Исследование микробной кооперации с помощью визуализационного масс-спектрометрического анализа бактериальных колоний, выращенных на агаре и в тканях во время инфекции

Микробиом человека представляет собой высокодинамичную экосистему, включающую молекулярные взаимодействия бактерий, вирусов, архей и других микробных эукариот. В то время как микробные отношения интенсивно изучались в последние годы, многое еще предстоит понять о микробных процессах на химическом уровне ^1,2. Отчасти это связано с отсутствием инструментов, способных точно измерять сложные микробные среды. Достижения в области масс-спектрометрии визуализации (IMS) за последнее десятилетие позволили проводить пространственное картирование in situ и без меток многих метаболитов, липидов и белков в биологических субстратах ^3,4. Матричная лазерная десорбция/ионизация (MALDI) стала наиболее распространенным методом ионизации, используемым в масс-спектрометрии изображений, включающим использование УФ-лазера для удаления материала с поверхности тонкого среза ткани для измерения с помощью масс-спектрометрии⁴. Этот процесс облегчается применением химической матрицы, равномерно нанесенной на поверхность образца, что позволяет проводить последовательные измерения в растровой схеме по всей поверхности образца. Тепловые карты интенсивности ионов анализируемого вещества затем генерируются после сбора данных. Последние достижения в области источников ионизации и методов отбора проб позволили проанализировать нетрадиционные субстраты, такие как бактериальные⁵ и ^6,7,8 клеточные образцы млекопитающих, выращенные на питательном агаре. Молекулярная пространственная информация, предоставляемая IMS, может дать уникальное представление о биохимической коммуникации взаимодействий микроб-микроб и хозяин-микроб во время инфекции 9,10,11,12,13,14.

При инфекции Clostridioides difficile (CDI) C. difficile подвергается воздействию быстро меняющейся микробной среды в желудочно-кишечном тракте, где полимикробные взаимодействия могут повлиять на исходы инфекции^15,16. Удивительно, но мало что известно о молекулярных механизмах взаимодействия между C. difficile и резидентной микробиотой во время инфекции. Например, энтерококки представляют собой класс условно-патогенных микроорганизмов в микробиоме кишечника и связаны с повышенной восприимчивостью и тяжестью CDI 17,18,19,20. Однако мало что известно о молекулярных механизмах взаимодействия между этими патогенами. Чтобы визуализировать низкомолекулярную связь между этими членами кишечного микробиома, бактериальные макроколонии были выращены здесь на агаре для имитации микроб-микробных взаимодействий и образования бактериальной биопленки в контролируемой среде. Однако получение репрезентативных метаболических распределений при масс-спектрометрическом анализе образцов бактериальных культур с помощью MALDI является сложной задачей из-за высокого содержания воды и неровной топографии поверхности этих образцов. Это в значительной степени вызвано высокой гидрофильной природой агара и неравномерной реакцией поверхности агара при удалении влаги.

Высокое содержание воды в агаре также может затруднить получение однородного матричного покрытия MALDI и может помешать последующему анализу MALDI, выполняемому в вакууме²¹. Например, многие источники MALDI работают при давлении 0,1-10 Торр, что является достаточным вакуумом для удаления влаги из агара и может вызвать деформацию образца. Эти морфологические изменения в агаре, вызванные вакуумной средой, вызывают пузырение и растрескивание в высушенном агаровом материале. Эти артефакты снижают адгезию агара к предметному стеклу и могут привести к демонтажу или отслаиванию образца в вакуумной системе прибора. Толщина образцов агара может составлять до 5 мм от предметного стекла, что может создать недостаточный зазор от ионной оптики внутри прибора, что приведет к загрязнению и/или повреждению ионной оптики прибора. Эти кумулятивные эффекты могут привести к уменьшению ионного сигнала, отражающего топографию поверхности, а не лежащие в основе микробные биохимические взаимодействия. Образцы агара должны быть однородно высушены и прочно приклеены к предметному стеклу микроскопа перед анализом в вакууме.

