Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Исследование микробной кооперации с помощью визуализационного масс-спектрометрического анализа бактериальных колоний, выращенных на агаре и в тканях во время инфекции

2.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64200

⸱

18 ноября 2022 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Florida, 2Division of Protective Immunity, Children’s Hospital of Philadelphia, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

В этой статье

Краткое содержание

Продемонстрирован новый метод пробоподготовки для анализа бактериальных макроколоний на основе агара с помощью масс-спектрометрии с помощью матричной лазерной десорбции/ионизации.

Аннотация

Понимание метаболических последствий микробных взаимодействий, происходящих во время инфекции, представляет собой уникальную проблему для области биомедицинской визуализации. Масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI) представляет собой метод визуализации in situ без меток, способный генерировать пространственные карты для широкого спектра метаболитов. В то время как тонко срезанные образцы тканей в настоящее время регулярно анализируются с помощью этой технологии, визуализационный масс-спектрометрический анализ нетрадиционных субстратов, таких как бактериальные колонии, обычно выращиваемые на агаре в микробиологических исследованиях, остается сложной задачей из-за высокого содержания воды и неровной топографии этих образцов. В этой статье демонстрируется рабочий процесс пробоподготовки, позволяющий проводить масс-спектрометрический анализ этих типов образцов. Этот процесс иллюстрируется с использованием бактериальных макроколоний двух желудочно-кишечных патогенов: Clostridioides difficile и Enterococcus faecalis. Также показано, что изучение микробных взаимодействий в этой четко определенной агаровой среде дополняет исследования тканей, направленные на понимание микробного метаболического взаимодействия между этими двумя патогенными организмами в мышиных моделях инфекции. Визуализационный масс-спектрометрический анализ метаболитов аминокислот аргинина и орнитина представлен в качестве репрезентативных данных. Этот метод широко применим к другим аналитам, микробным патогенам или заболеваниям, а также типам тканей, где требуется пространственная мера клеточной или тканевой биохимии.

Введение

Микробиом человека представляет собой высокодинамичную экосистему, включающую молекулярные взаимодействия бактерий, вирусов, архей и других микробных эукариот. В то время как микробные отношения интенсивно изучались в последние годы, многое еще предстоит понять о микробных процессах на химическом уровне 1,2. Отчасти это связано с отсутствием инструментов, способных точно измерять сложные микробные среды. Достижения в области масс-спектрометрии визуализации (IMS) за последнее десятилетие позволили проводить пространственное картирование in situ и без меток многих метаболитов, липидов и белков в биологических субстратах 3,4. Матричная лазерная десорбция/ионизация (MALDI) стала наиболее распространенным методом ионизации, используемым в масс-спектрометрии изображений, включающим использование УФ-лазера для удаления материала с поверхности тонкого среза ткани для измерения с помощью масс-спектрометрии4. Этот процесс облегчается применением химической матрицы, равномерно нанесенной на поверхность образца, что позволяет проводить последовательные измерения в растровой схеме по всей поверхности образца. Тепловые карты интенсивности ионов анализируемого вещества затем генерируются после сбора данных. Последние достижения в области источников ионизации и методов отбора проб позволили проанализировать нетрадиционные субстраты, такие как бактериальные5 и 6,7,8 клеточные образцы млекопитающих, выращенные на питательном агаре. Молекулярная пространственная информация, предоставляемая IMS, может дать уникальное представление о биохимической коммуникации взаимодействий микроб-микроб и хозяин-микроб во время инфекции 9,10,11,12,13,14.

При инфекции Clostridioides difficile (CDI) C. difficile подвергается воздействию быстро меняющейся микробной среды в желудочно-кишечном тракте, где полимикробные взаимодействия могут повлиять на исходы инфекции15,16. Удивительно, но мало что известно о молекулярных механизмах взаимодействия между C. difficile и резидентной микробиотой во время инфекции. Например, энтерококки представляют собой класс условно-патогенных микроорганизмов в микробиоме кишечника и связаны с повышенной восприимчивостью и тяжестью CDI 17,18,19,20. Однако мало что известно о молекулярных механизмах взаимодействия между этими патогенами. Чтобы визуализировать низкомолекулярную связь между этими членами кишечного микробиома, бактериальные макроколонии были выращены здесь на агаре для имитации микроб-микробных взаимодействий и образования бактериальной биопленки в контролируемой среде. Однако получение репрезентативных метаболических распределений при масс-спектрометрическом анализе образцов бактериальных культур с помощью MALDI является сложной задачей из-за высокого содержания воды и неровной топографии поверхности этих образцов. Это в значительной степени вызвано высокой гидрофильной природой агара и неравномерной реакцией поверхности агара при удалении влаги.

