Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка термических повреждений от роботизированной краниотомии для хирургии черепного окна у мышей

2.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64188

⸱

11 ноября 2022 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 2Advanced Platform Technology Center, Louis Stokes Cleveland VA Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Черепные окна стали повсеместно применяемым хирургическим методом, позволяющим проводить прижизненную визуализацию у трансгенных мышей. Этот протокол описывает использование хирургического робота, который выполняет полуавтоматическое сверление костей черепных окон и может помочь уменьшить вариабельность от хирурга к хирургу и частично смягчить термическое повреждение гематоэнцефалического барьера.

Аннотация

Хирургия черепного окна позволяет визуализировать мозговую ткань у живых мышей с использованием многофотонных или других методов прижизненной визуализации. Однако при выполнении любой трепанации черепа вручную часто происходит термическое повреждение ткани головного мозга, которое по своей сути варьируется от операции к операции и может зависеть от индивидуальной техники хирурга. Внедрение хирургического робота может стандартизировать хирургическое вмешательство и привести к уменьшению термических повреждений, связанных с хирургическим вмешательством. В этом исследовании были протестированы три метода роботизированного бурения для оценки теплового повреждения: горизонтальный, точечный и импульсный точечно. Горизонтальное бурение использует схему непрерывного сверления, в то время как точечное сверление нескольких отверстий, охватывающих краниальное окно. Импульсная точка за точкой добавляет схему бурения «2 с вкл., 2 с выкл.» для обеспечения охлаждения между бурениями. Флуоресцентная визуализация красителя Evans Blue (EB), вводимого внутривенно, измеряет повреждение тканей головного мозга, в то время как термопара, помещенная под место сверления, измеряет термическое повреждение. Результаты термопар указывают на значительное снижение изменения температуры в импульсной двухточечной (6,90 °C ± 1,35 °C) группе по сравнению с горизонтальной (16,66 °C ± 2,08 °C) и точечной (18,69 °C ± 1,75 °C) группами. Аналогичным образом, импульсная точечная группа также показала значительно меньшее присутствие БЭ после сверления черепного окна по сравнению с горизонтальным методом, что указывает на меньшее повреждение кровеносных сосудов в головном мозге. Таким образом, импульсный точечный метод бурения представляется оптимальной схемой снижения термического повреждения. Роботизированная дрель — полезный инструмент, помогающий свести к минимуму обучение, вариативность и уменьшить термические повреждения. С расширением использования многофотонной визуализации в исследовательских лабораториях важно повысить строгость и воспроизводимость результатов. Методы, рассмотренные здесь, помогут проинформировать других о том, как лучше использовать этих хирургических роботов для дальнейшего продвижения в этой области.

Введение

Черепные окна стали повсеместно использоваться в областях неврологии, нейронной инженерии и биологии, чтобы обеспечить прямую визуализацию и визуализацию коры головного мозга у живых животных 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Мощная комбинация трансгенных мышей и многофотонной визуализации дала чрезвычайно ценную информацию об активности цепи и других биологических знаниях в мозге in vivo 12,13,14,15,16,17,18. Миниатюрные микроскопы, установленные на черепе, еще больше расширили эти возможности, чтобы обеспечить запись бодрствующих, свободно движущихся животных19. Процесс создания черепного окна требует силового сверления для истончения или полного удаления черепной кости для получения достаточно больших краниотомий, чтобы закрепить прозрачный кусок стекла над корой20. Полидиметилсилоксан (ПДМС) и другие полимеры также были испытаны в качестве материалов для черепных окон 9,21. В конечном счете, идеальное черепное окно - это то, которое не изменяет и не мешает нормальной эндогенной активности под ним. Тем не менее, общепризнано, что сверление черепного окна усугубляет подлежащую ткань, что приводит к повреждению мозга, нарушению окружающей среды и влиянию на мозговые оболочки до такой степени, что закупоривает многофотонную визуализацию глубиной22. Возникающее в результате нейровоспаление имеет широкий спектр эффектов, начиная от проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и заканчивая активацией и рекрутированием глиальных клеток вокруг местаимплантации 23. Таким образом, определение более безопасных и воспроизводимых методов сверления черепных окон имеет решающее значение для стабильного качества визуализации и снижения смешанных факторов.

В то время как принимаются меры для минимизации травмы подлежащих тканей, акт сверления кости может вызвать как термические, так и механические возмущения мозга24,25. Механическая травма в результате случайного проникновения сверла в твердую мозговую оболочку может дополнительно вызвать повреждение коры головного мозга различной степени24. В исследовании, проведенном Shoffstall et al.25, тепло от сверления костей приводило к повышенной проницаемости ГЭБ, о чем свидетельствует присутствие красителя Evans Blue (EB) в паренхиме головного мозга 25. Краситель БЭ, вводимый внутривенно, связывается с циркулирующим альбумином в кровотоке и, следовательно, обычно не проникает через здоровый ГЭБ в заметных концентрациях. В результате краситель EB обычно используется в качестве чувствительного маркера проницаемости ГЭБ26,27. Хотя их исследование напрямую не измеряло влияние проницаемости ГЭБ на последующие биологические последствия, предыдущие исследования коррелировали проницаемость ГЭБ с повышенной нейровоспалительной реакцией на хронически имплантированные микроэлектроды и изменениями двигательной функции28.