В данной работе демонстрируется процесс пробоподготовки для контролируемой сушки макроколоний бактериальных культур, выращенных на агаровых средах. Этот многоступенчатый, более медленный процесс сушки (по сравнению с ранее описанными) гарантирует, что агар будет равномерно обезвоживаться, сводя к минимуму эффекты барботирования или растрескивания образцов агара, установленных на предметных стеклах микроскопа. При использовании этого метода постепенной сушки образцы прочно прилегают к предметному стеклу микроскопа и поддаются последующему нанесению матрицы и анализу MALDI. Это проиллюстрировано на примере модельных бактериальных колоний C. difficile , выращенных на моделях агаровой и мышиной ткани, содержащих CDI с присутствием комменсального и условно-патогенного микроорганизма Enterococcus faecalis и без него. Масс-спектрометрический анализ MALDI как бактериальных, так и тканевых моделей позволяет пространственно картировать профили метаболитов аминокислот, обеспечивая новое понимание биоэнергетического микробного метаболизма и коммуникации.

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты на животных были одобрены комитетами по уходу за животными и их использованию Детской больницы Филадельфии и Медицинской школой Перельмана Пенсильванского университета (протоколы IAC 18-001316 и 806279).

ВНИМАНИЕ: Clostridium difficile (C. difficile) и Enterococcus faecalis (E. faecalis) являются патогенами BSLII, и с ними следует обращаться с особой осторожностью. При необходимости используйте надлежащие протоколы обеззараживания.

1. Рост макроколоний бактериальных культур и подготовка к ночной отправке

1. Подготовьте культуры C. difficile и E. faecalis на ночь и выращивайте их по отдельности при 37 ° C в анаэробной камере (85% азота, 10% водорода, 5% углекислого газа) в отваре для инфузии мозга и сердца с добавлением 0,5% дрожжевого экстракта и 0,1% l-цистеина (BHIS). Используйте 1,5% агар для всех образцов с покрытием.
2. Нормализуют бактериальные питательные среды до оптической плотности при 600 нм (OD₆₀₀). Планшет 5 мкл каждой макроколонии на пластины BHIS + l-цистеиновый агар и анаэробно растет в течение 7 дней при 37 ° C. Для макроколоний смешанных видов смешайте бактериальные питательные среды в соотношении 1:1 перед нанесением покрытия.
3. Подготовьте предметные стекла микроскопа с покрытием из оксида индия и олова (ITO), используя омметр, чтобы определить сторону предметного стекла с проводящим покрытием. Используйте писец с ромбовидным наконечником, чтобы вытравить и пометить сторону предметного стекла микроскопа с покрытием ITO.
4. Иссеките всю культуру из пластины для роста агара, а затем установите на предметное стекло микроскопа с покрытием ITO, следя за тем, чтобы пузырьки воздуха не задерживались между агаром и предметным стеклом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Содержание воды в агаровой среде должно позволять культуре естественным образом прилипать к поверхности предметного стекла микроскопа. Видео, иллюстрирующее этот процесс, приведено в дополнительной документации Yang et ^al.22.
5. Поместите колонии в предметные стекла микроскопа для защиты. Храните слайд-боксы размером 8 x 8 дюймов в мешках для транспортировки биологически опасных образцов с горсткой гранул влагопоглотителя и запечатывайте их для ночной транспортировки для дальнейшей обработки и анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно поддерживать сухую среду для бактериальных культур при транспортировке в условиях окружающей среды, чтобы замедлить рост и метаболизм бактерий и сохранить фиксацию бактериальных образцов до анализа. Этот метод доставки был оптимизирован в результате обширных экспериментов и предпочтительнее транспортировки колоний, замороженных в сухом льду. Значительные изменения температуры перед сушкой, как правило, вызывают демонтаж и пузырение под установленным образцом агара.

