предоставила конкретную используемую клеточную линию (линии).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки с низким проходом (p < 10), как правило, предпочтительны, поскольку в необработанных образцах клеток будут более низкие уровни репликативного старения, т.е. более низкий фон.
  2. За сутки до индукции старения лекарственными препаратами собирают клетки с трипсином-ЭДТА 0,25% (или по рекомендации). Нейтрализуют трипсин, добавляя равный объем полной питательной среды, и переносят клеточную суспензию в стерильную коническую трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не требуется для суспензионных ячеек.
  3. Подсчитайте ячейки с помощью стандартного метода гемацитометра и запишите ячейки/мл. Пластинчатые ячейки на 1 × 103-10 × 103 клетки/см2 в стандартных 6-луночных пластиковых культуральных чашках.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная плотность покрытия зависит от скорости пролиферации клеток и должна определяться пользователем. Клетки должны находиться в росте логарифмической фазы примерно при 10%-20% конфюлюзии во время обработки (т.е. после инкубации через 18-24 ч после нанесения покрытия). Начальная плотность (ячейки/мл) суспензионных ячеек должна определяться пользователем. Пластины с шестью скважинами обычно дают достаточно стареющих клеток на скважину для одного стандартного образца анализа проточной цитометрии. При потоковой сортировке следует использовать гораздо большую площадь поверхности (например, несколько пластин P150), чтобы обеспечить восстановление достаточного количества стареющих клеток для последующих анализов (≥1 × 106).
  4. Инкубировать покрытые ячейки в течение ночи (18-24 ч) в инкубаторе с температурой 37 °C с 5% CO2 и поддоном влажности.
  5. Обработайте покрытые клетки с помощью химиотерапевтических препаратов, вызывающих старение. Включают, по меньшей мере, один положительный контроль, например, этопозид (ETO) или блеомицин (BLM). Подготовьте дубликаты лунок для каждого препарата. Включите один комплект, обработанный только с транспортным средством в качестве контроля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кривая дозы для каждого экспериментального агента должна быть проверена пользователем для определения оптимальной концентрации для индукции старения в используемой клеточной линии (линиях).
  6. Инкубируйте клетки в течение 4 дней в инкубаторе с температурой 37 °C с 5% CO2 и поддоном влажности, чтобы обеспечить начало старения. Ежедневно исследуйте ожидаемые изменения морфологии с помощью светового микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации от 3-5 дней может быть приемлемым в зависимости от скорости начала старения. Среда может быть изменена, и агент повторно применяется (или нет), по желанию, для содействия здоровым условиям роста при достижении приемлемого процента стареющих клеток.
  7. После наступления старения собирают клетки, добавляя трипсин-ЭДТА 0,25% в течение 5 мин при 37 °C. Когда клетки диссоциируют на суспензию, нейтрализуют трипсин равным объемом полной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не нужен для клеток, растущих в суспензии. Если будет проведено окрашивание поверхностным маркером, избегайте использования трипсина-ЭДТА, так как он может временно разрушить поверхностные антигены на клетках. Вместо этого осторожно диссоциируйте монослой, используя стерильный пластиковый клеточный скребок (или альтернативный реагент диссоциации, предназначенный для сохранения поверхностных антигенов).
  8. Подсчитайте клетки в каждом образце с помощью гемацитометра. Рассчитайте ячейки/мл для каждого образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трипан синий может быть добавлен для оценки процента мертвых клеток на этом этапе (т. Е. Из-за медикаментозного лечения), но гибель клеток также будет определяться с помощью флуоресцентного красителя жизнеспособности во время рабочего процесса окрашивания DDAOG.
  9. Aliquot ≥0,5 × 106 клеток на образец в микроцентрифужные пробирки объемом 1,7 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек на образец должно быть стандартизировано для всех образцов.
  10. Центрифугируйте пробирки в течение 5 мин при 1000 × г в микроцентрифуге при 4 °C. Удалите супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если охлажденная микроцентрифуга недоступна, может быть приемлемо выполнять центрифугирование при температуре окружающей среды для определенных типов устойчивых клеток.
  11. Перейдите к окрашиванию DDAOG в разделе 4.