В зависимости от целей исследования, величина термических и механических повреждений может способствовать источнику экспериментальной ошибки, отрицательно влияя на строгость и воспроизводимость исследования. Существуют десятки цитируемых методов изготовления черепных окон, каждый из которых использует различное буровое оборудование, скорости, методы и пользователей 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 сообщили, что наблюдаемые изменения в результатах нагрева были связаны с изменчивостью приложенной силы бура, скорости подачи и угла применения, а также с другими аспектами, которые не могут контролироваться при бурении вручную 25. Существует мнение, что автоматизированные системы бурения и другое стереотаксическое оборудование могут улучшить воспроизводимость и согласованность результатов, но опубликованные исследования методов не проводили строгой оценки температуры или проницаемости ГЭБ в качестве одного из результатов. Таким образом, существует потребность в более воспроизводимых и последовательно применяемых методах изготовления черепных окон, а также в методах, строго применяемых для оценки воздействия сверления черепных окон на подлежащую нервную ткань.

Основное внимание в этом исследовании уделяется определению и разработке последовательных и безопасных методов бурения черепных окон. Размер трепанации черепа для установки черепного окна значительно больше, чем у стандартной трепанации для имплантированных в мозг микроэлектродов. Такая трепанация черепа не может быть выполнена с помощью одного отверстия для заусенцев при использовании стандартного оборудования, тем самым привнося большую вариабельность техники между хирургами при выполнении рукой20. Хирургические буровые роботы были введены в поле, но не получили широкого распространения 1,6,29. Автоматизация бурения обеспечивает контроль над переменными, способствующими наблюдаемым изменениям от испытания к испытанию, предполагая, что использование оборудования может уменьшить меж- и внутрихирургические эффекты. Это представляет особый интерес, учитывая дополнительную сложность большой трепанации черепа, необходимой для установки черепного окна. Хотя можно было бы предположить, что автоматизация бурения дает очевидные преимущества для контроля, было мало оценок внедрения этого оборудования. Хотя видимых поражений не наблюдалось5, желателен тест с более высокой чувствительностью с использованием БЭ.

Здесь проницаемость ГЭБ измеряется с помощью коммерчески доступного хирургического сверлильного робота с соответствующим программным обеспечением, которое позволяет программировать стереотаксические координаты, планировать/картировать трепанацию черепа и выбирать стили бурения («точка за точкой» и «горизонтально»), ссылаясь на маршрутизированную траекторию бурового долота. Вначале просверливаются восемь «семенных» точек (рис. 1А), очерчивающих краниальное окно. Отсюда пространство между семенами вырезается с помощью «точечного» или «горизонтального» метода сверления. «Точка за точкой» выполняет вертикальные пропилы пилотных отверстий (аналогично сверлильному станку с ЧПУ), а «горизонтальный» выполняет горизонтальные разрезы по окружности черепного окна, которые очерчивают отверстие (аналогично фрезерному станку с ЧПУ). Результатом обоих методов является кусок черепа, который можно удалить, чтобы открыть черепное окно. Чтобы изолировать повреждения от сверления, черепное окно физически не удаляется, чтобы избежать каких-либо дополнительных повреждений. Комбинация красителя EB в сочетании с флуоресцентной визуализацией используется для измерения проницаемости ГЭБ после выполнения краниотомии у мышей, а вставленная термопара используется для непосредственного измерения температуры поверхности мозга во время сверления (рис. 1B, C). Предыдущие наблюдения показали, что импульсное включение/выключение бурения с интервалом 2 с было достаточным для смягчения нагревасверла 25 и, следовательно, включено в экспериментальный подход для хирургического робота.

Целью представленной работы является демонстрация методов оценки термических повреждений от трепанации черепа. Хотя методы представлены в контексте автоматизированного бурения, такие методы могут быть применены и к схемам ручного бурения. Эти методы могут быть использованы для проверки использования оборудования и/или схем бурения перед принятием в качестве стандартной процедуры.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Схема экспериментального трубопровода. Схема, демонстрирующая процесс, которому подверглись животные для количественной оценки БЭ после процедуры черепного окна. (A) Схематическая установка мыши со стереотаксической рамой и дрелью хирургического робота. Пример черепного окна показан над моторной корой с начальными точками (зеленый) и краевыми точками (синий). (B) Перфузионная установка включает в себя инъекцию 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) по всему животному для удаления крови с последующим извлечением мозга. (C) Затем мозг помещают в камеру флуоресцентной системы визуализации EB для проведения флуоресцентной визуализации на красителе Evans Blue. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры и методы ухода за животными были рассмотрены, одобрены и выполнены в соответствии с Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Медицинского центра Департамента по делам ветеранов Луиса Стокса в Кливленде.

1. Настройка оборудования хирургического робота

  1. Перед операцией следуйте руководству и руководству хирургического робота (см. Таблицу материалов) по настройке аппаратного и программного обеспечения. Выполните калибровку кадра, как описано в руководстве. Если дрель или рама перемещены, рекомендуется повторно откалибровать сверло для обеспечения точности.