2. Сушка при температуре окружающей среды бактериальных макроколоний C. difficile + E. faecalis

1. Удалите колонии агарозных бактерий, установленные на предметных стеклах микроскопа с покрытием ITO, из упаковочного материала. Поместите образцы в сухой ящик с влагопоглотителем на 48-72 ч при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это мягкий и медленный процесс сушки, который сводит к минимуму пузырение, растрескивание или отслоение агаровой среды от поверхности предметного стекла микроскопа.
2. Надлежащим образом утилизируйте весь загрязненный упаковочный материал и обеззаразьте рабочее пространство соответствующим бактерицидным/спороцидным дезинфицирующим средством.
3. Визуально осмотрите колонии на наличие деформаций на поверхности агара (например, пузыреобразования, растрескивания, спешивания).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Высота поверхности агарозы должна заметно уменьшаться и лежать ровно поперек предметного стекла.

3. Вакуумная и термоопосредованная сушка бактериальных макроколоний C. difficile + E. faecalis

ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовленный по индивидуальному заказу вакуумный сушильный аппарат (рис. 1) был построен для облегчения удаления избыточной влаги из образцов агара. В этом аппарате используется пластинчато-роторный вакуумный насос, подключенный по линии к биофильтру HEPA, холодная ловушка и камера из нержавеющей стали, куда помещаются образцы бактерий. Трансформатор переменного напряжения подключен к изолированной проволочной нити, что позволяет пользователю нагревать камеру для ускорения процесса сушки.

1. Закройте вакуумную линию с камерой для отбора проб и включите выключатель питания пластинчато-роторного насоса , чтобы вакуумный насос нагрелся и достиг надлежащего вакуумного давления.
2. Включите трансформатор переменного напряжения , чтобы нагреть нить накаливания провода, обернутую вокруг камеры. Отрегулируйте переменный источник питания до тех пор, пока внутренняя температура вакуумной камеры не достигнет ~50 °C. Пока насос прогревается, поместите суспензию сухого льда и 100% этанола в конденсатор холодной ловушки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Холодная ловушка конденсирует любые пары или споры из образца и предотвращает загрязнение системы пластинчато-роторного насоса и масла вакуумного насоса.
3. Откройте вакуумную камеру с помощью гаечного ключа, чтобы ослабить 16-миллиметровые зажимы фланца с двойным кулачком. Вставьте образцы агарозы в камеру и плотно закройте камеру с помощью 16-миллиметровых зажимов с двойным кулачковым фланцем.
4. Откройте клапан насоса, чтобы опорожнить камеру. Дайте образцам высохнуть в течение 60-120 минут (например, при ~150 мТорр).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этого времени сушки достаточно, чтобы удалить большую часть влаги из небольших секций агара. Эмпирическое определение оптимального времени сушки для удаления влаги и уменьшения высоты агара может потребоваться в зависимости от индивидуальной установки и образцов. Значительно более длительное время сушки может привести к тому, что сушеный агар станет хрупким и склонным к растрескиванию.
5. Когда закончите, медленно выпустите вакуумную камеру под давлением окружающей среды, закрыв клапан пластинчато-роторного насоса и открыв внешний клапан для окружающего воздуха. Откройте камеру по ранее указанному протоколу и извлеките высушенный образец агарозы из камеры.
6. Храните образец в сухом ящике с влагопоглотителем до нанесения матрицы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 показаны изображения поверхности агара до и после сушки.

4. Нанесение матрицы MALDI с помощью роботизированного распыления

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как образцы агарозы были тщательно высушены и высота срезов культуры заметно уменьшилась, используйте роботизированный матричный распылитель для равномерного нанесения тонкого покрытия химического матричного соединения MALDI. Эту процедуру следует выполнять в химическом вытяжном шкафу и с надлежащими средствами индивидуальной защиты, включая перчатки, лабораторные очки и лабораторный халат.

