С. Элеганс Рассечение и замораживание трещины гонады для иммунофлуоресценции и окрашивания DAPI

Краткое содержание

Это широко используемый метод для рассечения гонады C. elegans с последующим замораживанием трещины, которая производит образцы зародышевой линии для иммунофлуоресценции с помощью окрашивания антителами или для простого окрашивания DAPI для визуализации ДНК. Этот протокол был успешным для студентов в исследовательской лаборатории и в исследовательском опыте бакалавриата на основе курса.

Аннотация

Зародышевая линия C. elegans является отличной моделью для изучения мейоза, отчасти из-за простоты проведения цитологических анализов на рассеченных животных. Целые маунт-препараты сохраняют структуру мейотических ядер, и, что немаловажно, каждая рука гонады содержит все стадии мейоза, организованные во временно-пространственной прогрессии, что позволяет легко идентифицировать ядра на разных стадиях. Взрослые гермафродиты имеют две ветви гонад, каждая из которых организована в виде закрытой трубки с пролиферирующими стволовыми клетками зародышевой линии на дистальном замкнутом конце и клеточными ооцитами на проксимальном открытом конце, которые соединяются в центре матки. Рассечение высвобождает одну или обе руки гонады из полости тела, позволяя визуализировать весь мейоз. Здесь представлен общий протокол иммунофлуоресценции против интересующего белка, за которым следует окрашивание DAPI для маркировки всех хромосом. Молодые люди иммобилизуются в левамизоле и быстро рассекаются с помощью двух шприцевых игл. После экструзии зародышевой линии образец фиксируется перед прохождением трещины замораживания в жидком азоте, что способствует пермеабилизации кутикулы и других тканей. Затем образец может быть обезвожен в этаноле, регидратирован и инкубирован с первичными и вторичными антителами. DAPI добавляется к образцу в монтажной среде, что позволяет надежно визуализировать ДНК и позволяет легко находить животных для изображения под флуоресцентным микроскопом. Эта техника легко принимается теми, кто знаком с обращением с C. elegans после нескольких часов, проведенных за практикой самого метода рассечения. Этот протокол был преподан старшеклассникам и студентам, работающим в исследовательской лаборатории, и включен в основанный на курсе исследовательский опыт бакалавриата в гуманитарном колледже.

Введение

Мейоз - это специализированное деление клеток, используемое для создания гамет (яйцеклеток и сперматозоидов/ пыльцы) во всех половых организмах ^1,2. Перекрестная рекомбинация — реципрокный обмен ДНК между гомологичными хромосомами; он имеет важное значение для мейоза, являясь важным источником генетического разнообразия и способствуя стабильности генома на протяжении поколений. Хромосомы, которые не образуют по крайней мере один кроссовер во время мейоза, будут разделяться случайным образом, что может привести к нерассходованию хромосом, создавая гаметы с неправильным количеством хромосом - состояние, которое обычно является фатальным для результирующего потомства³. Во время мейоза кроссоверы индуцируются запрограммированными двухцепочечными разрывами ДНК⁴. Подмножество этих разрывов будет восстановлено в виде кроссоверов, которые обеспечивают физические связи ДНК, называемые хиазматами, которые помогают ориентировать гомологичные хромосомы при подготовке к делению клеток⁵. Мейотические стадии сильно сохраняются у всех эукариот, и их хромосомная конформация позволяет легко их идентифицировать.

Как фундаментальная концепция в биологии, мейоз является темой, с которой студенты сталкиваются несколько раз на разных курсах биологии. Они часто знакомятся с механикой сегрегации мейотических хромосом в средней школе, в то время как курсы на уровне колледжа сосредоточены на клеточной биологии сегрегации и генетическом воздействии перекрестной рекомбинации. Тем не менее, мейоз является общеизвестной сложной концепцией для многих студентов¹. Неспособность понять взаимосвязь между генами, ДНК, хромосомами и мейозом может породить заблуждения студентов и пробелы в понимании, которые препятствуют полному пониманию генетического наследования ^6,7. Одним из способов улучшить понимание учащимися абстрактных тем является предоставление конкретных, практических занятий. Например, при обучении мейозу преподаватели могут выбирать из мероприятий, которые имитируют молекулярный анализ⁸, 3D-моделей, которые позволяют студентам манипулировать молекулами⁹, или ролевых игр, где студенты сами разыгрывают молекулярную хореографию¹. Включение исследований с неизвестными результатами является особенно эффективным способом улучшения понимания студентами. Эта практика известна как основанный на курсе исследовательский опыт бакалавриата (CURE) и имеет дополнительное преимущество в укреплении отношения студентов и свободы воли, особенно для тех, кто принадлежит к группам, которые остаются недостаточно представленными в STEM^10,11. Червь-нематода Caenorhabditis elegans особенно поддается классным исследованиям поведения, фертильности и генетических скрещиваний и является эффективной моделью для ознакомления студентов с биологическими исследованиями¹².

C. elegans создает мощный модельный организм для клеточной биологии, сочетая молекулярную генетику с простым цитологическим анализом. Он также особенно хорошо подходит для использования в классе биологии 13,14,15. Они просты и экономичны в обслуживании в лаборатории, производя сотни потомства каждые 3 дня, как при стандартной комнатной температуре, так и при 20 ° C, наиболее распространенной температуре инкубации. Важно отметить, что их можно заморозить как запасы глицерина и хранить в морозильной камере -80 ° C, что означает, что любые ошибки в животноводстве, допущенные начинающими исследователями, могут быть легко исправлены¹⁶. Кроме того, его хорошо аннотированный геном позволяет использовать прямые и обратные генетические методы ^17,18, что позволяет использовать C. elegans для решения биологических вопросов, начиная от молекулярных до эволюционных. Наконец, исследователи C. elegans создали поддерживающее сообщество, которое часто готово предоставить помощь и советы для начинающих ученых¹⁹. Эти преимущества привели к тому, что C. elegans были включены в ряд CURE в различных типах учреждений 12,19,20,21,22,23.

В дополнение к своим преимуществам для исследований и преподавания, C. elegans стал популярной моделью для исследований мейоза и развития зародышевой линии 24,25,26. Оптическая прозрачность этих животных упрощает цитологические подходы²⁷, а у взрослых гонады составляют почти половину животного, обеспечивая сотни мейотических клеток для изучения. В половых железах ядра мейотической зародышевой линии расположены как сборочная линия (рисунок 1); Митотическая репликация происходит на дистальной оконечности гонады, причем ядра прогрессируют через мейотические стадии, когда они мигрируют к проксимальному концу гонады, где оплодотворенные эмбрионы появляются из вульвы. Поскольку стереотипная пространственная организация также представляет собой временную прогрессию через мейоз, различные стадии могут быть легко идентифицированы на основе их хромосомной организации и расположения в гонаде. Наконец, процессы, которые нарушают мейоз и вызывают анеуплоидию, создают фенотипы, которые легко охарактеризовать, даже для новичков: бесплодие, эмбриональная летальность или высокая заболеваемость самцов (фенотип Хима)²⁸.