Высокое содержание воды в агаре также может затруднить получение однородного матричного покрытия MALDI и может помешать последующему анализу MALDI, выполняемому в вакууме21. Например, многие источники MALDI работают при давлении 0,1-10 Торр, что является достаточным вакуумом для удаления влаги из агара и может вызвать деформацию образца. Эти морфологические изменения в агаре, вызванные вакуумной средой, вызывают пузырение и растрескивание в высушенном агаровом материале. Эти артефакты снижают адгезию агара к предметному стеклу и могут привести к демонтажу или отслаиванию образца в вакуумной системе прибора. Толщина образцов агара может составлять до 5 мм от предметного стекла, что может создать недостаточный зазор от ионной оптики внутри прибора, что приведет к загрязнению и/или повреждению ионной оптики прибора. Эти кумулятивные эффекты могут привести к уменьшению ионного сигнала, отражающего топографию поверхности, а не лежащие в основе микробные биохимические взаимодействия. Образцы агара должны быть однородно высушены и прочно приклеены к предметному стеклу микроскопа перед анализом в вакууме.

В данной работе демонстрируется процесс пробоподготовки для контролируемой сушки макроколоний бактериальных культур, выращенных на агаровых средах. Этот многоступенчатый, более медленный процесс сушки (по сравнению с ранее описанными) гарантирует, что агар будет равномерно обезвоживаться, сводя к минимуму эффекты барботирования или растрескивания образцов агара, установленных на предметных стеклах микроскопа. При использовании этого метода постепенной сушки образцы прочно прилегают к предметному стеклу микроскопа и поддаются последующему нанесению матрицы и анализу MALDI. Это проиллюстрировано на примере модельных бактериальных колоний C. difficile , выращенных на моделях агаровой и мышиной ткани, содержащих CDI с присутствием комменсального и условно-патогенного микроорганизма Enterococcus faecalis и без него. Масс-спектрометрический анализ MALDI как бактериальных, так и тканевых моделей позволяет пространственно картировать профили метаболитов аминокислот, обеспечивая новое понимание биоэнергетического микробного метаболизма и коммуникации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты на животных были одобрены комитетами по уходу за животными и их использованию Детской больницы Филадельфии и Медицинской школой Перельмана Пенсильванского университета (протоколы IAC 18-001316 и 806279).

ВНИМАНИЕ: Clostridium difficile (C. difficile) и Enterococcus faecalis (E. faecalis) являются патогенами BSLII, и с ними следует обращаться с особой осторожностью. При необходимости используйте надлежащие протоколы обеззараживания.