1. Выберите соответствующую матрицу MALDI. Чтобы следовать этому протоколу, используйте матрицу 1,5-диаминонафталина (DAN) MALDI для ее благоприятной десорбции и ионизации аминокислот в режиме отрицательных ионов.
2. Приготовьте 10 мл матричного раствора dan maldi 10 мг/мл в 90/10 (об./об.) ацетонитрила/воды. Используйте растворители класса ВЭЖХ, обрабатывайте ультразвуком в течение 30 минут и фильтруйте раствор через нейлоновые шприцевые фильтры 0,2 мкм перед введением в шприцевой насос роботизированного распылителя. Кроме того, готовьте моющие растворы, чтобы обеспечить чистоту линии опрыскивателя между каждым использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Промывочные растворы выбираются для повышения растворимости матрицы и других загрязнений в линии опрыскивателя и облегчения их удаления из системы. Промывочные растворы, используемые в настоящем описании, представляют собой 90/10 (об./об.) ацетонитрил/вода, 50/50 (об./об.) вода/метанол, 99/1 (об./об.) ацетонитрил/уксусная кислота и 95/5 (об./об.) вода/гидроксид аммония.
3. Приложите образец к поддону опрыскивателя и загрузите приготовленные растворы в линию опрыскивателя (рисунок 3). Используя компьютерное программное обеспечение, укажите необходимые параметры, чтобы обеспечить равномерное покрытие матричного компаунда: температура сопла 30 °C, восемь проходов, расход 0,1 мл/мин, схема CC, время высыхания 0 с, 10 фунтов на квадратный дюйм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общепризнано, что большинство патогенов будут инактивированы путем применения матрицы MALDI, которая обычно представляет собой небольшую органическую кислоту или основание.
4. После завершения распыления извлеките образец из поддона опрыскивателя и храните в сушильном шкафу до анализа.

5. Подготовка бактериальных макроколоний к получению данных масс-спектрометрии MALDI

ПРИМЕЧАНИЕ: Все масс-спектрометрические анализы изображений были выполнены с использованием масс-спектрометра ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (FTICR). Этот прибор оснащен лазерной системой Nd:YAG MALDI (2 кГц, 355 нм).

1. Вставьте образец с матричным покрытием в адаптер предметного стекла микроскопа-мишени MALDI и нанесите не менее трех фидуциальных маркеров, охватывающих область образца, с помощью перманентных маркеров (рис. 4). Используйте планшетный сканер для получения оптического изображения предметного стекла микроскопа, включая реперные маркеры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фидуциальные маркеры позволяют регистрировать оптическое изображение в виде камеры MALDI, наблюдаемом в приборе.
2. Определите метод прибора MS, оптимизированный для желаемого диапазона масс, чувствительности и разрешения, который включает калибровку массы, настройки лазера MALDI, параметры ионной оптики и условия ячейки ICR. Для этого метода выберите окно масс 100 Да от m/z 100 до 200 для обогащения газофазного сигнала в режиме отрицательных ионов с использованием подхода непрерывного накопления выбранных ионов (CASI)^,23 который охватывает значения m/z интересующих метаболитов.
3. Откройте программное обеспечение прибора для получения изображений и используйте мастер настройки , чтобы определить имя и местоположение файла, метод сбора MS, области интереса для выборки и пространственное разрешение изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пространственное разрешение 100-300 мкм обычно используется для визуализации бактериальных макроколоний.
4. После того, как все параметры определены, запустите последовательность сбора данных, чтобы последовательно получить масс-спектр на каждом пикселе в определенной области (областях) интереса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время получения изображения зависит от настроек прибора, но обычно составляет от 2 до 6 часов для изображений, содержащих 5 000-10 000 пикселей.