3. Индукция старения химиотерапевтическими препаратами в опухоли, установленные у мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Если опухолевые клетки будут отсортированы FACS, обеспечьте стерильность на каждом этапе, работая в шкафу биобезопасности и работая со стерильными инструментами, процедурами и реагентами.

  1. Создание моделей опухолей мышей путем введения раковых клеток подкожно, в соответствии со стандартными методами (например, Appelbe et al.19).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество раковых клеток, подлежащих инъекции, место инъекции и соответствующий штамм мыши должны быть оптимизированы для каждого протокола. Здесь клетки B16-F10 вводили подкожно через 1 × 106 клеток в 0,1 мл физиологического раствора (1 × 107 клеток/мл).
    1. Убедитесь, что жизнеспособность клеток, использующих трипан синий, составляет >90%, прежде чем выполнять инъекции. Обезболивают мышей изофлураном.
    2. Обезболить 6-7-недельных самок мышей C57/BL6 смесью 3% изофлурана и воздуха и поддерживать в этих условиях в индукционной камере, помещенной в стерильный шкаф биобезопасности. Подтвердите анестезию, осторожно зажав ногу мыши. Нанесите стерильную ветеринарную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время процедуры. Во время процедуры поддерживайте температуру тела мыши с помощью нагревательной лампы.
    3. Работая внутри стерильного шкафа биобезопасности, извлеките мышь из индукционной камеры и поместите ее в контакт с носовым конусом, обеспечивающим подачу 3% изофлурана. Побрейте область бока в месте инъекции с помощью чистой электрической бритвы. Кратковременно перемешайте приготовленную клеточную суспензию, вручную перевернув трубку непосредственно перед инъекцией, и введите клеточную суспензию подкожно в бритую бок (бока) с помощью стерильного шприца объемом 0,5 мл, оснащенного стерильной иглой 27 г. Выньте мышь из капота и перенесите ее в клетку восстановления.
    4. В клетке восстановления непрерывно следите за жизненно важными показателями мышей, пока они не придут в достаточное сознание, чтобы поддерживать стернальную упругость, демонстрировать корректирующий рефлекс и безопасно передвигаться в клетке. Не оставляйте мышей без присмотра и не возвращайте животных, перенесших прививку опухолевых клеток, компании других животных до полного выздоровления. Ежедневно контролировать всех инокулированных мышей на предмет потери веса, снижения активности / подвижности и неврологических симптомов; усыпляют мышей, проявляющих тяжелые симптомы в любой категории. Мышам, проявляющим болевые симптомы после прививки, вводят бупренорфин (0,1-0,2 мг/кг) однократно подкожно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши, проявляющие постоянную боль после бупренорфина, должны быть усыплены.
  2. Начиная с 5-7 дней после посева раковых клеток, измеряйте рост опухоли суппортами каждые 2-3 дня. Начинают прозенесцентное лечение, когда опухоль достигла 50 мм3 ± 10мм3 в объеме.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой работе дозы доксорубицина гидрохлорида (DOX) класса USP или ПЭГилированного липосомального доксорубицина (PLD) при 10 мг/кг вводили в инъекции 0,9% хлорида натрия (USP). Препараты вводили внутрибрюшинно 3 раза, один раз в 5 дней, начиная с того момента, когда опухоли достигали 50мм3 ± 10мм3. Мыши выздоравливали в течение 7 дней после окончательного лечения, чтобы обеспечить начало ТИС в опухолях. Дозы и условия индукции старения для других методов лечения и / или моделей опухолей должны быть оптимизированы.
  3. Через 7 дней после окончательного медикаментозного лечения принесите мышей в жертву при передозировкеCO2 и вывихе шейки матки или другими утвержденными методами в соответствии с рекомендациями по работе с лабораторными животными. Иссечь опухоли и собрать их в стерильные трубки или 6-луночные пластины, заполненные стерильной питательной средой RPMI (для сохранения жизнеспособности при обработке).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении гистологического исследования (например, X-Gal или иммуногистохимии) опухоли могут быть разделены здесь пополам, с одной половиной замороженной в O.C.T. встраивающей среде и криосекцией с использованием стандартных процедур для гистологии замороженных тканей. Оставшаяся половина опухоли должна давать обильный материал для диссоциации и окрашивания DDAOG.