Это простой протокол визуализации мейотических хромосом у C. elegans. Монтаж, рассечение, фиксация и окрашивание антител выполняются на одном и том же предметном стекле микроскопа, что упрощает протокол и позволяет почти идеально восстанавливать образец. Этот метод работает для простого окрашивания DAPI для визуализации хромосом и может быть использован для иммунофлуоресценции для визуализации локализации белков в гонаде. Студенты препарируют гонады с помощью базовых рассекающих микроскопов, генерируют цельные препараты для визуализации ДНК или иммунофлуоресценции и визуализируют их на составном флуоресцентном микроскопе. Этот протокол преподавался старшеклассникам и магистрантам, работающим в исследовательской лаборатории C. elegans, и включен в CURE в гуманитарном колледже¹². Хотя CURE имел относительно небольшой размер класса, этот протокол поддавался бы классам в ряде учреждений из-за относительно низкой стоимости штаммов червей и реагентов. Инструкторы будут ограничены только количеством рассекающих микроскопов, доступных для использования. Предыдущая реализация заставляла студентов работать в группах по три человека, чтобы совместно использовать один микроскоп, и состоялась в течение трех 90-минутных сессий: первая для практики рассечения, вторая для реализации рассечения и окрашивания DAPI, а третья для изображения слайдов на широкоугольном флуоресцентном микроскопе. Участие в исследованиях бакалавриата дает много преимуществ для студентов^11,29, как академических, так и личных. Внедрение исследований в курсы через CURE позволяет студентам участвовать в исследованиях в течение обычного времени^{занятий} 11,30,31, что делает воздействие этих преимуществ более доступным и справедливым.

Протокол

1. К. Элеганс

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более подробной информации см. протокол¹⁶ технического обслуживания C. elegans и Elgin et al.32. Штаммы C. elegans могут быть легко приобретены в Центре генетики Caenorhabditis (https://cgc.umn.edu) и отправляются обычной почтой в любое место в США. Каждый штамм стоит 10 долларов, и каждая лаборатория / пользователь платит ежегодную плату в размере 30 долларов.

1. Используя стерильную технику, приготовьте 6 см нематодные средние агаровые пластины (NGM agar plates).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Налитые пластины можно хранить вверх ногами в оригинальных пластиковых рукавах или герметичных контейнерах при 4 °C в течение нескольких месяцев.
   1. Чтобы сделать агаровые пластины NGM, добавьте 3 г NaCl, 2,5 г пептона Bacto, 20 г агара NGM и ddH₂O до 1 л (~ 975 мл). Автоклав среды с помощью жидкого цикла, который держится при 121 °C в течение 20 мин. Дайте остыть до 55 °C и, используя стерильную технику, добавьте 1 мл холестерина, 0,5 мл 1 M CaCl₂, 1 мл 1 M MgSO₄ и 25 мл 1 М буфера фосфата калия (рН 6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить 1 M буфера фосфата калия, смешайте 108,3 г KH₂PO₄ (моноосновной) и 35,6 г K₂HPO₄ (двухосновный); при необходимости отрегулируйте pH до 6 с помощью KOH. Добавляют ddH_2Oдо 1 л (обычно ~900 мл) и автоклав в течение 40 мин при 121 °C. 1 л NGM составляет около 100 пластин, содержащих по 10 мл каждая.
2. Используя серологический или трансферный пипет, обнаружите пластины тремя каплями бактериальных культур E.coli OP50 (~ 150 мкл). Старайтесь делать пятна в центре пластины и избегать размещения пятен слишком близко к краям пластины; это будет препятствовать животным ползать по бокам плит и высыхать.
3. Как только бактериальный газон высохнет, храните пятнистые пластины вверх ногами при комнатной температуре (RT) в течение 2 недель. Пятнистые пластины по крайней мере за 1-2 дня до использования позволят бактериальным газонам расти толще и поддерживать более высокую плотность животных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления бактериальных культур OP50 можно заказать OP50 в Центре генетики Caenorhabditis . Бактерии OP50 переносятся из глицеринового запаса на пластину LB для обеспечения одиночных колоний и сохраняют при 4 ° C в течение 4-6 недель. Бактериальные культуры OP50 выращиваются в LB в течение ночи при 37 ° C из одной колонии - встряхивание не требуется. Для приготовления среды LB добавляют 10 г триптона, 10 г NaCl, 5 г дрожжевого экстракта, 950 мл ddH₂O, регулируют рН до 7 с 10 N NaOH и регулируют конечный объем до 1 л с ddH₂O. Аликвот в 100 мл количеств и автоклав в течение 20 мин при 121 °C.
4. Чтобы создать рабочий запас для каждого штамма, выберите три гермафродита L4-стадии на пятнистой пластине NGM. Хранить пластины при температуре 15-25 °C. Стандартное условие культивирования составляет 20 °C. Если доступ к инкубаторам с контролируемой температурой недоступен, держите культуры на скамейке в RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: L4-стадийные гермафродиты могут быть легко поставлены как по размеру (меньше, чем взрослые), так и по наличию отчетливого полукруга на полпути через их тела (развивающаяся вульва). При 20 °C животные достигнут стадии L4 через 34-46 ч после вылупления (что составляет около 40-52 ч после закладки эмбрионов). См. Corsi et ^al.14 для получения более подробной информации о сроках стадий развития.
   1. Переведите культуры на различные температуры, чтобы контролировать скорость развития. Животные будут расти быстрее при более высоких температурах и медленнее при более низких температурах. Они начнут становиться стерильными при температуре выше 25 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые мутантные генотипы чувствительны к температуре и будут отображать различные фенотипы в зависимости от температуры культивирования.
5. Поддерживайте рабочие запасы, выбирая три гермафродита L4-стадии на новую пятнистую пластину NGM каждые 4 дня. Это обеспечит постоянное, сытое население с широким спектром стадий развития.