1. Рост макроколоний бактериальных культур и подготовка к ночной отправке

  1. Подготовьте культуры C. difficile и E. faecalis на ночь и выращивайте их по отдельности при 37 ° C в анаэробной камере (85% азота, 10% водорода, 5% углекислого газа) в отваре для инфузии мозга и сердца с добавлением 0,5% дрожжевого экстракта и 0,1% l-цистеина (BHIS). Используйте 1,5% агар для всех образцов с покрытием.
  2. Нормализуют бактериальные питательные среды до оптической плотности при 600 нм (OD600). Планшет 5 мкл каждой макроколонии на пластины BHIS + l-цистеиновый агар и анаэробно растет в течение 7 дней при 37 ° C. Для макроколоний смешанных видов смешайте бактериальные питательные среды в соотношении 1:1 перед нанесением покрытия.
  3. Подготовьте предметные стекла микроскопа с покрытием из оксида индия и олова (ITO), используя омметр, чтобы определить сторону предметного стекла с проводящим покрытием. Используйте писец с ромбовидным наконечником, чтобы вытравить и пометить сторону предметного стекла микроскопа с покрытием ITO.
  4. Иссеките всю культуру из пластины для роста агара, а затем установите на предметное стекло микроскопа с покрытием ITO, следя за тем, чтобы пузырьки воздуха не задерживались между агаром и предметным стеклом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Содержание воды в агаровой среде должно позволять культуре естественным образом прилипать к поверхности предметного стекла микроскопа. Видео, иллюстрирующее этот процесс, приведено в дополнительной документации Yang et al.22.
  5. Поместите колонии в предметные стекла микроскопа для защиты. Храните слайд-боксы размером 8 x 8 дюймов в мешках для транспортировки биологически опасных образцов с горсткой гранул влагопоглотителя и запечатывайте их для ночной транспортировки для дальнейшей обработки и анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно поддерживать сухую среду для бактериальных культур при транспортировке в условиях окружающей среды, чтобы замедлить рост и метаболизм бактерий и сохранить фиксацию бактериальных образцов до анализа. Этот метод доставки был оптимизирован в результате обширных экспериментов и предпочтительнее транспортировки колоний, замороженных в сухом льду. Значительные изменения температуры перед сушкой, как правило, вызывают демонтаж и пузырение под установленным образцом агара.

2. Сушка при температуре окружающей среды бактериальных макроколоний C. difficile + E. faecalis

  1. Удалите колонии агарозных бактерий, установленные на предметных стеклах микроскопа с покрытием ITO, из упаковочного материала. Поместите образцы в сухой ящик с влагопоглотителем на 48-72 ч при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это мягкий и медленный процесс сушки, который сводит к минимуму пузырение, растрескивание или отслоение агаровой среды от поверхности предметного стекла микроскопа.
  2. Надлежащим образом утилизируйте весь загрязненный упаковочный материал и обеззаразьте рабочее пространство соответствующим бактерицидным/спороцидным дезинфицирующим средством.
  3. Визуально осмотрите колонии на наличие деформаций на поверхности агара (например, пузыреобразования, растрескивания, спешивания).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высота поверхности агарозы должна заметно уменьшаться и лежать ровно поперек предметного стекла.

3. Вакуумная и термоопосредованная сушка бактериальных макроколоний C. difficile + E. faecalis

ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовленный по индивидуальному заказу вакуумный сушильный аппарат (рис. 1) был построен для облегчения удаления избыточной влаги из образцов агара. В этом аппарате используется пластинчато-роторный вакуумный насос, подключенный по линии к биофильтру HEPA, холодная ловушка и камера из нержавеющей стали, куда помещаются образцы бактерий. Трансформатор переменного напряжения подключен к изолированной проволочной нити, что позволяет пользователю нагревать камеру для ускорения процесса сушки.

  1. Закройте вакуумную линию с камерой для отбора проб и включите выключатель питания пластинчато-роторного насоса , чтобы вакуумный насос нагрелся и достиг надлежащего вакуумного давления.
  2. Включите трансформатор переменного напряжения , чтобы нагреть нить накаливания провода, обернутую вокруг камеры. Отрегулируйте переменный источник питания до тех пор, пока внутренняя температура вакуумной камеры не достигнет ~50 °C. Пока насос прогревается, поместите суспензию сухого льда и 100% этанола в конденсатор холодной ловушки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Холодная ловушка конденсирует любые пары или споры из образца и предотвращает загрязнение системы пластинчато-роторного насоса и масла вакуумного насоса.
  3. Откройте вакуумную камеру с помощью гаечного ключа, чтобы ослабить 16-миллиметровые зажимы фланца с двойным кулачком. Вставьте образцы агарозы в камеру и плотно закройте камеру с помощью 16-миллиметровых зажимов с двойным кулачковым фланцем.
  4. Откройте клапан насоса, чтобы опорожнить камеру. Дайте образцам высохнуть в течение 60-120 минут (например, при ~150 мТорр).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этого времени сушки достаточно, чтобы удалить большую часть влаги из небольших секций агара. Эмпирическое определение оптимального времени сушки для удаления влаги и уменьшения высоты агара может потребоваться в зависимости от индивидуальной установки и образцов. Значительно более длительное время сушки может привести к тому, что сушеный агар станет хрупким и склонным к растрескиванию.
  5. Когда закончите, медленно выпустите вакуумную камеру под давлением окружающей среды, закрыв клапан пластинчато-роторного насоса и открыв внешний клапан для окружающего воздуха. Откройте камеру по ранее указанному протоколу и извлеките высушенный образец агарозы из камеры.
  6. Храните образец в сухом ящике с влагопоглотителем до нанесения матрицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 показаны изображения поверхности агара до и после сушки.