  4. Перенесите одну опухоль на пластиковую посуду P100, содержащую 5 мл среды RPMI. Измельчите опухоль на кусочки с помощью скальпеля.
  5. Переведите 5 мл суспензии опухолевых кусочков, содержащих взвешенные клетки и мусор, в коническую трубку объемом 15 мл. Используйте более широкий наконечник серологического пипетка объемом 25 мл для переноса этой суспензии, если присутствует крупный мусор. Смойте блюдо дополнительным объемом стерильного RPMI для сбора материалов. Колпачок и поместите коническую трубку на лед.
  6. Повторите шаги 3.45-3.5 для остальных опухолей. Используйте отдельную пластину и скальпель для каждой опухоли, чтобы избежать перекрестного загрязнения, или хорошо промойте PBS между опухолями. Используйте 5 мл свежей среды для измельчения каждой опухоли.
  7. Готовят раствор для диссоциации опухоли: 20 мкг/мл Liberase TL + 100 мкг/мл DNAse I в среде RPMI-1640 (без FBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует множество эффективных составов для диссоциации опухолей, которые могут включать в себя различные ферменты и другие компоненты от разных производителей. Оптимальные концентрации компонентов могут сильно варьироваться в зависимости от типа опухоли. Если эритроциты сильно присутствуют в опухоли, может быть дополнительно проведен лизис эритроцитов; если мертвые клетки являются проблемой, можно использовать комплект для удаления мертвых клеток. Пользователю настоятельно рекомендуется самостоятельно определять оптимальные условия диссоциации опухоли, обеспечивающие высокую жизнеспособность и низкое присутствие загрязняющих клеток, соединительного материала и мусора.
  8. Центрифугировать все образцы опухолей в конических пробирках в течение 5 мин при 1000 × г (4 °C). Удалите супернатант.
  9. Добавляют 1-5 мл раствора для диссоциации опухоли к каждому образцу опухоли, в зависимости от объема опухолевого материала. Убедитесь, что в пробирке имеется 1-2 мл сверх гранул опухолевого материала. Вихрь с умеренной скоростью смешивается.
  10. Поместите образцы в инкубатор с температурой 37 °C с быстрым вращением в течение 45 мин. Вихрь ненадолго каждые 15 мин.
  11. Фильтруйте каждый образец через клеточный сетчатый фильтр 100 мкм в коническую трубку объемом 50 мл. Если образцы слишком вязкие для прохождения через фильтр, добавьте 10 мл среды RPMI-1640 для разбавления. Промойте фильтры средой RPMI для сбора остаточных ячеек.
  12. Используйте гемацитометр для подсчета клеток/мл для каждого образца.
  13. Aliquot две или более реплицирует 5 × 106 клеток на образец опухоли.
  14. Центрифуга в течение 5 мин при 1000 × г (4 °C). Удалите супернатант.
  15. (Необязательно) Криоконсервируйте образцы опухоли для последующего окрашивания DDAOG, если это необходимо.
    1. Повторное суспендирование диссоциированной гранулы опухолевых клеток в криоконсервационной среде: 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, приготовленных в стерильных условиях при 5 × 106 клеток/мл.
    2. Аликвот 1 мл клеточной суспензии в каждую криовиальку.
    3. Заморозить криовиалы в течение 24 ч в контейнере для замораживания изопропаноловых клеток при −80 °C; затем перевести на криохранилище жидкого азота для длительного хранения (>1 неделю).
    4. Когда окрашивание желательно, разморозьте криовиалы на льду и приступайте к окрашиванию DDAOG в разделе 4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые опухоли могут оставаться нежизнеспособными посредством криоконсервации, и устойчивость к этому процессу должна быть оценена пользователем для интересующей опухолевой модели.
  16. Перейдите к разделу 4 для окрашивания DDAOG.