2. Подготовка программного обеспечения

  1. Перейдите к хирургическому программному обеспечению (см. Таблицу материалов) и создайте новый проект, выбрав Начать с чистого проекта. Установите объект в качестве мыши вверху, чтобы обозначить координаты бурения, которые будут использоваться.
  2. Выберите Начать новый проект.
  3. Отсюда нажмите « Планирование » в левом нижнем углу, чтобы перейти к экрану планирования координат бурения. Создайте схему сверления для выполняемой техники черепного окна.
    1. Для этого щелкните в любом месте стереотаксического атласа. Используйте Bregma в качестве эталона и введите следующие координаты для моторной коры: AP = 1,50, ML = 1,25, DV = 0,00. Нажмите Enter на клавиатуре, чтобы обновить выбранные координаты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дорсально-вентральные (DV) координаты обозначают глубину бурения и поэтому не нуждаются в вводе здесь.
    2. Нажмите кнопку «Сохранить цель», чтобы сохранить эти координаты и ввести соответствующее имя. Отсюда нажмите кнопку «Переместить» в левом нижнем углу, чтобы вернуться к основному экрану сверления.
  4. Нажмите кнопку "Сервис" > " Проект" > "Сохранить как ", чтобы повторно использовать этот шаблон для последующих проектов. Это автоматически сохранит координаты бурения для последующего использования.

3. Подготовка к операции

  1. Анестезируют мышей PrismPlus30,31 (см. Таблицу материалов) в изофлурановой камере (3,5% в 1,5 л/минO2). Нанесите смазку для глаз, чтобы предотвратить высыхание глаз, побрейте голову с помощью кусачек и подстригите ногти, чтобы мыши не выцарапали швы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши PrismPlus представляют собой тип трансгенных флуоресцентных видов, используемых в многофотонной визуализации. У гетерозиготных мышей PrismPlus отсутствуют флуоресцентные гены, и поэтому они были использованы здесь для сокращения отходов животного происхождения из других текущих исследований, и поскольку в этом исследовании нет многофотонной визуализации. Ожидается, что мыши дикого типа покажут аналогичные результаты.
  2. Вводят подкожные инъекции антибиотика цефазолина (24 мг / кг), обезболивающего карпрофена (5 мг / кг) и бупренорфина (0,05-0,10 мг / кг) анестезированным мышам. Перед любым разрезом введите одну подкожную инъекцию маркаина (0,25%, 100 мкл) ниже места разреза (1 дюйм вдоль средней линии черепа, начиная за глазами).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лекарства, используемые здесь, следуют ранее установленным протоколам IACUC. Тем не менее, рекомендуется рассматривать крем EMLA в качестве местного анестетика для мультимодального эффекта перед операцией и инъекцией в хвостовую вену, а также Meloxicam SR вместо карпрофена. EMLA и Meloxicam SR могут быть предоставлены до анестезии изофлураном.
  3. Установите животное на стереотаксическую раму хирургического робота, используя прилагаемые ушные вкладыши, и поддерживайте анестезию 0,5-2% изофлурана путем ингаляции через носовой конус.
  4. Убедитесь, что глубина анестезии тщательно контролируется обученным ветеринарным техником или персоналом в зависимости от чувствительности мыши, дыхания (~ 55-65 вдохов в минуту), частоты сердечных сокращений (300-450 ударов в минуту) и цвета (розовый). Защемление усов и обычных пальцев ног также может быть использовано в качестве меры для определения глубины анестезии. Значения жизненно важных показателей определяются институциональными правилами IACUC.
  5. Поддерживайте температуру тела животного на циркуляционной водяной подушке и контролируйте жизненно важные показатели с помощью системы измерения кислорода в крови и частоты сердечных сокращений.
  6. Очистите операционную область хлоргексидина глюконатом (CHG) и 70% изопропанолом для стерилизации. Чтобы сохранить стерильность во время операции, наденьте стерильную полиэтиленовую пленку на мышь и стереотаксическую рамку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что эти протоколы были разработаны для операций по выживанию, представленные данные отражают использование животных, не являющихся выживальщиками, поскольку основное внимание уделялось тестированию и определению соответствующих методов протокола бурения.

4. Подготовка черепа

  1. Используя лезвие скальпеля, выполните разрез в 1 дюйм по средней линии черепа, начиная с задней части глаз.
  2. Оттяните кожу назад, чтобы обнажить череп, и (необязательно) используйте ретракторы для поддержания хирургического окна. Удалите остатки ткани и мембраны с помощью стерильных аппликаторов с ватными наконечниками.
  3. Высушите и очистите череп с помощью 3% перекиси водорода с помощью аппликаторов с ватными наконечниками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это сделает видимыми швы черепа. Брегма и лямбда должны быть легко видны. Если нет, нанесите больше перекиси водорода или увеличьте размер разреза.
  4. Обеспечьте функцию «автоматической остановки», подключив кабель зажима типа «крокодил» от установки для сверления хирургического робота к мыши в соответствии с рекомендациями производителя. «Автостоп» работает, обнаруживая изменение импеданса, поэтому, как только сверло контактирует со спинномозговой жидкостью (CSF) вместо кости, сверло перестает сверлить, тем самым предотвращая повреждение мозга.

5. Эванс Блю Инъекция в хвостовую вену

ВНИМАНИЕ: ЭБ является возможным канцерогеном. При работе используйте перчатки.