2. Рассечение гонады

1. Сбор взрослых особей, соответствующих возрасту: за 12-24 часа до рассечения выберите гермафродиты L4-стадии в новую пятнистую пластину NGM - они вырастают в молодых людей на следующий день, что идеально подходит для рассечения. Количество L4-стадийных гермафродитов будет зависеть от выполняемого цитологического анализа; Обычно на слайд рассекается 10-20 гермафродитов, при этом по одному условию генерируется от двух до четырех слайдов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гонады наиболее эффективно экструдируются у сытых животных. Обязательно выбирайте гермафродиты L4 из рабочих фондов, которые не голодают (т. Е. Все еще имеют видимый бактериальный газон, присутствующий на тарелке). Голодные животные, как правило, подвергаются неполной экструзии гонад, что затрудняет их визуализацию.
   1. При оценке более поздних стадий мейоза, таких как диакинез, рассекция пожилых людей (48 ч после L4), потому что они накапливают больше ядер стадии диакинеза, упрощая анализ. Тем не менее, исследователи должны отметить возможность того, что некоторые эффекты могут быть вызваны пожилым возрастом матери.
2. Подготовьтесь к рассечению.
   1. Приготовить M9: Добавить 3 г KH₂PO₄ (моноосновный), 6 г Na₂HPO₄ (двухосновный), 5 г NaCl и добавить ddH₂O до 100 мл. Автоклавируйте раствор в течение 20 мин при 121 °C, дайте ему остыть, а затем добавьте 1 мл 1 M MgSO₄ с использованием стерильной техники.
   2. Подготовьте рассекающий буфер: смешайте 1 мкл 10% Tween 20, 12 мкл 100 мМ левамизола, 10 мкл 10x M9 и 77 мкл ddH_2O.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анимация 20 включена в рассекающий буфер для снижения поверхностного натяжения и дальнейшего пронизывания тканевых мембран.
   3. Приготовить фиксированный раствор (2% PFA [100 мкл]): Смешать 12,5 мкл 16% параформальдегида (PFA), 10 мкл 10x M9 и 77,5 мкл ddH_2O; обязательно используйте свежую ампулу ПФА (открытую не дольше 2 недель).
      ВНИМАНИЕ: ПФА является опасным химическим веществом, и раствор для фиксации должен быть приготовлен в вытяжном шкафу.
   4. Настроить метод замораживания – жидким азотом легче управлять, но при необходимости алюминиевый блок можно использовать поверх сухого льда.
      1. Метод жидкого азота: Установите пластиковый стакан или пластиковую банку Coplin в полистирольную коробку. Наполните стакан жидким азотом (переполнение полистирольного контейнера нормальное). Установите пинцет рядом. В идеале стакан должен быть достаточно узким, чтобы предотвратить полное падение слайдов микроскопа на горизонтально-горизонтальные предметные стекла должны лежать под наклоном и легко захватываться пинцетом.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать пластиковые контейнеры при работе с жидким азотом, а не со стеклом, чтобы избежать разрушения из-за быстрого охлаждения.
      2. Метод сухого льда:
         1. Поместите плоский алюминиевый блок на сухой лед в контейнер из полистирола или прямоугольное ведро для льда. Легче заморозить слайды, если верхняя часть блока находится над верхней частью контейнера.
         2. Надев перчатки, осторожно надавите на алюминиевый блок, чтобы обеспечить хороший контакт с сухим льдом и ускорить процесс охлаждения (он может выпустить визг, когда металл быстро охлаждается). Установите лезвие бритвы рядом.
         3. Оставьте алюминиевый блок на сухом льду не менее чем на 30 минут до остановки замерзания-растрескивания, чтобы обеспечить полное охлаждение, которое необходимо для быстрой заморозки.
            ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале следует использовать твердые глыбы сухого льда, которые помогают поверхности оставаться ровной. При необходимости алюминиевый блок можно поместить на гранулы сухого льда, но следует позаботиться о том, чтобы поверхность оставалась ровной.
         4. Поверхность алюминиевого блока будет собирать инеи, которые могут предотвратить тесный контакт между горками и блоком. Используйте лезвие бритвы, чтобы соскоблить иней с поверхности, расчищая область для каждого слайда. Покрытие полистирольной емкости крышкой поможет предотвратить чрезмерное накопление мороза.
   5. Наполните банку Coplin ~40 мл 95% этанола.
   6. Наполните три банки Coplin ~40 мл PBS-T.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить PBS-T, смешайте 100 мл 10x PBS, 5 мл Triton X-100 и 2 мл 0,5 M EDTA (pH 8). Добавить 873 мл ddH2O. Энергично встряхните, чтобы растворить Triton X-100. Чтобы получить 10x PBS, смешайте 25,6 г Na₂HPO₄·7H₂O, 80 г NaCl, 2 г KCl и 2 г KH₂PO₄. Добавьте ddH_2O, чтобы довести объем до 1 л. Автоклав в течение 40 мин при 121°C. Моющее средство Triton X-100 входит в состав промывочного буфера PBS-T для снижения поверхностного натяжения и улучшения удержания целых животных на слайде.
3. Рассекайте животных на стеклянном чехле размером 18 мм x 18 мм. Этот шаг чувствителен ко времени из-за испарения рассекающего буфера. Для завершения вскрытия должно пройти менее 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Левамизол используется для обездвиживания животных, чтобы облегчить их рассечение, но оставление их в левамизоле слишком долго приведет к плохой экструзии гонад. Проще всего уменьшить количество животных, рассеченных на слайде, чтобы уложиться в 5-минутный промежуток времени.
   1. Поместите удерживающий слайд на ступень рассекающего микроскопа - удерживающий слайд используется для более легкого перемещения покровного листа и может быть повторно использован на неопределенный срок (рисунок 2A, левое фото).
   2. Поместите крышку поверх удерживающего слайда и пипетируйте 4 мкл рассекающего раствора в центр крышки. Переместите удерживающий слайд в одну сторону рабочей области, чтобы освободить представление.
   3. Подберите 10-20 гермафродитов в каплю рассекающего раствора. Выберите достаточное количество животных для изображения ~ 10 на слайде, но не настолько, чтобы их нельзя было препарировать в течение 5 минут.