4. Нанесение матрицы MALDI с помощью роботизированного распыления

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как образцы агарозы были тщательно высушены и высота срезов культуры заметно уменьшилась, используйте роботизированный матричный распылитель для равномерного нанесения тонкого покрытия химического матричного соединения MALDI. Эту процедуру следует выполнять в химическом вытяжном шкафу и с надлежащими средствами индивидуальной защиты, включая перчатки, лабораторные очки и лабораторный халат.

  1. Выберите соответствующую матрицу MALDI. Чтобы следовать этому протоколу, используйте матрицу 1,5-диаминонафталина (DAN) MALDI для ее благоприятной десорбции и ионизации аминокислот в режиме отрицательных ионов.
  2. Приготовьте 10 мл матричного раствора dan maldi 10 мг/мл в 90/10 (об./об.) ацетонитрила/воды. Используйте растворители класса ВЭЖХ, обрабатывайте ультразвуком в течение 30 минут и фильтруйте раствор через нейлоновые шприцевые фильтры 0,2 мкм перед введением в шприцевой насос роботизированного распылителя. Кроме того, готовьте моющие растворы, чтобы обеспечить чистоту линии опрыскивателя между каждым использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промывочные растворы выбираются для повышения растворимости матрицы и других загрязнений в линии опрыскивателя и облегчения их удаления из системы. Промывочные растворы, используемые в настоящем описании, представляют собой 90/10 (об./об.) ацетонитрил/вода, 50/50 (об./об.) вода/метанол, 99/1 (об./об.) ацетонитрил/уксусная кислота и 95/5 (об./об.) вода/гидроксид аммония.
  3. Приложите образец к поддону опрыскивателя и загрузите приготовленные растворы в линию опрыскивателя (рисунок 3). Используя компьютерное программное обеспечение, укажите необходимые параметры, чтобы обеспечить равномерное покрытие матричного компаунда: температура сопла 30 °C, восемь проходов, расход 0,1 мл/мин, схема CC, время высыхания 0 с, 10 фунтов на квадратный дюйм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общепризнано, что большинство патогенов будут инактивированы путем применения матрицы MALDI, которая обычно представляет собой небольшую органическую кислоту или основание.
  4. После завершения распыления извлеките образец из поддона опрыскивателя и храните в сушильном шкафу до анализа.

5. Подготовка бактериальных макроколоний к получению данных масс-спектрометрии MALDI

ПРИМЕЧАНИЕ: Все масс-спектрометрические анализы изображений были выполнены с использованием масс-спектрометра ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (FTICR). Этот прибор оснащен лазерной системой Nd:YAG MALDI (2 кГц, 355 нм).

  1. Вставьте образец с матричным покрытием в адаптер предметного стекла микроскопа-мишени MALDI и нанесите не менее трех фидуциальных маркеров, охватывающих область образца, с помощью перманентных маркеров (рис. 4). Используйте планшетный сканер для получения оптического изображения предметного стекла микроскопа, включая реперные маркеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фидуциальные маркеры позволяют регистрировать оптическое изображение в виде камеры MALDI, наблюдаемом в приборе.
  2. Определите метод прибора MS, оптимизированный для желаемого диапазона масс, чувствительности и разрешения, который включает калибровку массы, настройки лазера MALDI, параметры ионной оптики и условия ячейки ICR. Для этого метода выберите окно масс 100 Да от m/z 100 до 200 для обогащения газофазного сигнала в режиме отрицательных ионов с использованием подхода непрерывного накопления выбранных ионов (CASI),23 который охватывает значения m/z интересующих метаболитов.
  3. Откройте программное обеспечение прибора для получения изображений и используйте мастер настройки , чтобы определить имя и местоположение файла, метод сбора MS, области интереса для выборки и пространственное разрешение изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пространственное разрешение 100-300 мкм обычно используется для визуализации бактериальных макроколоний.
  4. После того, как все параметры определены, запустите последовательность сбора данных, чтобы последовательно получить масс-спектр на каждом пикселе в определенной области (областях) интереса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время получения изображения зависит от настроек прибора, но обычно составляет от 2 до 6 часов для изображений, содержащих 5 000-10 000 пикселей.