6. Визуализация масс-спектрометрии, анализ данных и идентификация соединений

1. После получения изображения сохраните данные с расширением файла «.mis», который является форматом файла для конкретных поставщиков для платформ масс-спектрометрии изображений. Откройте файл данных в программных пакетах flexImaging или SCiLS или экспортируйте его в непатентованный формат данных, такой как .mzml, и визуализируйте с помощью независимого от производителя программного обеспечения (например, Cardinal²⁴ или MSIreader^25,26).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При открытии данных изображения в flexImaging отображается средний масс-спектр, который представляет собой среднюю интенсивность всех ионов, обнаруженных в отобранных областях. Пики, представляющие интерес, могут быть предварительно идентифицированы на основе точных измерений массы. Как правило, погрешность массы более 5 частей на миллион (ppm) достаточна для идентификации метаболитов на масс-спектрометрах FTICR.
2. Используя указанное программное обеспечение, определите окна масс для интересующих пиков для создания тепловых карт распределения ионов по отобранным областям с ложными цветами.
   1. На дисплее среднего масс-спектра увеличьте масштаб до интересующего пика и выберите соответствующее окно массы, охватывающее область профиля пика.
   2. Щелкните правой кнопкой мыши выделенное массовое окно и выберите « Добавить массовый фильтр...». Пометьте выбранное значение m/z , используя предварительную идентификацию предполагаемого метаболита, определяемую точным измерением массы с высоким разрешением.
   3. Выберите порог интенсивности , чтобы настроить динамический диапазон изображения анализируемого вещества, отображаемого тепловой картой ложных цветов. Далее отрегулируйте параметры фильтрации массы так, чтобы окно массы охватывало область профиля пика, а затем добавьте фильтр массы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация интенсивности может быть выполнена по мере необходимости для улучшения относительной количественной оценки в измеряемых областях. В экспериментах здесь использовался сбор данных CASI (см. ниже), что может сделать методы нормализации общего количества ионов (TIC) и среднеквадратичного (RMS) неточными. Таким образом, все изображения ионов, показанные здесь, отображаются без нормализации.

7. Подготовка и отгрузка неинфицированных контрольных и инфицированных C. difficile тканей слепой кишки мыши

1. Прививают 4-8-недельных мышей-самцов C57BL/6 антибиотиками (0,5 мг/мл цефоперазона или 0,5 мг/мл цефоперазона + 1 мг/мл ванкомицина) в питьевой воде ad libitum в течение 5 дней с последующим 2-дневным периодом выздоровления и последующим заражением.
2. Усыпьте животных путем удушения CO₂ и немедленно извлеките слепую кишку мыши. Добавьте в дистиллированную воду 20%-ную смесь с оптимальной температурой резки (OCT).
3. Поместите образцы на сухой лед, а затем упакуйте и отправьте на анализ; хранить при температуре -80 °C до анализа.

8. Криоссекция неинфицированных контрольных тканей слепой кишки мыши Verus C. difficile

1. Очистите все криосекционное оборудование, промыв его 100% этанолом, и дайте высохнуть перед помещением образцов в криостатную камеру. Подготовьте предметные стекла микроскопа с покрытием ITO, используя омметр, чтобы определить сторону предметного стекла с проводящим покрытием. Используйте писец с ромбовидным наконечником, чтобы вытравить и пометить сторону предметного стекла микроскопа с покрытием ITO.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует носить надлежащие средства индивидуальной защиты, включая перчатки, лабораторные очки, лабораторный халат и криостатные рукава.
2. Проведите криоссекцию на исследовательском криомикротоме. Перенесите ткани слепой кишки мыши со встроенным ОКТ из морозильной камеры с температурой -80 °C в камеру криомикротома (температура камеры 30 °C, температура объекта -28 °C) на сухом льду. Установите образцы тканей для сравнения с помощью масс-спектрометрии визуализации (например, неинфицированный контроль и инфицированный C. difficile) на одно и то же предметное стекло микроскопа, чтобы обеспечить идентичную подготовку образцов обоих типов тканей и обеспечить точное сравнение метаболитов.
3. Внутри камеры криомикротома установите ткань, встроенную в ОКТ, на патрон для образца с помощью дополнительного раствора ОКТ. После того, как раствор OCT затвердеет, закрепите патрон на головке образца. Начните криоссекцию с шагом 10-50 мкм, чтобы достичь желаемой глубины ткани / плоскости органа.
4. Как только будет достигнуто оптимальное поперечное сечение ткани, приступайте к сбору срезов толщиной 12 мкм. Аккуратно обработайте срез с помощью кистей художника и поместите его на предметное стекло микроскопа с тефлоновым покрытием.
5. Прокатите предметное стекло микроскопа с покрытием ITO поверх секции ткани, чтобы собрать ткань с предметного стекла с тефлоновым покрытием. Оттаивание Прикрепите срез ткани к предметному стеклу микроскопа, прижав ладонь к задней части предметного стекла с покрытием ITO. Продолжайте размораживать до тех пор, пока участок ткани не перейдет из полупрозрачного в непрозрачный/матовый цвет.
6. Перенесите предметные стекла микроскопа, установленные на ткани, на сухом льду в сухую коробку с влагопоглотителем для хранения для анализа в тот же день или храните при температуре -80 °C для более длительного хранения.