   4. Рассекайте животных с помощью двух шприцевых игл, по одной для каждой руки (рисунок 2А).
      1. Скрестите точки игл, чтобы сделать X-образную форму, и используйте нижнюю часть X, чтобы прикрепить взрослую особь к поверхности крышки.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться практика, чтобы найти лучший способ удерживать каждую иглу с точки зрения угла и вращения. Начните с того, что держите иглы их скосами (наклонным краем) лицом вниз. См. обсуждение предложений по первому обучению препарированию в большем объеме (рисунок 2D).
      2. Расположите Х-образную форму непосредственно за глоткой, примерно на 1/5 длины тела молодого взрослого человека, или чуть ниже прозрачной части головы (рисунок 2А, правая диаграмма).
      3. Обезглавить животное одним ножничным движением (например, нарезать пищу ножом и вилкой). Хорошая экструзия приведет к тому, что одна рука гонады (а иногда и обе руки) полностью выйдет из полости тела вместе с одной или обеими половинами кишечника (рисунок 2B, левое изображение). Кишечник будет казаться темнее и равномерной ширины, в то время как гонада будет казаться прозрачной с дистальным коническим кончиком.
         1. Каждое животное должно быть разрезано только один раз; если гонада не выдавливается после внесения разреза, просто перейдите к следующему животному. Первый разрез значительно снижает гидростатическое давление в корпусе, что делает любые дальнейшие сокращения маловероятными для лучшей экструзии. Неполные или плохие экструзии легко видны во время визуализации и могут быть проигнорированы (рисунок 2B, правое изображение).
            ПРИМЕЧАНИЕ: Не пытайтесь отделить гонаду от туши - это обычно разрывает ткань и ограничивает количество мейотических стадий, которые могут быть проанализированы.
      4. Повторите рассечение для оставшихся животных на крышке.
4. Зафиксируйте образец формальдегидом.
   1. Работая аккуратно, пипетируйте 4 мкл фиксированного раствора на крышке очень близко к капле с животными. В идеале капли находятся достаточно близко, чтобы слиться; избегайте пипетки непосредственно в каплю рассечения и смещения рассеченных туш.
   2. Одним пальцем прикрепите крышку к удерживающему слайду. Другой рукой осторожно проведите крышкой несколько раз, чтобы перемешать капли. Конечная концентрация фиксации составляет 0,8% PFA.
   3. Удерживая положительно заряженный слайд лицевой стороной вниз, используйте его, чтобы поднять крышку в центре слайда. Осторожно прикоснитесь к капле образца, и поверхностное натяжение капли поднимет крышку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Положительно заряженные слайды имеют электростатическое покрытие, которое помогает тканям прилипать к поверхности, предотвращая потерю образца.
      1. При желании расположите крышку по диагонали, чтобы один угол свисал с верхнего или нижнего края горки на 1 мм. Оставление свеса облегчит снятие крышки после замерзания (рисунок 2C).
   4. Установите горку на скамейку и зафиксируйте ровно на 5 минут на RT. В течение этого времени пометьте слайд карандашом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно чрезмерно фиксируют образцы, которые могут быть обнаружены путем исключения антител из ядер или даже всех тканей. Кроме того, некоторые антитела особенно чувствительны к формальдегиду. В этих случаях уменьшают время фиксации или уменьшают конечную концентрацию используемого формальдегида.
5. Замораживание-трещина
   1. Сразу после исправления заморозьте слайды.
      1. При использовании жидкого азота: удерживайте меченый край слайда пинцетом и осторожно опустите его в жидкий азот. Отпустите слайд так, чтобы он опирался на сторону стакана, закрывая стороной вверх. Горки замораживаются в течение 10 с (как только жидкость перестает кипеть).
      2. При использовании сухого льда: соскоблите инеем с поверхности алюминиевого блока бритвой. Крепко удерживайте маркированный край затвора и установите его на очищенную поверхность, применяя некоторое давление вниз, чтобы обеспечить полный контакт с блоком. Крышка должна быть полностью на поверхности блока. Замораживание происходит в течение 10 с и может быть визуально подтверждено, когда образец под крышкой превращается в лед.
      3. Для обоих методов оставьте слайды не менее чем на 5 минут, чтобы полностью замерзнуть.
         ПРИМЕЧАНИЕ: После замораживания слайды можно оставить в жидком азоте или на блоке на 15-20 минут, пока они остаются замороженными. Это позволяет собрать несколько слайдов на этом этапе, прежде чем перейти к этапу растрескивания.
   2. Работая быстро, отламывайте крышку от образца. Этот шаг зависит от времени. Снимите крышку и погрузите слайд в этанол до того, как образец начнет оттаивать.
      1. Удалите замороженный слайд (используя пинцет для жидкого азота).
      2. Крепко схватитесь за короткий край горки и прикрепите один длинный край к скамье.
      3. Другой рукой крепко возьмите бритву и сдвиньте лезвие бритвы вниз по слайду, чтобы оттолкнуть крышку от образца. Этот шаг немного проще, если крышка расположена с угловым свесом (рисунок 2C).
6. Немедленно поместите слайд в банку Coplin, содержащую 95% этанола в RT. Оставьте слайды в этаноле не менее чем на 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды можно оставить в этаноле на некоторое время - это позволяет собирать несколько слайдов на этом этапе, прежде чем приступать к промывке. Слайды также могут храниться на этом этапе в течение нескольких дней. При хранении переместите банку Коплина с слайдами в этаноле до -20 °C.
7. Мойте слайды в PBS-T три раза по 5 минут каждый на RT. Используйте свежий PBS-T для каждой стирки.
8. При окрашивании антителами переходите к этапу 3 (окрашивание антителами). Если окрашивание только DAPI для визуализации хромосом, перейдите к шагу 4 (монтаж и визуализация).