  1. Чтобы подготовить хвост к легкому уколу, протрите спиртовой салфеткой. По желанию масло грушанки можно применять местно для расширения вены35.
  2. Возьмитесь за хвост в одной руке, а в другой руке держите шприц с ЭБ. Большим и указательным пальцами согните хвост, чтобы обнажить хвостовую вену поверх изгиба хвоста. Вставьте шприц (1 или 2 мл, инсулиновый шприц 30 г) параллельно вене и медленно вводите объем БЭ. ЭБ (4% мас./об.) вводят в концентрации 2 мл/кг массы тела путем инъекции в хвостовую вену.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальное сопротивление потоку из шприца в хвост можно почувствовать, если игла введена правильно. Если есть сопротивление или в хвосте появляется краситель EB, то двигайтесь вниз по хвосту и повторите попытку.
  3. После инъекции подождите 5 минут, чтобы позволить EB циркулировать по всей мыши, прежде чем начать сверление. Успешная инъекция немедленно проверяется, когда конечности мыши и хирургическое окно становятся синими.

6. Процедура хирургического роботизированного бурения

  1. Как только череп будет подготовлен к сверлению, вернитесь к хирургическому программному обеспечению. Откройте шаблонный проект, определенный на шаге 2.4, в котором были назначены координаты для бурения.
    1. Перейдите в раздел "Сервис" > "Проект" > " Создать" > выберите шаблон проекта и выберите шаблон проекта, который был назначен на шаге 2 (подготовка программного обеспечения).
    2. Выберите те же элементы протокола > Планирование (целевые точки) > Параметры бурения для переноса в этот новый проект.
    3. Нажмите кнопку Начать новый проект.
  2. Затем исправьте сверло и раму, чтобы учесть наклон и масштабирование черепа мыши текущего животного. Нажмите «Инструменты » и выберите «Исправить для наклона и масштабирования...», чтобы открыть экран коррекции. В верхней части экрана убедитесь, что дрель активна (а не шприц), нажав на светло-красную кнопку «Сверло ».
    ПРИМЕЧАНИЕ: После активации кнопка Drill станет темной/ярко-красной. Кнопку шприца можно игнорировать, так как она не используется в этом протоколе.
    1. Во-первых, исправьте масштаб, тангаж и рыскание, установив, где Bregma и Lambda находятся на текущем животном. Используйте элементы управления с клавиатуры или экранные элементы управления для перемещения сверла. Как только сверло окажется над Bregma, опустите его до тех пор, пока оно не коснется черепа, и нажмите «Установить Bregma». Повторите это для Lambda.
    2. Затем отрегулируйте конкретный рулон черепа. Нажмите кнопку «Перейти к средней точке », чтобы автоматически настроить сверло по центру черепа. Нажмите на 2 мм влево , а затем медленно опустите сверло, пока не коснется черепа. Нажмите кнопку Установить левую точку.
    3. Повторите шаг 6.2.2 для правого полушария мозга. Теперь система настроена для этого конкретного черепа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коррекция здесь имеет решающее значение для обеспечения правильных координат и глубины бурения. Мышь должна быть установлена как можно ближе к прямой, чтобы максимально снизить потребность в коррекции. Если требуются большие поправки, это может привести к низкой точности сверления.
  3. После того, как исправление было выполнено, выйдите из окна коррекции, нажав кнопку Закрывать в нижней средней части экрана. Перейдите к экрану сверления, нажав Инструменты а затем выбрав Сверло... начать процедуру сверления.
    1. Убедитесь, что в раскрывающемся списке «Сверло» в верхней части экрана выбран пункт «Форма черепа». Затем нажмите «Выбрать центр и форму сверления» и выберите предопределенную цель, которая была названа на шаге 2.3.1. На этом экране выберите Круг в качестве формы для цели и введите 2,60 мм в качестве диаметра2 круга. Нажмите кнопку Показать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр черепного окна создается с использованием центра сверла в качестве центра затравочных точек. Маленькое сверло (диаметр = 0,6 мм или рекомендуемый размер долота, предоставленный поставщиком) используется для минимизации дополнительного диаметра, добавляемого в результате использования большего сверла. Специально для хирургического робота используются специальные сверла. Восемь начальных точек и краевых точек теперь будут отображаться на черепе в виде зеленых и синих точек соответственно.
    2. Нажмите на главное окно и используйте сочетание клавиш Control + Shift + D , чтобы открыть меню Drill Points в правой части экрана. Это позволяет просматривать определенные глубины и состояния точек бурения.
    3. Перед началом бурения при необходимости настройте функцию автоматической остановки, нажав кнопку рядом с флажком «Автоматическая остановка ». По умолчанию эта кнопка имеет значение «Средний», что соответствует чувствительности функции автоматической остановки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно проверить заранее, чтобы найти правильную чувствительность для животных. В этом протоколе была использована высочайшая чувствительность, чтобы обеспечить минимальное сверление мозга.
    4. После того, как функция автоматической остановки включена и настроена, начните посев в точку посева. Нажмите «Автоматическое сканирование », чтобы бурение автоматически начиналось с начального числа 1. Как только сверло коснется спинномозговой жидкости, функция автоматической остановки обнаружит изменение импеданса, что приведет к остановке сверления и втягиванию долота из черепа.
    5. Внимательно следите за сверлением на случай, если автоматическая остановка не обнаружит каких-либо изменений. Клавишу Escape можно нажать, чтобы вручную отменить сверление. Розовый кружок, расположенный в нижней части меню «Сверло» и справа от значений импеданса, также можно щелкнуть, чтобы начать или остановить сверление.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сверло автоматически просверлит на глубину, равную расчетной толщине черепа (или до тех пор, пока не будет активирована функция автоматической остановки).
    6. Если автоматическая остановка не активирована до достижения расчетной глубины, появится экран с предложением к пользователю: 1) Продолжить бурение и спуск # мм дальше, 2) Отметить текущую глубину и продолжить, 3) Пропустить текущую точку и продолжить, или 4) Остановить процесс (может быть продолжено позже). Выберите один из вариантов, как описано ниже.
      1. Для продолжения сверления и дальнейшего спуска # мм введите расстояние, на которое сверло будет продвигаться вперед. По умолчанию используется 0,1 мм. Меньшее расстояние может быть предложено, чтобы предотвратить случайное проникновение в мозг.