6. Визуализация масс-спектрометрии, анализ данных и идентификация соединений

  1. После получения изображения сохраните данные с расширением файла «.mis», который является форматом файла для конкретных поставщиков для платформ масс-спектрометрии изображений. Откройте файл данных в программных пакетах flexImaging или SCiLS или экспортируйте его в непатентованный формат данных, такой как .mzml, и визуализируйте с помощью независимого от производителя программного обеспечения (например, Cardinal24 или MSIreader25,26).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При открытии данных изображения в flexImaging отображается средний масс-спектр, который представляет собой среднюю интенсивность всех ионов, обнаруженных в отобранных областях. Пики, представляющие интерес, могут быть предварительно идентифицированы на основе точных измерений массы. Как правило, погрешность массы более 5 частей на миллион (ppm) достаточна для идентификации метаболитов на масс-спектрометрах FTICR.
  2. Используя указанное программное обеспечение, определите окна масс для интересующих пиков для создания тепловых карт распределения ионов по отобранным областям с ложными цветами.
    1. На дисплее среднего масс-спектра увеличьте масштаб до интересующего пика и выберите соответствующее окно массы, охватывающее область профиля пика.
    2. Щелкните правой кнопкой мыши выделенное массовое окно и выберите « Добавить массовый фильтр...». Пометьте выбранное значение m/z , используя предварительную идентификацию предполагаемого метаболита, определяемую точным измерением массы с высоким разрешением.
    3. Выберите порог интенсивности , чтобы настроить динамический диапазон изображения анализируемого вещества, отображаемого тепловой картой ложных цветов. Далее отрегулируйте параметры фильтрации массы так, чтобы окно массы охватывало область профиля пика, а затем добавьте фильтр массы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация интенсивности может быть выполнена по мере необходимости для улучшения относительной количественной оценки в измеряемых областях. В экспериментах здесь использовался сбор данных CASI (см. ниже), что может сделать методы нормализации общего количества ионов (TIC) и среднеквадратичного (RMS) неточными. Таким образом, все изображения ионов, показанные здесь, отображаются без нормализации.

7. Подготовка и отгрузка неинфицированных контрольных и инфицированных C. difficile тканей слепой кишки мыши

  1. Прививают 4-8-недельных мышей-самцов C57BL/6 антибиотиками (0,5 мг/мл цефоперазона или 0,5 мг/мл цефоперазона + 1 мг/мл ванкомицина) в питьевой воде ad libitum в течение 5 дней с последующим 2-дневным периодом выздоровления и последующим заражением.
  2. Усыпьте животных путем удушения CO2 и немедленно извлеките слепую кишку мыши. Добавьте в дистиллированную воду 20%-ную смесь с оптимальной температурой резки (OCT).
  3. Поместите образцы на сухой лед, а затем упакуйте и отправьте на анализ; хранить при температуре -80 °C до анализа.

8. Криоссекция неинфицированных контрольных тканей слепой кишки мыши Verus C. difficile