3. Окрашивание антителами

1. Первичная инкубация антител
   ПРИМЕЧАНИЕ: При разработке соответствующих условий для новых антител важно включить следующие отрицательные контрольные элементы для проверки специфичности флуоресцентного сигнала: 1) Слайд, который не имеет первичного антитела и имеет только вторичное антитело; 2) слайд только с первичным антителом, в котором отсутствует вторичное антитело. Каждый из этих отрицательных элементов управления должен привести к полному отсутствию сигнала. Если флуоресценция выявлена на слайде, предназначенном только для вторичных антител, следует увеличить разведение вторичных антител или использовать другое вторичное. Если флуоресценция идентифицирована на первичном слайде, предназначенном только для антител, это, вероятно, связано с автофлуоресценцией или другими потенциальными загрязнителями.
   1. Развести первичное антитело в буфере разбавления антител (50 мг BSA + 50 мкл 10% азида натрия + 10 мл PBS-T) - приготовить достаточное разведение антител для использования 20-30 мкл на слайд.
   2. Подготовьте влажную камеру: выровняйте дно пластикового контейнера с герметичной крышкой влажными бумажными полотенцами. Положите один слой стеклянных пипеток Пастера поверх бумажных полотенец. Эти пипетки создают поверхность, которая позволяет слайдам оставаться на одном уровне и удерживает их приподнятыми над бумажными полотенцами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для влажных камер лучше всего использовать пластиковые контейнеры для хранения пищевых продуктов с защелкивающимися крышками, что облегчает открытие и закрытие контейнера, не нарушая горки внутри. Ищите тот, который достаточно длинный для пипеток Пастера, но также имеет относительно плоское дно без углублений, чтобы позволить слайдам полностью располагаться горизонтально.
   3. Извлеките слайд из окончательной промывки PBS-T. Работайте быстро с этого шага вперед, чтобы держать образец влажным в любое время и избегать испарения. Если образец высохнет, окрашивание антителом будет отрицательно затронуто.
   4. Высушите всю поверхность горки с помощью протирающей ткани, сложенной в компактный прямоугольник. Протрите переднюю и заднюю части слайда, но оставьте достаточно места вокруг образца. Соблюдайте особую осторожность при сушке поверхности вблизи образца - избегайте слишком близкого подхода к образцу, который оставляет область размером с крышку необработанной. Однако убедитесь, что периметр образца сухой для следующего шага.
   5. Нарисуйте круг вокруг образца с помощью гидрофобной пап-ручки. Используйте осторожность, чтобы закрыть всю область образца, но избегайте разрушения туш животных, видимых на поверхности слайда. Подождите ~ 5 с, чтобы дать барьеру полностью высохнуть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрофобный барьер необходим для содержания первичного раствора антител, поскольку поверхность слайда покрыта PBS-T, который содержит моющее средство. Ручка PAP лучше всего работает на сухой поверхности слайда, поэтому важно создать сухой периметр вокруг образца. Оставление области, ближайшей к образцу, незасушенной защищает образец на этом этапе
   6. Работая быстро, используйте угол или край сложенной протирающей ткани, чтобы отвести жидкость от образца в пределах гидрофобного барьера. Позаботьтесь о том, чтобы не разрушить туши животных.
   7. Немедленно пипетировать 20 мкл раствора первичного антитела в кольцо, создаваемое гидрофобным барьером. Позаботьтесь о том, чтобы пипетировать аккуратно и под углом, чтобы предотвратить разрушение туш. Избегайте пипетки непосредственно на любой туше.
   8. Осторожно наклоните затвор, чтобы убедиться, что вся поверхность в пределах гидрофобного барьера покрыта раствором.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего, если гидрофобные барьеры имеют внутреннюю окружность 1-1,5 см, которая полностью покрыта 20 мкл раствора антител. Ширина окружности будет зависеть от того, как туши распределяются во время стадии замерзания-растрескивания. Более широкие барьеры могут потребовать большего объема раствора антител. При желании небольшие квадраты парапленки (вырезанные до размера крышки 18 мм х 18 мм) могут быть аккуратно помещены поверх образца. Квадраты парапленки гарантируют, что раствор антител покрывает весь образец, а также поможет предотвратить испарение.
   9. Повторите шаги 3.1.3-3.1.8 для остальных слайдов.
   10. Осторожно перенесите слайды во влажную камеру, следя за тем, чтобы раствор оставался внутри гидрофобного барьера и чтобы горки лежали полностью ровно.
   11. Инкубируйте слайды в течение ночи в RT. В зависимости от антитела, этот этап может быть сокращен до 6 ч или выполнен на ночь при 4 °C, сохраняя влажную камеру в холодной камере или холодильнике.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Использование влажной камеры и гидрофобных барьеров обычно достаточно для предотвращения испарения раствора антител даже при длительных ночных инкубациях. Однако, если испарение окажется проблемой, небольшие квадраты парапленки могут быть аккуратно помещены на каждый образец, что поможет предотвратить испарение. Их можно удалить на первом этапе промывки: погрузить каждый слайд в банку Coplin, наполненную PBS-T (не содержащую других слайдов), и позволить парапленке уплыть от образца. Извлеките парапленку из банки Coplin, прежде чем использовать ту же банку, чтобы удалить парапленку со следующего слайда.
2. Мойте слайды в банках Coplin, содержащих ~ 40 мл PBS-T три раза в течение 5 минут каждый на RT. Используйте свежий PBS-T для каждой стирки.
   1. Во время этих промывок разбавляют вторичное антитело в буфере разбавления антител. Приготовьте достаточное количество разведения антител для использования 20-30 мкл на слайд. Обычно используются конъюгированные вторичные антитела Alexa Fluor, разбавленные при 1:200.
3. Инкубация вторичных антител
   1. Извлеките слайд из окончательной промывки PBS-T. Работайте быстро с этого шага вперед, чтобы держать образец влажным в любое время и избегать испарения.
   2. Высушите горку с помощью сложенной протирающей салфетки. Избегайте высыхания области, содержащейся в гидрофобном барьере.
   3. Работая быстро, используйте угол или край сложенной протирающей ткани, чтобы отвести жидкость от образца в пределах гидрофобного барьера. Позаботьтесь о том, чтобы не разрушить туши животных.
   4. Немедленно пипетировать 20 мкл раствора вторичного антитела в кольцо, создаваемое гидрофобным барьером. Позаботьтесь о том, чтобы пипетировать аккуратно и под углом, чтобы предотвратить разрушение туш.
   5. Избегайте пипетки непосредственно на любой туше. Убедитесь, что вся поверхность в пределах гидрофобного барьера покрыта раствором. Более широкие окружности барьера могут потребовать большего объема раствора антител. При желании накройте образец небольшим квадратом парапленки (см. примечание ниже на этапе 3.1.8).
   6. Осторожно перенесите затвор во влажную камеру, следя за тем, чтобы раствор оставался внутри гидрофобного барьера и чтобы горка лежала полностью ровно. Замените крышку во влажной камере, чтобы слайд оставался в темноте.
   7. Повторите шаги 3.3.1-3.3.6 для остальных слайдов.
   8. Насиживать в темноте в течение 4 ч при РТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от антитела, этот шаг может быть сокращен до 2 ч или продлен до 6 ч. Если влажная камера не темная, поместите ее в ящик или накройте картонной коробкой. В качестве альтернативы, влажная камера может быть обернута алюминиевой фольгой, чтобы держать слайды в темноте.
4. Мойте слайды в банках Coplin, содержащих ~ 40 мл PBS-T три раза в течение 5 минут каждый на RT. Используйте свежий PBS-T для каждой стирки.