      2. Если считается, что твердая мозговая оболочка была достигнута на этом экране, выберите опцию «Отметить на текущей глубине и продолжить», чтобы система отметила твердую мозговую оболочку на этой глубине и перешла к следующему семени.
      3. Используйте команды « Пропустить текущую точку и продолжить » и «Остановить процесс» (может быть продолжено позже), чтобы устранить неполадки или очистить сверло и вернуться, как только автоматическая остановка снова заработает.
    7. После того, как все точки посева будут просверлены, если какая-либо из них не была завершена с помощью функции автоматической остановки, проверьте глубину отверстия вручную с помощью кирки твердой мозговой оболочки. Это гарантирует, что просверленная глубина все-таки проникнет сквозь череп.
    8. Прежде чем приступить к сверлению по краевой точке, решите, какой тип «кромкорезки» нужен, выбрав раскрывающийся список рядом с текстом « Кромка » в меню «Сверление». Два варианта: «Точка за точкой » и « По горизонтали».
      1. Выберите «Точка за точкой», чтобы просверлить каждую крайнюю точку по отдельности и на глубину, определяемую глубиной соседней начальной точки. При необходимости отрегулируйте масштабирование с помощью кнопки «Масштабирование краев...» ниже, хотя обычно достаточно значения по умолчанию «Без масштабирования».
      2. Выберите «По горизонтали», чтобы начать сверление в краевой точке 1, и используйте непрерывное движение сверления, чтобы обойти всю окружность сверлильного круга. По умолчанию горизонтальный разрез будет разрезаться с интервалом 100 мкм, проходя по окружности окна, прежде чем продвинуться еще на 100 мкм вглубь. При необходимости измените глубину интервала и скорость сверления под кнопкой «Параметры резки...» ниже.
      3. Используйте смещение автоматической резки (под полем Edge-Cut ), чтобы отрегулировать глубину автоматического разреза, взяв заданное смещение от соседних точек затравки. В этом протоколе использовалось смещение автоматической резки 20 мкм. Дальнейшее тестирование может быть проведено для определения оптимального смещения для каждого животного.
    9. После того, как настройки кромки определены, начните сверление кромки, нажав кнопку « Автоматическая резка » в середине меню «Сверление». При точечном бурении, как только последняя кромка просверлена, процедура сверления завершается. Для горизонтального сверления продолжайте до тех пор, пока не будет просверлено достаточное количество черепа, чтобы освободить черепное окно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что сверление выполняется до тех пор, пока окно не будет освобождено, окно здесь физически не освобождается, чтобы предотвратить повреждение подлежащих тканей. Важно изолировать повреждения в результате простого сверления, чтобы оценить различные схемы бурения.
      1. Как только горизонтальное бурение достигнет глубины одной точки затравки, щелкните правой кнопкой мыши по этой затравке (или сначала выберите несколько точек) в меню «Точки сверления» и выберите « Глубина блокировки». Это позволит продолжить горизонтальную резку, не разрезая глубже эту область (таким образом, избегая проникновения в мозг).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть точки заделки с разной глубиной твердой мозговой оболочки, это может привести к различиям в глубине, необходимой для процедуры горизонтального бурения.
    10. Если функция автоматической остановки работает неправильно, убедитесь, что сверло полностью очищено от мусора или потенциальной крови, физиологического раствора и т. д., так как это может повлиять на импеданс основания долота. Кроме того, выберите один из нескольких вариантов ручного сверления, описанных ниже, на случай, если автоматическая остановка не будет работать стабильно.
      1. В меню «Сверление» вручную перейдите к каждому семени, щелкнув правой кнопкой мыши семя или край и выбрав «Перейти к вводу». Есть также варианты очистки отмеченной глубины, сброса отверстия и другие варианты, которые могут помочь в процедуре бурения.
      2. Вручную управляйте увеличением глубины бурения, выбирая глубину из раскрывающегося списка, расположенного рядом с текстом «Продвижение:» в верхней части меню «Бурение». Нажмите кнопку «Вперед » прямо ниже, чтобы продвинуть сверло на заданное расстояние.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эту функцию можно использовать в сочетании с кнопками Set Dura и Set Surface под кнопкой Advance , чтобы вручную сообщить системе, где находится поверхность черепа и твердой мозговой оболочки. По возможности используйте функцию автоматической остановки, но при необходимости этих ручных опций также достаточно.
      3. Если вы сверлите вручную, будьте более осторожны между каждым интервалом глубины бурения, чтобы убедиться, что сверло не выходит за пределы твердой мозговой оболочки. Проверьте просверленное отверстие с помощью отмычки твердой мозговой оболочки между интервалами глубины, чтобы убедиться, что твердая мозговая оболочка была достигнута. После того, как все ручное высевание семян будет завершено, продолжайте процедуру обрезки кромок в обычном режиме, как описано выше.
    11. Импульсный метод
      1. Чтобы выполнить ручное импульсное сверление, отключите функцию автоматической остановки, сняв флажок рядом с опцией « Автоостановка » в меню «Сверло». Он должен быть выключен, чтобы можно было контролировать, когда дрель выключена для пульсации.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Импульсное сверление следует схеме 2 с сверления, за которым следуют 2 секунды без сверления, чтобы позволить черепу остыть.
      2. В меню «Сверло» выберите 100 мкм в качестве повышения глубины бурения, это будет равняться ~ 2 с бурения вниз.
      3. Когда все будет готово, нажмите «Вперед », чтобы начать бурение.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте готовы быстро остановить сверло, как только оно продвинется на 100 мкм, так как сверло продолжает вращаться на глубине до тех пор, пока не будет нажата выходка (выделяя ненужное тепло).
      4. Как только сверло продвинутся на 100 мкм, дважды нажмите клавишу Escape , чтобы остановить сверло. Через 2 с повторите этот цикл для глубины черепа.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Только точечный метод может быть выполнен с использованием импульсного метода из-за программных и механических ограничений. Непрерывное горизонтальное бурение таким способом не может быть выполнено.
      5. Просверлите все точки семян и краев, используя этот метод, описанный выше. Обязательно установите Dura с помощью кнопки в меню «Сверление», как только твердая мозговая оболочка будет достигнута.