4. DDAOG окрашивание SA-β-Gal в образцах клеток или опухолей

  1. Разбавить 1 мМ запаса бафиломицина А1 при 1:1000x в среде DMEM (без FBS) для получения конечной концентрации 1 мкМ.
  2. Добавляют приготовленный раствор Baf-DMEM к образцам клеточных гранул (со стадии 2.11 или стадии 3.16) для концентрации 1 × 106 клеток/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, при использовании 0,5 × 106 ячеек на образец, добавьте 0,5 мл Baf-DMEM. Для опухолей 5 × 106 клеток могут быть окрашены в 5 мл Baf-DMEM.
  3. Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C (без CO2) на ротаторе/шейкере, установленном на медленной скорости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте инкубаторов CO2 для процесса окрашивания, которые могут подкислять растворы и тем самым мешать окрашиванию Baf и DDAOG.
  4. Не промывая, добавьте раствор DDAOG (5 мг/мл) в 1:500x (10 мкг/мл окончательный) к каждому образцу. Пипетку для смешивания. Замените на ротаторе/шейкере при 37 °C (без CO2) в течение 60 мин. Защита от прямого света.
  5. Центрифугируйте пробирки в течение 5 мин при 1 000 х г при 4 °C. Удалите супернатант.
  6. Промыть 1 мл ледяного 0,5% BSA на тюбик и пипетку для смешивания. Центрифугируйте пробирки в течение 5 мин при 1000 х г при 4 °C и удалите супернатант. Повторите этот шаг 2x, чтобы тщательно промыть клетки. Удалите супернатант и продолжайте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выполнить шаги промывки на шаге 4.6 для удаления неочищенного DDAOG, который может проявлять нежелательное флуоресцентное излучение (460/610 нм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При иммуноокрашивании маркеров клеточной поверхности перейдите к разделу 5 ниже.
  7. (Необязательно) Фиксация и хранение окрашенных DDAOG клеток для последующего анализа
    1. Добавьте 0,5 мл ледяного 4% параформальдегида по каплям к каждому промытому образцу. Пипетку для смешивания.
    2. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
    3. Промыть ячейки 2x с 1 мл PBS.
    4. Храните образцы до 1 недели при температуре 4 °C до анализа проточной цитометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для фиксированных образцов пропустите шаг 4.8.
  8. Разбавьте запас Calcein Violet 450 AM (1 мМ) при 1:1000x в 1% BSA-PBS (1 мкМ конечный). Добавьте 300 мкл (для культивируемых образцов клеток) или 1000 мкл (для образцов опухолей) к промытым клеточным гранулам со стадии 4.6. Инкубировать в течение 15 мин на льду в темное время суток.
  9. Перейдите к настройке проточной цитометрии (раздел 6).

5. (Необязательно) Иммуноокрашивание маркеров клеточной поверхности в сочетании с DDAOG

ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в любом эксперименте по проточной цитометрии, контрольные образцы с одним окрашиванием только с DDAOG и только флуоресцентными антителами должны быть подготовлены к определению перекрестных помех (если таковые имеются) через флуоресцентные каналы. При наблюдении перекрестных помех следует выполнить стандартную компенсацию проточной цитометрии20.

  1. Повторно суспендируют гранулы клеток, полученные на стадии 4,6 в 100 мкл окрашивающего буфера (1% BSA в 1x PBS).
  2. Добавьте реагент, блокирующий рецептор Fc, подходящий для видов клеток (мыши или человека) при титровании, рекомендованном производителем. Инкубировать в течение 10 мин при 24 °C.
  3. Добавляют флуорофор-конъюгированные антитела при титровании, рекомендованном производителем (или определенном пользователем). Инкубировать в течение 20 мин на льду, защищенном от света.
  4. Центрифугируйте пробирки в течение 5 мин при 1000 × г при 4 °C. Удалите супернатант.
  5. Промыть 1 мл ледяного буфера для промывки (0,5% BSA-PBS) на трубку и пипетку для смешивания. Центрифугируют пробирки в течение 5 мин при 1000 × г при 4 °C и удаляют супернатант. Повторите этот шаг 2x, чтобы тщательно промыть клетки.
  6. Разбавить 1 мМ Calcein Violet 450 AM при 1:1000x в 1% BSA-PBS. Добавьте 300 мкл к гранулам промытой ячейки со стадии 5.5. Инкубировать в течение 15 мин на льду в темное время суток.
  7. Приступают к анализу проточной цитометрии (разделы 6-7).