4. Монтаж и визуализация

1. Подготовьтесь к монтажу образца, имея монтажную среду + DAPI (2 мкг/мл), стеклянные крышки 18 мм x 18 мм и лак для ногтей в пределах досягаемости.
2. Снимите слайд с окончательной стирки и высушите с помощью сложенной протирающей салфетки. Избегайте высыхания области, содержащейся в гидрофобном барьере.
3. Используя угол сложенной протирающей ткани, осторожно отведите жидкость от образца внутрь барьера. Удалите большую часть жидкости на этом этапе, но не давая тушам полностью высохнуть.
4. Работая быстро, добавьте к образцу 8 мкл монтажной среды. Пипетку аккуратно и под углом, чтобы предотвратить разрушение туш. Избегайте пипетки непосредственно на туши.
5. Продолжая работать быстро, осторожно опустите стеклянную крышку на образец.
   1. Пузырьки воздуха могут нарушить визуализацию и привести к деградации образца. Чтобы свести к минимуму пузырьки воздуха, положите один край крышки на слайд рядом с образцом, чтобы он держался по диагонали над образцом. Это может помочь положить верхний край чехла на карандаш или пинцет. Затем медленно опустите верхний край крышки вниз - это движение позволяет монтажной среде создать жидкое уплотнение, прогрессирующее от одного края к противоположному краю.
6. Повторите шаги 4.2–4.5 для остальных слайдов.
7. Запечатайте обшивку лаком для ногтей. Позаботьтесь о том, чтобы избежать нажатия на крышку (которая раздавит образец) или смещения крышки горизонтально (что будет размазывать образец).
   1. Добавьте маленькую точку лака для ногтей в каждый угол крышки (~ 1 мм шириной). Это поможет удерживать крышку на месте. Дайте точкам полностью высохнуть.
   2. Когда углы полностью высохнут, запечатайте края лаком для ногтей. Убедитесь, что лак полностью заполняет зазор между крышкой и слайдом, но избегайте слишком большого покрытия обложек образцом. Лучше всего поддерживать перекрытие 1 мм на крышке. Используйте только столько лака для ногтей, сколько необходимо. Избегайте использования слишком большого количества или избыточной полировки, которая может занять много времени для высыхания и рискует повредить цель микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно использовать цветной лак для ногтей вместо прозрачного, что облегчает просмотр границы уплотнения и помогает предотвратить визуализацию животных, которые лежат под границей лака для ногтей.
   3. Дайте лаку для ногтей полностью высохнуть перед визуализацией. Этот шаг важен, так как влажный лак для ногтей может серьезно повредить цели микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды следует держать в темноте как можно больше с этого момента. Используйте плоскую картонную коробку, чтобы покрыть их, когда они высыхают на скамейке.
8. Храните слайды в темноте при температуре 4 °C в течение 1-2 недель перед визуализацией. При необходимости храните слайды при температуре -20 °C в течение более длительного времени.
9. Изображение с использованием стандартной флуоресцентной составной световой микроскопии.
   1. Для каждого слайда, во-первых, изучите весь образец в 10 раз в канале DAPI, чтобы определить хорошо экструдированные гонады и отметить их размещение. Для большинства применений избегайте визуализации любых половых желез, которые отрезаны, неполны или частично покрыты другой частью животного. Для большинства животных только одна рука гонады будет полностью экструдирована и видна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть полезно сделать изображение с меньшим увеличением в 10 раз больше всей гонады в канале DAPI, чтобы использовать его для последующей ориентации или определения местоположения конкретных ядер.
   2. В зависимости от приложения, изображения могут быть сделаны в 40x, 63x или 100x. Если необходимо захватить всю гонаду, создайте монтаж с перекрывающимися границами. Во время визуализации помните, что гонада представляет собой полую трубку, с ядрами, наиболее плотными сверху и снизу.

Результаты

DAPI прочно связывается с ДНК, и его окрашивание является устойчивым даже в самых разных условиях (рисунок 3A, B). Он должен присутствовать во всех ядрах и поэтому обеспечивает эффективный положительный контроль за наличием любой ткани червя на слайде и способностью обнаруживать флуоресценцию на микроскопе. Окрашивание эффективно, когда антитело присутствует в мейотических ядрах (рисунок 3A,B). Например, на рисунке 3A,B показаны ядра среднего пахитена, окрашенные DAPI, и антитело, нацеленное на RAD-51, маркер двухцепочечных разрывов. KLE-2 является компонентом конденсина, высококонсервативного белкового комплекса, который структурирует хромосомы при подготовке к митозу и мейозу. мутанты kle-2/+ имеют незначительные дефекты в структуре хромосом, о чем свидетельствует слегка неупорядоченное окрашивание DAPI и увеличение числа двухцепочечных разрывов, отраженное в большем количестве очагов RAD-51 (рисунок 3B). Распространенной ошибкой для иммунофлуоресценции является слишком долгое оставление образца в фиксированном растворе. Чрезмерная фиксация может привести к неудачному окрашиванию, потому что она обычно предотвращает диффузию антител в ядра. Эта ошибка может быть выявлена, когда антитело диффундирует в цитоплазматических областях гонады, но, по-видимому, исключается из ядер.

В зародышевой линии (рисунок 1) ядра митотически размножаются на дистальной оконечности, входят в мейоз во время переходной зоны и прогрессируют через пахитен (который часто делится на три равные стадии несколькими рядами ядер), прежде чем войти в диплотен и, наконец, диакинез. Ооциты в диакинезе нумеруются на основе их близости к сперматеке, причем -1 ооцит является наиболее близким к сперматеке, -2 ооцит является следующим дистальным и так далее. C. elegans имеет шесть хромосом, которые проявляются в виде компактных овалов в ядрах диакинеза. Каждый из них представляет собой гомологичную пару двух сестринских хроматид, удерживаемых вместе хиазмой, также называемой двухвалентной (рисунок 3C). Мутанты, такие как SPO-11, которые нарушают формирование кроссовера, не смогут сформировать хиазматы; таким образом, ядра диакинеза будут иметь 12 отдельных тел DAPI (также называемых одновалентными), по одному для каждой сестринской хроматиды (рисунок 3D).