7. Перфузия и экстракция мозга

  1. После того, как посев семян и краевых точек завершен, держите животное под изофлурановой анестезией еще 1 час, чтобы позволить красителю EB циркулировать и экстравазироваться через поврежденный ГЭБ. Выполните сердечную перфузию, чтобы удалить кровь или жидкости из сосудов, а затем удалите мозг для визуализации и анализа, как описано ниже.
    1. После 1-часового периода кровообращения после создания черепного окна внутрибрюшинно животному вводят коктейль из кетамина (160 мг/кг) и ксилазина (20 мг/кг). После того, как вы перестали реагировать, выполните сердечную перфузию.
    2. Разрежьте брюшко мыши с помощью ножниц и обнажите сердце, разрезав вертикально через грудную клетку и горизонтально через диафрагму. Втяните грудную клетку, чтобы четко видеть сердце. Вставьте иглу-бабочку в левый желудочек сердца и начните вводить 1x фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) по всему телу. Отрежьте небольшую часть правого предсердия сердца, чтобы снять нарастающее давление.
    3. После того, как 25 мл 1x PBS перфузируется по всему телу, остановите перфузию и обезглавьте мышь в качестве вторичного средства эвтаназии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно выполните одобренный учреждением метод эвтаназии и / или конечной перфузии для животного, чтобы изолировать мозг.
    4. Отсюда извлеките мозг из черепа, удалив кость и ткань с помощью ронгеров.
    5. Сфотографируйте извлеченный мозг с помощью флуоресцентной системы визуализации, чтобы наблюдать за количеством БЭ, расположенного в мозге вокруг мест бурения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: EB связывается с циркулирующим альбумином. Если в головном мозге происходит повреждение сосудов, БЭ вытекает наружу и связывается с тканью мозга, что приводит к четкому визуальному признаку повреждения.

8. Визуализация и анализ Эванса Блю

  1. Аппаратная инициализация
    1. Включите компьютер, подключенный к системе флуоресцентной визуализации EB, и запустите программное обеспечение для визуализации (см. Таблицу материалов) по мере подготовки других элементов. Включите источник света, платформу и камеру в указанном порядке.
    2. Перейдите к программному обеспечению для работы с изображениями и нажмите «Инициализировать» на панели управления сбором данных. Система и камера перейдут с красного на зеленый сигнал, как только инициализация будет завершена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инициализируйте флуоресцентную систему визуализации EB за 30 минут до любой визуализации, чтобы температура источника света достигла оптимального уровня.
  2. Визуализация головного мозга
    1. Поместите эксплантированный мозг в прозрачную посуду в центре сцены для визуализации.
    2. На панели управления сбором данных настройте параметры изображения. Выберите время экспозиции: 1 с; Биннинг: Средний; F/Stop: F1; Возбуждение: от 535 до 675 нм; Эмиссия: Cy 5,5; Уровень лампы: высокий; и угол обзора: 5 см. Оставьте фильтр заблокированным, а наложение фотографии и флуоресценции проверено. Эти настройки основаны на предыдущем лабораторном опыте и других опубликованных методах визуализации EB36.
  3. Загрузите изображения флуоресцентной системы визуализации EB в программное обеспечение для обработки изображений с открытым доступом (см. Таблицу материалов) и сгенерируйте три области интереса (ROI) от руки, чтобы найти интенсивность флуоресценции EB, измеряя среднее излучение на фоне, всем мозге и черепном окне.
    1. Нормализуйте измерения черепного окна и всего мозга на соответствующем фоне ROI.
    2. Изображение каждого мозга под различными фильтрами возбуждения (535-675 нм), чтобы найти длину волны с наибольшим отношением сигнал/шум (было выбрано 605 нм) между экспериментальными группами и физиологическим раствором.
      1. Изолируйте среднее излучение при соответствующей длине волны и среднем, чтобы получить среднее среднее излучение или интенсивность флуоресценции для всего мозга и окупаемости инвестиций в окно черепа.
  4. Найдите и нормализуйте среднее среднее излучение над областью черепного окна для каждой группы по сравнению с физиологическим раствором.