  1. Очистите все криосекционное оборудование, промыв его 100% этанолом, и дайте высохнуть перед помещением образцов в криостатную камеру. Подготовьте предметные стекла микроскопа с покрытием ITO, используя омметр, чтобы определить сторону предметного стекла с проводящим покрытием. Используйте писец с ромбовидным наконечником, чтобы вытравить и пометить сторону предметного стекла микроскопа с покрытием ITO.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует носить надлежащие средства индивидуальной защиты, включая перчатки, лабораторные очки, лабораторный халат и криостатные рукава.
  2. Проведите криоссекцию на исследовательском криомикротоме. Перенесите ткани слепой кишки мыши со встроенным ОКТ из морозильной камеры с температурой -80 °C в камеру криомикротома (температура камеры 30 °C, температура объекта -28 °C) на сухом льду. Установите образцы тканей для сравнения с помощью масс-спектрометрии визуализации (например, неинфицированный контроль и инфицированный C. difficile) на одно и то же предметное стекло микроскопа, чтобы обеспечить идентичную подготовку образцов обоих типов тканей и обеспечить точное сравнение метаболитов.
  3. Внутри камеры криомикротома установите ткань, встроенную в ОКТ, на патрон для образца с помощью дополнительного раствора ОКТ. После того, как раствор OCT затвердеет, закрепите патрон на головке образца. Начните криоссекцию с шагом 10-50 мкм, чтобы достичь желаемой глубины ткани / плоскости органа.
  4. Как только будет достигнуто оптимальное поперечное сечение ткани, приступайте к сбору срезов толщиной 12 мкм. Аккуратно обработайте срез с помощью кистей художника и поместите его на предметное стекло микроскопа с тефлоновым покрытием.
  5. Прокатите предметное стекло микроскопа с покрытием ITO поверх секции ткани, чтобы собрать ткань с предметного стекла с тефлоновым покрытием. Оттаивание Прикрепите срез ткани к предметному стеклу микроскопа, прижав ладонь к задней части предметного стекла с покрытием ITO. Продолжайте размораживать до тех пор, пока участок ткани не перейдет из полупрозрачного в непрозрачный/матовый цвет.
  6. Перенесите предметные стекла микроскопа, установленные на ткани, на сухом льду в сухую коробку с влагопоглотителем для хранения для анализа в тот же день или храните при температуре -80 °C для более длительного хранения.

9. Подготовка неинфицированных контрольных тканей слепой кишки мыши по сравнению с инфицированными C. difficile тканями слепой кишки для матричного применения и масс-спектрометрии визуализации MALDI