6. Настройка проточного цитометра и сбор данных

  1. Перенесите образцы клеток в пробирки, совместимые с прибором проточной цитометрии. Поместите трубки на лед и держите их защищенными от света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если в клеточных суспензиях наблюдаются агрегаты, пропустите суспензию через клеточные сетчатые фильтры 70-100 мкм перед анализом. Не используйте ситечки 40 мкм, потому что они могут исключить некоторые из более крупных стареющих клеток.
  2. В указанном программном обеспечении (см. Таблицу материалов) откройте следующие графики: 1) точечный график FSC-A против SSC-A, 2) гистограмма фиолетового канала, 3) дальний красный канал (например, APC-A) против зеленого канала (например, FITC-A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Графики исключения дублетов и одноканальные гистограммы также могут использоваться, но не являются строго обязательными.
  3. Инициировать сбор данных цитометра.
    1. Поместите контрольный образец только для транспортного средства, окрашенный DDAOG, на впускное отверстие. При низкой скорости всасывания начинают получать образцовые данные.
    2. Отрегулируйте напряжения FSC и SSC таким образом, чтобы >90% событий содержались на графике. Если ячейки плохо вписываются в график, уменьшите настройку масштабирования площади до 0,33-0,5 единицы.
    3. Извлеките образец, предназначенный только для транспортного средства, без записи данных.
    4. (Необязательно) Добавьте одну каплю радужных калибровочных микросфер в трубку цитометра с 1 мл PBS. Поместите трубку на входное отверстие цитометра. Начните собирать образцы данных.
    5. Отрегулируйте фиолетовое, зеленое и дальнекрасное напряжения канала так, чтобы верхний пик радужной микросферы находился в диапазоне 104-10 5 единиц относительной флуоресценции в каждом канале и все пики были хорошо разделены в каждом канале. Рекорд 10 000 событий. Извлеките трубку.
  4. Поместите положительный контрольный образец (например, BLM, ETO), окрашенный DDAOG, на впускное отверстие. На низкой скорости получайте образцы данных. Наблюдайте за событиями в FSC, SSC, фиолетовых, зеленых и дальних красных каналах, чтобы убедиться, что более 90% событий содержатся во всех участках. Обратите внимание на увеличение сигнала АВТОФО и DDAOG по сравнению с управлением только транспортным средством.
  5. Если используется сортировочный цитометр, запустите сортировку на этом шаге.
    1. Для целей ведения учета запишите 10 000 ячеек для контрольного образца и каждого отсортированного образца.
    2. Отсортируйте желаемое количество клеток (≥1 × 106 обычно подходит) в подходящую для инструмента сборную трубку с 3-5 мл питательной среды.
    3. После сортировки перейдите к нисходящему языку и региональным параметрам или анализу.
    4. Перейдите к разделу 7 для рутинного анализа отсортированных образцов.
  6. При использовании флуоресцентных антител оптимизируйте напряжение канала здесь, используя неокрашенные, одноокрашенные и двойные окрашенные образцы, подготовленные в разделе 5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для калиброванного проточного цитометра, используемого в настоящем описании, оптимальные напряжения канала обычно падают между 250 и 600 (средний диапазон), но оптимальные напряжения и диапазоны напряжения канала будут варьироваться в зависимости от прибора. Избегайте использования напряжений в очень низких или высоких диапазонах, которые могут подавлять сигнал или усиливать шум.
  7. После выполнения шагов 6.1-6.5 и внесения необходимых корректировок в настройки цитометра запишите данные для всех образцов. Убедитесь, что настройки остаются одинаковыми для всех записей сэмплов. Запись ≥10 000 событий на культивируемый образец клеток или ≥100 000 событий на образец опухолевой клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя анализ и анализ могут быть выполнены с использованием программного обеспечения для сбора данных (например, FACSDiva), полный рабочий процесс сбора и анализа, который будет проводиться после сбора с использованием отдельного аналитического программного обеспечения (FlowJo), описан в разделе 7 ниже. Анализ после сбора предпочтительнее, чтобы сократить время на рабочей станции цитометра и воспользоваться дополнительными инструментами, включенными в специализированное программное обеспечение для анализа.
  8. Сохраните образцы данных в формате FCS. Экспортируйте файлы на компьютер рабочей станции, оснащенный программным обеспечением для анализа проточной цитометрии (например, FlowJo). Перейдите к разделу 7.