Рисунок 1: Ядра зародышевой линии расположены пространственно-временно, что представляет их прогрессирование через мейоз. (A) Цельный гермафродит молодых взрослых, окрашенный DAPI. Очерчены гонадная и мейотическая стадии, от дистального кончика (звездочки) до проксимальной области (-1 ооцит, обозначенный стрелкой), которая содержит сперматеку (треугольник). Шкала представляет собой 100 мкм. (B) Проецируемое флуоресцентное изображение рассеченной гермафродитовой гонады, окрашенной DAPI. Обозначены мейотические стадии, причем репрезентативные ядра показаны во вставках (все вставки показаны в масштабе друг с другом). Ядра могут быть легко поставлены на основе их расположения в зародышевой линии и характерной морфологии хромосом, прогрессируя из митотической зоны на дистальном кончике (звездочка) в переходную зону через пахитен, диплотен и диакинез. Сперматека отмечена треугольником. Эта цифра была адаптирована из Hillers et al. по лицензии CC BY 3.0²⁸. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Демонстрация установки рассечения. (А) Стадия микроскопа во время рассечения. Животных рассекают в 4 мкл рассеченного раствора на крышке, размещенной на удерживающей горке, которая используется для перемещения покровного листа в поле зрения. На схеме показано идеальное размещение иглы. Хвоя проводится скошенным краем, обращенным вниз, скрещенным над глоточной областью. Розовые стрелки демонстрируют ножничное движение для игл. Розовая пунктирная линия показывает идеальное место среза. (B) Изображения расчлененных животных с примером полной экструзии и неполной экструзии. Участки экструдированных половых желез и кишок маркируются. С) Изображение, демонстрирующее стадию замораживания-растрескивания. Скольжение следует крепко держать в одной руке, при этом сторона крышки должна быть обращена в сторону от тела. Противоположный край пристегнут к скамейке. Бритву следует держать в другой руке. Розовая стрелка указывает направление движения бритвы, чтобы смахнуть крышку с слайда, с небольшим поворотом, таким образом, что крышка отклоняется от тела. Обратите внимание, что крышка была размещена таким образом, что один угол нависает над длинным краем слайда. (D) Изображение установки для практики вскрытия в стеклянном витраже эмбриона. Животных помещают в 50-200 мкл рассеченного раствора, что сводит на нет проблему испарения и продлевает время рассечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Репрезентативные результаты флуоресценции ядер зародышевой линии. (A,B) Z-стековые проекции поздних пахитеновых ядер, окрашенных антителами RAD-51 (зеленый) и DAPI (красный) в (A) дикого типа и (B) kle-2/+ гетерозигот. (С,Г) Z-стековые проекции одного ядра диакинеза, окрашенного DAPI в (C) дикого типа (с шестью окрашивающими телами DAPI) и (D) spo-11 мутантами (с 12 окрашивающими телами DAPI). Шкалы представляют 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Половое размножение требует создания гаплоидных гамет, которые образуются посредством специализированного клеточного деления мейоза. C. elegans стал популярной моделью для цитологического изучения мейоза благодаря своей оптической прозрачности, удобной анатомии зародышевой линии и мощной генетике²⁸. Простые эксперименты с организмами, оценивающие фертильность и эмбриональную летальность, могут быть объединены с молекулярной генетикой для решения многих вопросов в лаборатории или классе. Например, поскольку кроссоверы необходимы для правильной сегрегации хромосом, процессы, которые нарушают их формирование или разрешение, будут генерировать анеуплоидные гаметы. В свою очередь, анеуплоидия приводит к нежизнеспособному потомству, которое можно легко оценить, подсчитав потомство, или с помощью несколько более сложного метода определения эмбриональной летальности. Цитологически отсутствие кроссоверов повлияет на количество DAPI-окрашивающих тел, наблюдаемых во время диакинеза. Надежность окрашивания DAPI и простота оценки делают этот эксперимент идеальным для обучения цитологическим методам. Временно-пространственное расположение ядер в зародышевой линии гермафродита обеспечивает снимок каждой стадии мейоза в один момент времени. Ядрам требуется около 54 часов, чтобы перейти от дистального митотического конца зародышевой линии к проксимальному концу (например, см. Jaramillo-Lambert et ^al.33, Stamper et ^al.34 и Libuda et ^al.35). Это хорошо установленное время мейотического прогресса позволяет проводить эксперименты по маркировке пульса или повреждению ДНК.

Поскольку окрашивание DAPI почти всегда работает, оно служит полезным техническим контролем для флуоресцентной микроскопии (и может обеспечить удовлетворение для микроскопистов в обучении). Окрашивание антител может быть более изменчивым и является хорошей мерой воспроизводимости между репликациями. Гонады C.elegans может быть трудно исправить последовательно, так как этот этап требует баланса между сохранением хромосомной структуры, а также обеспечением достаточной диффузии антител. Фиксация формальдегидом наилучшим образом сохраняет хромосомную морфологию, а приготовление формальдегида в свежем виде из ампул параформальдегида дало наиболее воспроизводимые результаты. Также возможно применение формальдегида, приготовленного из формалина (37% водного формальдегида и метанола). Сила фиксации и время, возможно, должны быть эмпирически определены для каждого антитела. Альтернативные методы включают пропуск фиксации формальдегида на стадии 2.4 и, после замораживания трещины, погружение в 100% этанол при -20 °C или погружение в 100% метанол в течение 10 мин с последующим погружением в 100% ацетон в течение 10 мин при -20 °C. Эти фиксированные условия обеспечивают лучшее проникновение антител, но негативно влияют на морфологию тканей (хромосомы будут выглядеть раздутыми и пухлыми).

Время очень важно для шагов рассечения и исправления, описанных в шаге 2. Поскольку объем раствора для рассечения настолько мал, испарение может повлиять на конечную концентрацию фиксации, что вызовет переменное окрашивание антител. Опытный обработчик C. elegans может подготовить слайд менее чем за 2 минуты с самого начала (шаг 2.3) для исправления (шаг 2.4). Основным техническим препятствием является способность подбирать животных в каплю рассеченного раствора и быстро рассекать их. Может быть легче научиться препарировать в больших объемах. Новые ученики сначала начинают с сбора животных в 50-200 мкл раствора для рассечения в стеклянном окрашивании эмбрионов (рисунок 2D); более широкая поверхность обеспечивает больше пространства для маневра при определении идеального положения иглы для хорошей экструзии гонад, в то время как больший объем жидкости делает испарение менее проблематичным. После того, как они освоятся с движениями рассечения, обучаемые начинают рассекать, используя только 50 мкл в чашке, а затем переключаются на рассечение в 20 мкл на слайде. После рассечения на слайдах обучаемые могут быстро начать уменьшать количество раствора до тех пор, пока они не будут достаточно быстро работать в 4 мкл, чтобы сделать испарение незначительным.

Если время рассечения остается проблемой, обучаемые могут рассечь 8 мкл раствора для рассечения на этапе 2.3. Затем, во время стадии 2.4, они могут добавить 8 мкл фиксированного раствора, осторожно пипетируя для тщательного перемешивания (внимательно следя за тем, чтобы туши не были разрушены или не пипетированы), и удалив 8 мкл из смешанного раствора. Этот альтернативный подход приведет к тому же конечному объему в 8 мкл и той же конечной фиксированной концентрации; этот объем важен для обеспечения того, чтобы туши контактировали как с крышкой, так и с поверхностью слайда во время замерзания-трещины на этапе 2.5. Если сроки подготовки каждого слайда остаются проблемой даже в больших объемах рассечения, метод суспензии для протокола иммунофлуоресценции зародышевой линии описан Жервезом и Аруром²⁶.