  1. Выполните матричное нанесение MALDI, используя тот же протокол, который описан на шаге 4 (температура сопла 30 ° C, восемь проходов, расход 0,1 мл / мин, схема CC, время сушки 0 с, 10 фунтов на квадратный дюйм).
  2. Выполните масс-спектрометрию изображений MALDI, используя те же протоколы, которые описаны в шагах 5 и 6.
  3. Проанализируйте ионные изображения из нескольких биологических реплик и сравните результаты на значимость с помощью сравнения диаграмм интенсивности с использованием статистического программного обеспечения SCiLS, упомянутого выше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующие статистические тесты и сравнения будут зависеть от приложения и могут включать пространственную сегментацию, классификационные модели и сравнительный анализ для определения дискриминативных и коррелированных спектральных признаков. Сравнительный анализ может включать в себя присвоение p-значений значимым признакам, проведение анализа главных компонентов для сравнения тканей и визуализацию прямоугольных диаграмм для выявления вариаций. Также полезно визуализировать ткань с помощью светлопольной микроскопии участка ткани, окрашенного гематоксилином и эозином (H & E) после визуализационной масс-спектрометрии. Это позволяет четко идентифицировать морфологические особенности ткани и может быть проанализировано после консультации с квалифицированным патологоанатомом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы провели масс-спектрометрию метаболитов MALDI модельных бактериальных колоний и мышей, колонизированных совместно с E. faecalis и C. difficile , для изучения роли аминокислот во взаимодействиях микробов и микробов. Бактериальные макроколонии, выращенные на агаре, служат четко определенной моделью для анализа отчетливых биохимических изменений в образовании бактериальной биопленки. Важно обеспечить контролируемый процесс сушки макроколоний бактериальных культур, выращенных на агаровой среде, чтобы свес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Во время масс-спектрометрии визуализации MALDI важно иметь плоскую поверхность образца, чтобы обеспечить постоянный фокусный диаметр падающего лазера MALDI на подложке образца. Отклонения в высоте образца могут привести к смещению лазерного луча MALDI из фокуса, что приведет к изменению диаметра и интенсивности луча, что может повлиять на эффективность ионизации MALDI. Эти изменения в эффективности ионизации могут привести к различиям в интенсивности анализа по всей поверхности ткани, которые не отражают биохимию основно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения (NIH) и Национальным институтом общих медицинских наук (NIGMS) под наградой GM138660. J.T.S. был поддержан семейной летней стипендией Чарльза и Моники Беркетт из Университета Флориды. J.P.Z. был поддержан грантами NIH K22AI7220 (NIAID) и R35GM138369 (NIGMS). A.B.S. был поддержан грантом на обучение клеточной и молекулярной биологии в Университете Пенсильвании (T32GM07229).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 μ m Titan3 нейлоновые шприцевые фильтрыThermo Scientific42225-NN
1,5-диаминонафталин MALDI matrixSigma Aldrich2243-62-1
20 мл шприцы Henke Ject luer lockHenke Sass Wolf4200.000V0 
Конвекционный вакуумметр серии 275iкомпании Kurt J. LeskerKJL275807LL
масс-спектрометр 7T solariX FTICR оснащен лазерной системой Smartbeam II Nd:YAG MALDI (2 кГц, 355 нм);Bruker Daltonics
Раствор уксусной кислоты, подходит для ВЭЖХSigma Aldrich64-19-7
Ацетонитрил, подходит для ВЭЖХ, градиентный класс, ≥ 99,9%Sigma Aldrich75-05-8
раствор гидроксида аммония, 28% NH3 в H2O, ≥ 99,99% на основе следов металловSigma Aldrich1336-21-6
Автоклавируемые пакеты для биологически опасных веществ: 55 галлоновGrainger45TV10
Мешки для транспортировки образцов биологической опасности (8 x 8 дюймов)Fisher Scientific01-800-07
Бульон для инфузии сердцамозга BD Biosciences90003-040
C57BL/6 самцов мышей Jackson Laboratories
Фотосканер и сканер документов CanoScan 9000F Mark II
CM 3050SLeica Biosystems
SigmaAldrichZ268135
Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences Fisher Scientific50-254-51
Дриеритовые адсорбционные гранулыДриерит21005
Этанол, 200 ProofDecon Labs2701
flexПрограммное обеспечение для визуализацииBruker Daltonics
ftmsУправляющее программное обеспечениеBruker Daltonics
Стеклянная вакуумная ловушкаSigma AldrichZ549460
Роботизированный распылитель HTX M5 TMМикроскоп с
покрытием из оксида индия и олова (ITO) DeltaTechnologiesCG-81IN-S115
Встроенный фильтр HEPA к вакуумному насосуLABCONCO7386500
Метанол, ВЭЖХ классаFisher Chemical  67-56-1
MTP адаптер слайда IIBruker Daltonics235380
Оптимальная температура резания (ОКТ) компаундFischer Scientific23-730-571
Peridox RTU Спорицид, дезинфицирующее и чистящее средствоCONTECCR85335 
ПТФЭ (тефлон) печатные слайды, электронная микроскопия наукиVWR100488-874
Пластинчато-роторный вакуумный насос RV8EdwardsA65401903
Tissue-Tek Accu-Edge Одноразовые высокопрофильные микротомные лезвияЭлектронная микроскопия науки63068-HP
Прозрачная вакуумная трубкаCole PalmerEW-06414-30
Ultragrade 19 Вакуумный насос маслоEdwardsH11025011
Трансформатор переменного напряженияPowerstat
Water, подходит для ВЭЖХSigma Aldrich7732-18-5
Колба Дьюара с широким горлышкомSigma AldrichZ120790
, исследовательский криомикротом Canon , шкаф для эксикатора ,