9. Подготовка неинфицированных контрольных тканей слепой кишки мыши по сравнению с инфицированными C. difficile тканями слепой кишки для матричного применения и масс-спектрометрии визуализации MALDI

1. Выполните матричное нанесение MALDI, используя тот же протокол, который описан на шаге 4 (температура сопла 30 ° C, восемь проходов, расход 0,1 мл / мин, схема CC, время сушки 0 с, 10 фунтов на квадратный дюйм).
2. Выполните масс-спектрометрию изображений MALDI, используя те же протоколы, которые описаны в шагах 5 и 6.
3. Проанализируйте ионные изображения из нескольких биологических реплик и сравните результаты на значимость с помощью сравнения диаграмм интенсивности с использованием статистического программного обеспечения SCiLS, упомянутого выше.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующие статистические тесты и сравнения будут зависеть от приложения и могут включать пространственную сегментацию, классификационные модели и сравнительный анализ для определения дискриминативных и коррелированных спектральных признаков. Сравнительный анализ может включать в себя присвоение p-значений значимым признакам, проведение анализа главных компонентов для сравнения тканей и визуализацию прямоугольных диаграмм для выявления вариаций. Также полезно визуализировать ткань с помощью светлопольной микроскопии участка ткани, окрашенного гематоксилином и эозином (H & E) после визуализационной масс-спектрометрии. Это позволяет четко идентифицировать морфологические особенности ткани и может быть проанализировано после консультации с квалифицированным патологоанатомом.

Мы провели масс-спектрометрию метаболитов MALDI модельных бактериальных колоний и мышей, колонизированных совместно с E. faecalis и C. difficile , для изучения роли аминокислот во взаимодействиях микробов и микробов. Бактериальные макроколонии, выращенные на агаре, служат четко определенной моделью для анализа отчетливых биохимических изменений в образовании бактериальной биопленки. Важно обеспечить контролируемый процесс сушки макроколоний бактериальных культур, выращенных на агаровой среде, чтобы свести к минимуму деформации и растрескивание поверхности агара. Это было достигнуто с помощью двухступенчатого процесса, включающего предварительную сушку с помощью влагопоглотителя при температуре и давлении окружающей среды, за которой следует более быстрая стадия вакуумной сушки, выполняемая при повышенной температуре. Специально изготовленный сушильный аппарат использовался для облегчения обезвоживания агара при улавливании выброса любых бактериальных загрязнителей или спор из образцов (рис. 1). Дополнительный этап вакуумной сушки необходим для обеспечения полного обезвоживания образцов и их деформации при воздействии вакуума MS.

Срезы агара первоначально имели высоту образца 2-4 мм (рис. 2А) и были уменьшены до ~0,5 мм в высоту в соответствии с протоколом сушки (рис. 2В). Важно обеспечить равномерное высыхание по всей поверхности образца во время этого протокола пробоподготовки. Большие колебания высоты образца приведут к расфокусированному лазерному лучу MALDI на поверхности образца, что может отрицательно сказаться на эффективности ионизации и результирующей интенсивности ионов анализируемого вещества. Пример неудачного процесса сушки показан на рисунке 2D, где поверхность агара пузырится и трескается, что делает образец непригодным для дальнейшего анализа. После того, как бактериальный образец был тщательно высушен, с помощью роботизированного распылителя наносится матричный слой DAN MALDI (рис. 3). Этот прибор позволяет точно контролировать параметры распыления, что позволяет наносить однородное матричное покрытие (рис. 2C).