7. Анализ данных проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный рабочий процесс использует программное обеспечение FlowJo. Альтернативное программное обеспечение для анализа данных проточной цитометрии может быть использовано, если аналогичным образом соблюдаются ключевые шаги, описанные в этом разделе.

  1. С помощью программного обеспечения FlowJo откройте файлы данных .fcs из шага 6.7.
  2. Откройте окно макета.
  3. Перетащите все примеры в окно макета.
  4. Ворота жизнеспособных ячеек.
    1. Сначала дважды щелкните образец данных для элемента управления, предназначенного только для транспортного средства, чтобы открыть окно данных.
    2. Визуализируйте данные в виде гистограммы фиолетового канала. Идентифицируйте жизнеспособные клетки, окрашенные CV450, на основе их более яркой флуоресценции, чем мертвые клетки.
    3. Нарисуйте ворота с помощью инструмента гистограммы с одним затвором, чтобы включить только жизнеспособные ячейки. Назовите ворота жизнеспособными.
    4. Затем из окна макета образца перетащите жизнеспособный затвор на другие образцы ячеек, чтобы применить затвор равномерно.
    5. В окне макета визуализируйте все образцы в виде гистограмм фиолетового канала (жизнеспособности). Прежде чем продолжить, убедитесь, что жизнеспособная клеточная решетка подходит для всех образцов; если нет, внесите необходимые коррективы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание жизнеспособности может демонстрировать вариации между методами лечения или опухолями.
  5. Ворота стареющих клеток.
    1. Дважды щелкните на закрытой жизнеспособной ячейке данных для элемента управления, предназначенного только для транспортного средства, чтобы открыть окно данных.
    2. Визуализируйте данные в виде точечной диаграммы для дальнего красного канала (DDAOG) и зеленого канала (AF).
    3. Нарисуйте затвор с помощью инструмента прямоугольного затвора, чтобы включить <5% ячеек, которые являются DDAOG+ и AF+ (верхний правый квадрант). Назовите стареющие ворота.
    4. Затем из окна макета образца перетащите стареющий затвор на жизнеспособные подмножества других образцов клеток, чтобы применить затвор равномерно.
    5. В окно макета перетащите все жизнеспособные подмножества ячеек, указанные в разделе 7.4. Визуализируйте все жизнеспособные образцы в виде точечных графиков с дальним красным цветом (например, APC-A) и зеленым каналом (например, FITC-A).
    6. Убедитесь, что стареющие ворота, нарисованные на шаге 7.5.3, видны на всех участках и что ворота для контроля только для транспортного средства демонстрируют ≤5%-10% стареющих ячеек.
  6. После того, как процент стареющих клеток был определен с помощью описанных выше шагов, представьте полученные данные с помощью графиков FlowJo, обобщенных в таблице данных и / или статистически проанализированных с использованием стандартного программного обеспечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Было проведено несколько экспериментов для демонстрации сопоставимости DDAOG с X-Gal и C12-FDG для обнаружения старения SA-β-Gal. Во-первых, X-Gal использовался для окрашивания стареющих клеток меланомы B16-F10, индуцированных ETO (рисунок 2A). Интенсивный синий цвет развился в подмножестве клеток, обработанных ETO, в то время как другие клетки демонстрировали менее интенсивное синее окрашивание. Морфология была увеличена в большинстве клеток, обработанных ETO. Окрашивание клеток,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

За последнее десятилетие или около того, проточная цитометрия стала более распространенной платформой для анализа в исследованиях рака из-за растущей популярности иммунологии опухолей, разработки более дешевых проточных цитометров и улучшения общих инструментальных средств в академических учреждениях. Многоцветные анализы теперь являются стандартными, так как большинство новых инструментов оснащены фиолетовыми, сине-зелеными и красными и дальнекрасными оптическими массивами. Таким образом, этот протокол DDAOG, вероятно, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, чтобы заявить об этом исследовании.