9. Оценка термопары

  1. Измерьте изменения температуры черепа и мозга с помощью термопары (см. Таблицу материалов) в сочетании с тремя различными схемами сверления. Термопара подключена к системе сбора данных (DAQ), которая позволяет считывать результаты измерений в MATLAB.
  2. Установите мышь с изображением трупа на стереотаксическую раму и роботизированную буровую установку. Вручную просверлите небольшое отверстие (того же размера, что и точка затравки) на расстоянии ~ 2 мм от того места, где черепное окно будет сделано в боковой части черепа25. Это отверстие позволит сдвинуть термопару в нужное положение под тем местом, где происходит сверление черепного окна (рис. 2D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трупные мыши используются, потому что требуется просверлить боковую часть черепа, чтобы скользить термопарой по области сверления черепного окна. Эта трупная мышь отличается от той, которая ранее использовалась для анализа Эванса Блю.
  3. Начните процесс сверления для каждой из трех схем, как это было сделано ранее (шаг 6). По мере того, как сверло проходит через череп, будут наблюдаться всплески изменения температуры, указывающие на нагрев, происходящий вблизи мозга.
  4. Запишите и отобразите результаты в MATLAB, чтобы рассчитать максимальную разницу температур. Это следует делать отдельно для посевного и кромочного бурения, чтобы оценить горизонтальное и точечное бурение вместе с импульсным методом ручного посева.

10. Статистика

  1. Проведите статистический анализ флуоресцентной визуализации термопары и ЭБ в R с использованием критерия ранговой суммы Крускала-Уоллиса с поправкой Бенджамини-Хохберга с последующим попарным сравнением с использованием точного критерия суммы рангов Уилкоксона25.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Термическая оценка
Потенциал термического повреждения оценивали путем измерения изменения температуры от исходной линии из-за бурения с использованием горизонтального (рис. 2А), точечного (рис. 2В) и импульсного точечного (рис. 2В) методов. На рисунке 2D показана экспериментальная установка для получения тепловых данных. Для термической оценки использовался размер выборки N = 4 череп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Использование красителя EB и визуализации является простым, быстрым и полезным для оценки сосудистых повреждений в головном мозге для новых методов и техник. Независимо от того, используете ли вы хирургического робота или подтверждаете методы, которые в настоящее время проводятся в лаборатории, важно проверить хирургические методы, чтобы изолировать эффекты экспериментального лечения от хирургического воздействия и улучшить благополучие животных. Установка термопары также полезна при оценке методов бурения, чтобы убедить...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет каких-либо конфликтов интересов, о которых можно было бы сообщить. Содержание не отражает точку зрения Министерства по делам ветеранов США, Национальных институтов здравоохранения или правительства Соединенных Штатов.

Благодарности

Это исследование было частично поддержано наградами за заслуги GRANT12418820 (Кападона) и GRANTI01RX003420 (Шоффстолл/Кападона), а также премией за карьеру ученого-исследователя # GRANT12635707 (Кападона) от Службы исследований и разработок в области реабилитации Министерства по делам ветеранов США (США). Кроме того, эта работа также была частично поддержана Национальным институтом здравоохранения, Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта GRANT12635723 (Кападона) и Национальным институтом биомедицинской визуализации и биоинженерии, T32EB004314 (Capadona/Kirsch). Этот материал основан на работе, поддержанной стипендией Национального научного фонда для аспирантов в рамках гранта No GRANT12635723. Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения Национального научного фонда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1x Фосфатный буферный физиологический раствор
Тип: Реагент		VWRMRGF-6235Для Evans Blue dilution
Aura Программное обеспечение
Тип: Инструмент		Spectral Instruments Программное обеспечение для визуализациидля систем визуализации Lumina
Buprenorphine
Тип:		Лекарство получено из животноводческого хозяйства
Твердосплавное сверло, 0,6 мм (роботизированное сверло)
Тип:		Инструмент Stoelting58640-1
Carprofen
Тип: Препарат		получен из животного комплекса
Cefazolin
Тип: Препарат		получен из животного комплекса
Evans Blue Dye
Тип: Реагент		Millipore SigmaE2129Восстановлен в 1x фосфатно-солевом буфере
Isoflurane
Тип: Лекарство		Получено из животного комплекса
IVIS Lumina II
Тип: Инструмент		Perkin ElmerCLS136334IVIS Lumina III в настоящее время заменяет Lumina II на рынке
Линеаризующий термометр Jenco
Тип: Инструмент		Jenco765JFДля установки термопары
Ketamine
Тип: Лекарство		получено из животного комплекса
LivingImage
Тип: Инструмент		Perkin ElmerПрограммное обеспечение для IVIS Lumina III
Marcaine
Тип: Лекарство		Получено из животного комплекса
Neurostar Software
Тип: Установка инструмента		Поставляется с хирургическим роботом
Покупка Physiosuite с MouseSTAT® Пульсоксиметр и Пульсометр
Тип: Инструмент		Kent ScientificPS-03Используется для мониторинга жизненно важных функций
мышей PrismPlus
Тип: Животное		Jackson Labortory031478, RRID:IMSR_JAX:031478, самец, ~8 месяцевЖивотные, используемые для исследования
Дрель и робот для инъекций для моторизованных стереотаксических инструментов
Тип: Инструмент		Stoelting58640Основная роботизированная дрель со стереотаксической рамой
Термопара
Тип: Инструмент		TC Direct206-557Для установки термопары
USB-6008 Многофункциональный ввод/вывод DAQ
Тип: Инструмент		National InstrumentsUSB-6008Для установки термопары
Xylazine
Тип: Лекарство		получено на животноводческом предприятии
Открытый доступ к визуализации