Основным ограничением использования иммунофлуоресценции для визуализации белков in situ является наличие первичных антител, нацеленных на конкретный интересующий белок. Однако, если была разработана помеченная версия белка, этот протокол может быть адаптирован для визуализации белковой метки. Антитела, нацеленные на общие теги, такие как FLAG, HA или GFP, обычно доступны. Флуоресцентные метки, такие как GFP, часто могут быть заглушены этапами фиксации, поэтому рекомендуется использовать первичное антитело, нацеленное на GFP, а не полагаться на сам нативный флуоресцентный сигнал. Другим ограничением этого протокола является то, что он захватывает зародышевую линию в течение одного периода времени (хотя все стадии оогенеза будут представлены внутри зародышевой линии). Таким образом, этот метод может пропустить динамические изменения, которые могут произойти, когда ооцит прогрессирует через оогенез. Тем не менее, сроки гаметогенеза были хорошо изучены у C. elegans; у молодого взрослого человека дикого типа ооциту требуется около 60 ч, чтобы прогрессировать от дистального кончика зародышевой линии (митотической зоны) до диакинеза³³. Таким образом, погоня за пульсом или конкретное вмешательство, такое как облучение с последующим временным курсом, позволит наблюдать эффекты на разных стадиях мейоза.

В заключение, этот протокол описывает рассечение гонадЫ C. elegans с последующим окрашиванием DAPI и антител для флуоресцентной микроскопии. Рассечение и фиксация (шаг 2) занимает 60-90 мин, в зависимости от количества сгенерированных слайдов. Окрашивание антител (стадия 3) в основном происходит без рук и может варьироваться от 7 ч как минимум до 1,5 дней, в зависимости от времени инкубации антител. Монтаж (этапы 4.1-4.7) занимает около 15 мин. Этот общий подход к визуализации хромосом зародышевой линии и гонады может быть использован для цитологических исследований любого белка, если существует антитело или флуоресцентный реагент. В своей простейшей форме окрашивание DAPI ядер диакинеза может быть использовано для скрининга факторов, влияющих на мейотическую рекомбинацию. В сочетании с организмальным анализом численности потомства, заболеваемости самцов (фенотип Хим) и эмбриональной летальности этот цитологический подход обеспечивает одноклеточный контрапункт популяционному анализу.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-rabbit IgG Вторичные	антитела Молекулярные зонды	711-545-152
Алюминиевый блок нагрева/охлаждения	Millipore Sigma	Z743497
Bacto Peptone	Gibco	DF0118 17 0
Боросиликатное стекло Пастер Пипеты, одноразовые, 5,75 дюйма	Fisherbrand	13 678 20B	Используется для изготовления червей
Picks BSA, Бычий сывороточный альбумин	VWR	97061 420
C. elegans дикий тип (предковый)	Caenorhabditis Genetics Center	N2 (предковый)
C. elegans kle-2 (ok1151) мутанты	Caenorhabditis Genetics Center	VC768	Полный генотип этого штамма: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III). Он имеет kle-2 сбалансированный с балансирной хромосомой, отмеченной фарангальной GFP. Выберите незеленых животных, чтобы определить гомозиготных kle-2 mutants.
C. elegans spo-11 (me44) мутанты	Caenorhabditis Genetics Center	TY4342	Полный генотип этого штамма: spo-11(me44)  IV/nT1[qIs51] (IV:V). Он имеет spo-11, сбалансированный с балансирной хромосомой, отмеченной фарангальной GFP. Выбирайте незеленых животных, чтобы идентифицировать гомозиготных мутантов spo-11.
Хлорид кальция безводный	VWR	97062 590
Холестерин	Сигма Олдрич	501848300
DAPI	Life Technologies	D1306
EDTA, дигидрат динатрия соль	Apex Bioresearch Products	20 147
Чашка для эмбрионов, стекло, 30 мм резонатор	Услуги электронной микроскопии	100492-980	Используется для практики рассечения; стекло предпочтительнее, потому что препарированные животные могут прилипать к пластику
Escherichia coli<	em>Caenorhabditis Genetics Center	OP50
Контейнер для хранения пищи, пластиковые	различные	н/д	Пластиковые контейнеры с (1) относительно плоским дном, чтобы горки оставались на одном уровне; (2) крышки, которые являются воздухонепроницаемыми, но все еще могут быть легко сняты, не нарушая содержимое контейнера, и (3) имеют длину около 9 дюймов и ширину 6 дюймов являются предпочтительными
стеклянной банки	DWK Life Sciences  Wheaton	08-813E
Гидрофобный барьер PAP Pen	ImmEdge	NC9545623
Kimwipes	Kimtech Science	06 666A
Левамизола гидрохлорид	Sigma Aldrich	L0380000
сульфата магния безводный	Fisher Chemical	M65 500
игл, одноразовый, 25 г	BD PrecisionGlide	14 821 13D	синий, 1 дюйм
NGM агар, гранулированный	Apex Bioresearch Products	20 249NGM
Парапленка	Bemis	16 101
Параформальдегид (16% w/v) Водный раствор	Электронная микроскопия Науки	50 980 487
PBS, фосфатный буферный раствор (10x раствор)	Fisher BioReagents	BP399500
чашки Петри, 60-мм	Tritech Research	NC9321999	Невентилируемый, острый край
Платиновая проволока (90% платины, 10% иридия)	Tritech Research	PT 9010	Используется для изготовления червячных кирок
Хлорид калия	Fisher	BP366-500
Фосфат калия Диосновной	VWR BDH Химикаты	BDH9266 500 г
Моноосновной калийфосфат	VWR BDH Химикаты	BDH9268 500 г
Защитные стекла премиум класса 18 мм x 18 мм	Fisherbrand	12-548-AP	0.13– Бритвенные лезвия толщиной 0,17 мм
, однолезвийные	VWR	55411 055
SlowFade Gold Antifade Mountant Molecular	Probes	S36937	Альтернативы: VectaShield Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories, H-1000-10) или ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). При использовании ProLong Diamond лак для герметизации ногтей не требуется, но предметные стекла должны затвердеть в течение 24 часов перед визуализацией.
Биореагенты Фишер	Азид	BP922I 500
Хлорид натрия	Фишер Химикал	S271 500
Фосфат натрия двухосновной безводный	Сигма Олдрич	7558 79 4
Фосфат натрия двухосновной гептагидрат	Сигма Олдрич	S9390
Пенополистирол коробка	различный	н/д	Приблизительные размеры интерьера: 12 дюймов в длину, 9 дюймов в ширину, 8 дюймов в глубину
Superfrost Plus Предметные стекла для микроскопа	Fisherbrand	22 037 246
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151 500
Tryptone	Apex Bioresearch Products	20 251
Tween 20	Fisher Chemical	BP337 500
Экстракт дрожжей	Apex Биоисследовательская продукция	20 254