Благодарности

Мы благодарим Центр цитометрии и антител в Чикагском университете за поддержку в области приборов для проточной цитометрии. Центр исследований животных при Чикагском университете предоставил жилье для животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Бафиломицин А1Исследовательские продукты ИнтернэшнлB40500
Блеомицина сульфат Cayman13877
Бычий сывороточный альбумин (BSA)US BiologicalA1380
Кальцеин Фиолетовый 450 AM краситель жизнеспособностиThermoFisher Scientific65-0854-39eBioscience
DPP4 антитело, конъюгат ПЭBiolegend137803клон H194-112
Клеточная линия: A549 аденокарцинома легкого человекаАмериканская коллекция типовых культурCCL-185
Клеточная линия: B16-F10 мышиная меланомаAmerican Type Culture CollectionCRL-6475
Скребокдля клеток Corning3008
Клеточные фильтры, 100 & микро; mFalcon352360
DDAO-GalactosideLife TechnologiesD6488
DMEM medium 1xLife Technologies11960-069
DMSOSigmaD2438
DNAse ISigmaDN25
Доксорубицин, гидрохлорид для инъекций (USP)PfizerNDC 0069-3032-20
Доксорубицин, ПЭГилированный липосомальный (USP)Sun PharmaceuticalNDC 47335-049-40
EDTA 0.5 MLife Technologies15575-038
Этопозид Кайман12092
FBSОмега FB-11
Реактив блокирования рецепторов FcBiolegend101320Anti-mouse CD16/32
Проточный цитометр (анализатор клеток)Бектон Дикинсона (BD)РазличныеLSRFortessa
Проточный цитометр (сортировщик клеток)Бектон Дикинсона (BD)РазличныеFACSAria
GlutaMax 100xLife Technologies35050061
HEPES 1 МLonzaBW17737
Liberase TLSigma5401020001Roche
Параформальдегид 16%Электронная микроскопияSciences 15710
Пенициллин/стрептомицин 100xLife Technologies15140122
Фосфатный буферный раствор (PBS) 1xCorningMT21031CVPBS Dulbecco (без кальция и магния)
Радужные калибровочные частицы, ультра комплектSpheroTechUCRP-38-2K3.5-3.9 &; m, 2E6/мл
RPMI-1640 средний 1xLife Technologies11875-119
Хлорид натрия 0,9% (USP)Baxter Healthcare Corporation2B1324
Программное обеспечение для сбора данных цитометра, "FACSDiva"Becton Dickinson (BD)n/aContact BD для лицензирования
Программное обеспечение для анализа данных цитометра, "FlowJo"TreeStarn/aСвяжитесь с TreeStar для получения лицензии
Trypsin-EDTA 0.25%Life Technologies25200-114

Ссылки

  1. Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
  2. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: friends or foes. Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  3. Prasanna, P. G., et al. Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy. Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).
  4. Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy. Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).
  5. Ou, H. L., et al. Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection. Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).
  6. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
  7. Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents. Cells. 8 (12), 1501(2019).
  8. Mikuła-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Książek, K. Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).
  9. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  10. Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. Colorimetric detection of senescence-associated β galactosidase. Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).
  11. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  12. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  13. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  14. Tung, C. -H., et al. In vivo imaging of β-galactosidase activity using far red fluorescent switch. Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).
  15. Gong, H., et al. beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG. Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).
  16. Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age. APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).
  17. Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging. 5 (1), 37-50 (2013).
  18. Wang, B., Demaria, M. The quest to define and target cellular senescence in cancer. Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).
  19. Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment. Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).
  20. Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. Basic multicolor flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).
  21. Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria. Frontiers in Physiology. 11, 593630(2020).
  22. Kim, K. M., et al. Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4. Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).
  23. Flor, A. C., Kron, S. J. Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence. Cell Death Discovery. 7 (9), 2366(2016).
  24. Jochems, F., et al. The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence. Cell reports. 36 (4), 109441(2021).
  25. Fallah, M., et al. Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential. Life Sciences. 232, 116677(2019).
  26. Kasper, M., Barth, K. Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1. Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).
  27. Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis. Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).
  28. Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence. Cell Death Discovery. 3, 17075(2017).
  29. Burd, C. E., et al. Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model. Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).
  30. Liu, J. Y., et al. Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).
  31. Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. Exploiting senescence for the treatment of cancer. Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).
  32. Baek, K. -H., Ryeom, S. Detection of oncogene-induced senescence in vivo. Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).
  33. González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

DDAOG
Дальнекрасный флуоресцентный датчик старения, связанный с β-галактозидазой для идентификации и обогащения стареющих опухолевых клеток с помощью проточной цитометрии
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.