Ссылки

  1. Kilic, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Frontiers in Physiology. 11, 612678(2020).
  2. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  3. Augustinaite, S., Kuhn, B. Intrinsic optical signal imaging and targeted injections through a chronic cranial window of a head-fixed mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100779(2021).
  4. Wang, X., et al. A skull-removed chronic cranial window for ultrasound and photoacoustic imaging of the rodent brain. Frontiers in Neuroscience. 15, 673740(2021).
  5. Wang, Y., Xi, L. Chronic cranial window for photoacoustic imaging: a mini review. Visual Computing for Industry, Biomedicine, and Art. 4 (1), 15(2021).
  6. Augustinaite, S., Kuhn, B. Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice. STAR Protocols. 1 (3), 100194(2020).
  7. Kunori, N., Takashima, I. An implantable cranial window using a collagen membrane for chronic voltage-sensitive dye imaging. Micromachines. 10 (11), 789(2019).
  8. Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
  9. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818(2016).
  10. Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 694-701 (2012).
  11. Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  12. Sundaram, G. S., et al. Characterization of a brain permeant fluorescent molecule and visualization of Abeta parenchymal plaques, using real-time multiphoton imaging in transgenic mice. Organic Letters. 16 (14), 3640-3643 (2014).
  13. Spires, T. L., et al. Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. Journal of Neuroscience. 25 (31), 7278-7287 (2005).
  14. Price, D. L., et al. High-resolution large-scale mosaic imaging using multiphoton microscopy to characterize transgenic mouse models of human neurological disorders. Neuroinformatics. 4 (1), 65-80 (2006).
  15. Kimchi, E. Y., Kajdasz, S., Bacskai, B. J., Hyman, B. T. Analysis of cerebral amyloid angiopathy in a transgenic mouse model of Alzheimer disease using in vivo multiphoton microscopy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 60 (3), 274-279 (2001).
  16. Hyman, B. T. The natural history of Alzheimer disease dissected through multiphoton imaging of transgenic mice. Alzheimer Disease and Associated Disorders. 20 (4), 206-209 (2006).
  17. Korzhova, V., et al. Long-term dynamics of aberrant neuronal activity in awake Alzheimer's disease transgenic mice. Communications Biology. 4 (1), 1368(2021).
  18. Chawda, C., McMorrow, R., Gaspar, N., Zambito, G., Mezzanotte, L. Monitoring immune cell function through optical imaging: a review highlighting transgenic mouse models. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 250-263 (2022).
  19. Courtin, J., et al. A neuronal mechanism for motivational control of behavior. Science. 375 (6576), (2022).
  20. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680(2008).
  21. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100(2021).
  22. Eles, J. R., Vazquez, A. L., Kozai, T. D. Y., Cui, X. T. Meningeal inflammatory response and fibrous tissue remodeling around intracortical implants: An in vivo two-photon imaging study. Biomaterials. 195, 111-123 (2019).
  23. Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001(2015).
  24. Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
  25. Shoffstall, A. J., et al. Potential for thermal damage to the blood-brain barrier during craniotomy: implications for intracortical recording microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 034001(2018).
  26. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385(2015).
  27. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Scientific Reports. 4, 6588(2014).
  28. Goss-Varley, M., et al. Microelectrode implantation in motor cortex causes fine motor deficit: Implications on potential considerations to Brain Computer Interfacing and Human Augmentation. Scientific Reports. 7 (1), 15254(2017).
  29. Oomoto, I., et al. Protocol for cortical-wide field-of-view two-photon imaging with quick neonatal adeno-associated virus injection. STAR Protocols. 2 (4), 101007(2021).
  30. Dougherty, J. D., Zhang, J., Feng, H., Gong, S., Heintz, N. Mouse transgenesis in a single locus with independent regulation for multiple fluorophores. PLoS One. 7 (7), 40511(2012).
  31. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (3), 4106-4114 (2000).
  32. Kiyatkin, E. A., Sharma, H. S. Permeability of the blood-brain barrier depends on brain temperature. Neuroscience. 161 (3), 926-939 (2009).
  33. Eriksson, A. R., Albrektsson, T. Temperature threshold levels for heat-induced bone tissue injury: a vital-microscopic study in the rabbit. The Journal of Prosthetic Dentistry. 50 (1), 101-107 (1983).
  34. Bonfield, W., Li, C. H. The temperature dependence of the deformation of bone. Journal of Biomechanics. 1 (4), 323-329 (1968).
  35. Hrapkiewicz, K., Medina, L. Clinical Laboratory Animal Medicine, second ed. , Blackwell Publishing. Ames Iowa. (2007).
  36. McLean, R., Moritz, A. R., Roos, A. Studies of thermal Injury. VI. Hyperpotassemia caused by cutaneous exposure to excessive heat. Journal of Clinical Investigations. 26 (3), 497-504 (1947).
  37. Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments. (123), e52642(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Оценка термических повреждений от роботизированной краниотомии для хирургии черепного окна у мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.