Ссылки

  1. Biteen, J. S., et al. Tools for the microbiome: nano and beyond. ACS Nano. 10 (1), 6-37 (2016).
  2. Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
  3. Watrous, J. D., Alexandrov, T., Dorrestein, P. C. The evolving field of imaging mass spectrometry and its impact on future biological research. Journal of Mass Spectrometry. 46 (2), 209-222 (2011).
  4. Gessel, M. M., Norris, J. L., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: spatial molecular analysis to enable a new age of discovery. Journal of Proteomics. 107, 71-82 (2014).
  5. Fang, J., Dorrestein, P. C. Emerging mass spectrometry techniques for the direct analysis of microbial colonies. Current Opinion in Microbiology. 19, 120-129 (2014).
  6. Wheatcraft, D. R. A., Liu, X., Hummon, A. B. Sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3D cell culture models. Journal of Visualized Experiments. (94), e52313(2014).
  7. Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing small molecule communication between tissues and cells using imaging mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (146), e59490(2019).
  8. Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
  9. Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nature Reviews Microbiology. 9 (9), 683-694 (2011).
  10. Dunham, S. J. B., Ellis, J. F., Li, B., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging of complex microbial communities. Accounts of Chemical Research. 50 (1), 96-104 (2017).
  11. Frydenlund Michelsen, C., et al. Evolution of metabolic divergence in Pseudomonas aeruginosa during long-term infection facilitates a proto-cooperative interspecies interaction. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10 (6), 1323-1336 (2016).
  12. Si, T., et al. Characterization of Bacillus subtilis colony biofilms via mass spectrometry and fluorescence imaging. Journal of Proteome Research. 15 (6), 1955-1962 (2016).
  13. Wakeman, C. A., et al. The innate immune protein calprotectin promotes Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus interaction. Nature Communications. 7, 11951(2016).
  14. Phelan, V. V., Fang, J., Dorrestein, P. C. Mass spectrometry analysis of Pseudomonas aeruginosa treated with azithromycin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 873-877 (2015).
  15. Ferreyra, J. A., et al. Gut microbiota-produced succinate promotes C. difficile infection after antibiotic treatment or motility disturbance. Cell Host & Microbe. 16 (6), 770-777 (2014).
  16. Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
  17. Schubert, A. M., et al. Microbiome data distinguish patients with Clostridium difficile infection and non-C. difficile-associated diarrhea from healthy controls. mBio. 5 (3), 01021-01014 (2014).
  18. Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), 00387(2020).
  19. Zackular, J. P., et al. Dietary zinc alters the microbiota and decreases resistance to Clostridium difficile infection. Nature Medicine. 22 (11), 1330-1334 (2016).
  20. Tomkovich, S., Stough, J. M., Bishop, L., Schloss, P. D. The initial gut microbiota and response to antibiotic perturbation influence Clostridioides difficile clearance in mice. mSphere. 5 (5), 00869(2020).
  21. Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous matrix deposition on dried agar for MALDI imaging mass spectrometry of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
  22. Yang, J. Y., et al. Primer on agar-based microbial imaging mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
  23. Prentice, B. M., et al. Dynamic range expansion by gas-phase ion fractionation and enrichment for imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (19), 13092-13100 (2020).
  24. Bemis, K. D., et al. Cardinal: an R package for statistical analysis of mass spectrometry-based imaging experiments. Bioinformatics. 31 (14), 2418-2420 (2015).
  25. Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: An open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (5), 718-721 (2013).
  26. Bokhart, M. T., Nazari, M., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. MSiReader v1.0: Evolving open-source mass spectrometry imaging software for targeted and untargeted analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (1), 8-16 (2018).
  27. Smith, A. B., et al. Enterococci enhance Clostridioides difficile Pathogenesis. Nature. , (2022).
  28. Korte, A. R., Lee, Y. J. MALDI-MS analysis and imaging of small molecule metabolites with 1,5-diaminonaphthalene (DAN). Journal of Mass Spectrometry. 49 (8), 737-741 (2014).
  29. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (9), 1646-1652 (2007).
  30. Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: Enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Analytical Chemistry. 84 (4), 2048-2054 (2012).
  31. Huizing, L. R., et al. Development and evaluation of matrix application techniques for high throughput mass spectrometry imaging of tissues in the clinic. Clinical Mass Spectrometry. 12, 7-15 (2019).
  32. Anderton, C. R., Chu, R. K., Tolić, N., Creissen, A., Paša-Tolić, L. Utilizing a robotic sprayer for high lateral and mass resolution MALDI FT-ICR MSI of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 556-559 (2016).
  33. Gilmore, M. S., Clewell, D. B., Ike, Y., Shankar, N. Enterococci: From commensals to leading causes of drug resistant infection. Massachusetts Eye and Ear Infirmary. , Boston. (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Исследование микробной кооперации с помощью визуализационного масс-спектрометрического анализа бактериальных колоний, выращенных на агаре и в тканях во время инфекции
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.