После нанесения матрицы предметные стекла микроскопа, содержащие образцы, вставляются в адаптер предметного стекла для анализа на FTICR MS (рис. 4). Координаты на предметном стекле регистрируются между программным обеспечением для получения изображений масс-спектрометрии и камерой прибора путем предварительного рисования реперных меток на предметном стекле вокруг измеряемых областей (обозначаются символами «+» на рисунке 4). Затем слайд сканируется в цифровом виде с помощью планшетного сканера для записи оптического изображения, которое затем используется для определения последовательности сбора данных в программном обеспечении flexImaging. Мы оптимизировали настройки масс-спектрометрического прибора для передачи и обнаружения анионов метаболитов. Используя обогащение ионов в газовой фазе CASI, было определено окно выделения ионов для селективного накопления ионов при m/z 150 ± 50 Да (рис. 5A), которое содержит массив соединений, наблюдаемых на поверхности ткани. В частности, здесь для инфекции C. difficile мы обнаружили аминокислотные пути, чтобы продемонстрировать интересные и меняющиеся роли во время бактериального катаболизма. На основании точных измерений массы было установлено, что ионные сигналы при m/z 131,083 и m/z 173,104 являются орнитином (погрешность массы 0,34 ppm; Рисунок 5В) и аргинин (массовая погрешность 0,43 ppm; Рисунок 5С) соответственно.

Визуализационная масс-спектрометрия бактериальных макроколоний проводилась на монокультурах C. difficile и на колониях кокультур C. difficile + E. faecalis (рис. 6). Оптическое изображение образцов после нанесения матрицы MALDI выделяет интересующие области приобретения, которые простираются до внешних областей биопленок колоний (рис. 6A, C). Визуализация масс-спектрометрии этих образцов позволяет пространственно картировать метаболиты аминокислот орнитина и аргинина, которые, как было обнаружено, изменены и дифференциально локализованы в присутствии E. faecalis (рис. 6B, D). Например, аргинин значительно более распространен в монокультуре C. difficile по сравнению с кокультурой C. difficile + E. faecalis (рис. 6D). Мы также расширили визуализирующий масс-спектрометрический анализ на мышиные модели инфекции с использованием 8-недельных бесмикробных самок C57BL / 6 мышей, которые были инфицированы либо спорами C. difficile, либо спорами C. difficile + клетками E. faecalis (масса) (5 × 108 / мл), либо транспозонным мутантом, содержащим обе споры C. difficile + клетки E. faecalis (мутант ArcD) (5 × 108 / мл) (рис. 7)27 . Слепая кишка мыши была собрана и заморожена в 25% соединении ОКТ для поддержания формы и точности органа. Соединение ОКТ также помогло поддержать тонкие срезы тканей во время криосекции. Подобно протоколу, упомянутому выше, срезы ткани покрываются матричным слоем DAN MALDI, сканируются с помощью планшетного оптического сканера (рис. 7B) и анализируются с помощью масс-спектрометрии изображений MALDI (рис. 7C). Гистологическое окрашивание проводили на срезах тканей после масс-спектрометрического анализа изображений, а для оценки морфологии тканей использовалось оптическое сканирование светлого поля с высоким разрешением (рис. 7A). Слой эпителиальных клеток явно воспаляется во время инфекции по сравнению с контрольной тканью.

Рисунок 1: Самодельный вакуумный сушильный аппарат. Изготовленный по индивидуальному заказу вакуумный сушильный аппарат используется для ускорения удаления влаги из образцов агара. Образцы помещают в вакуумную камеру, которая герметизируется и откачивается с помощью пластинчато-роторного насоса, а затем нагревается с помощью трансформатора переменного напряжения. Любые загрязняющие пары/споры из образца задерживаются в холодной ловушке и встроенных фильтрах HEPA. Обычно используется давление 100-150 мТорр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Сушка и подготовка бактериальных макроколоний. Оптические изображения образцов агара (А) до и (Б) после удаления влаги с помощью десикации и вакуумной сушки. (C) Матрица 1,5-диаминонафталина MALDI наносится на бактериальную совместную культуру после сушки с помощью роботизированного распылителя. (D) Неудачная сушка обычно приводит к растрескиванию и пузырению внутри агара, что делает его непригодным для дальнейшего анализа. Сокращения: DAN = 1,5-диаминонафталин; MALDI = матричная лазерная десорбция/ионизация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Роботизированное распыление матрицы MALDI на образцы агарозы. Изображения (A) опрыскивателя HTX M5 TM и (B) образцов агарозы, загруженных в роботизированный матричный распылитель для нанесения матрицы MALDI. Аббревиатура: MALDI = матричная лазерная десорбция/ионизация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Адаптер масс-спектрометра с загруженными образцами для анализа. Образцы агарозы с матричным покрытием загружаются в адаптер предметного стекла MTP для анализа MALDI. Реперные маркеры видны в виде черных знаков плюса («+»). Аббревиатура: MALDI = матричная лазерная десорбция/ионизация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Репрезентативные масс-спектры идентифицированных пиков метаболит-ионов. (A) Отрицательный ионный режим Анализ образцов бактериальных культур MALDI позволяет обнаружить десятки метаболитов. Точные измерения массы с высоким разрешением позволяют предварительно идентифицировать (B) орнитин при m/z 131,083 (погрешность массы 0,34 ppm) и (C) аргинин при m/z 173,104 (погрешность массы 0,43 ppm). Масс-спектры получены с использованием разрешающей способности по массе (FWHM) 75 000 при m/z 150. Сокращения: MALDI = матричная лазерная десорбция/ионизация; FWHM = полная ширина при половине максимума. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Визуализационный масс-спектрометрический анализ бактериальных макроколоний. (А,С) На оптических изображениях образцов агарозы показаны области измерения для масс-спектрометрического анализа изображений, которые выделены белыми пунктирными линиями. (Б,Г) Ионные изображения MALDI для орнитина (m/z 131,083, 0,038 ppm) и аргинина (m/z 173,104, 0,60 ppm) показывают уникальное пространственное распределение по бактериальным культурам. Обратите внимание, что шкалы абсолютной интенсивности различаются для изображений ионов совместной культуры, показанных на панелях B и D. Например, аргинин значительно более распространен в монокультуре C. difficile по сравнению с кокультурой в панелях C и D, что означает, что эта шкала интенсивности связана с содержанием аргинина в монокультуре, и, по-видимому, в этой совместной культуре нет аргинина. И наоборот, совместная культура в А и В проецирует интенсивность аргинина на более низкую абсолютную шкалу интенсивности, поскольку это единственный образец на изображении. Сокращения: MALDI = матричная лазерная десорбция/ионизация; CASI = непрерывное накопление выбранных ионов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Визуализационный масс-спектрометрический анализ инфицированных тканей слепой кишки мышей. (A) Микроскопические изображения окрашенных гематоксилином и эозином тканей инфицированной мышиной слепой кишки позволяют визуализировать морфологию тканей. (B) Оптические изображения тканей слепой кишки мыши показывают образцы после нанесения матричного слоя DAN MALDI. (C) Ионные изображения MALDI для орнитина (m/z 131,083, 0,88 ppm) и аргинина (m/z 173,104, 0,15 ppm) демонстрируют уникальное пространственное распределение по образцам тканей. Сокращения: MALDI = матричная лазерная десорбция/ионизация; DAN = 1,5-диаминонафталин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.