Классически эндокард примордия эмбрионального клапана мыши был проанализирован с использованием поперечного, коронального или сагиттального сечений. Наш новый подход к двумерной визуализации эндокарда в вальвулогенных областях позволяет проводить анализ плоской полярности и клеточной перестройки эндокарда во время развития клапана.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
En Лицо Подготовка эндокардиальной подушки к анализу планарного морфогенеза у эмбрионов мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Изучение клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе развития сердца млекопитающих, имеет важное значение для лечения врожденных пороков сердца человека. Развитие примитивных сердечных клапанов включает эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМТ) клеток эндокарда из атриовентрикулярного канала (АВК) и оттоковых путей (ОФТ) сердца в ответ на местные индуктивные сигналы миокарда и эндокарда. Как только клетки расслаиваются и вторгаются во внеклеточный матрикс (сердечный желе), расположенный между эндокардом и миокардом, образуются примитивные эндокардиальные подушки (ЭК). Этот процесс подразумевает, что эндокард должен заполнить пробелы, оставленные расслоенными клетками, и должен реорганизоваться, чтобы сойтись (сузить) или расширить (удлинить) вдоль оси. Текущие исследования показали, что путь полярности плоских клеток (PCP) регулирует субклеточную локализацию факторов, участвующих в этом процессе. Классически, начальные фазы развития сердечного клапана были изучены в поперечных сечениях эмбриональных сердец или эксплантатов in vivo AVC или OFT, культивируемых на коллагеновых гелях. Эти подходы позволяют анализировать апико-базальную полярность, но не позволяют анализировать поведение клеток в плоскости эпителия или морфологические изменения мигрирующих клеток. Здесь мы показываем экспериментальный подход, позволяющий визуализировать эндокард в вальвулогенных областях как плоское поле клеток. Такой экспериментальный подход дает возможность изучать ПЦП, планарную топологию и межклеточную связь в эндокарде OFT и AVC при разработке клапана. Расшифровка новых клеточных механизмов, участвующих в морфогенезе сердечного клапана, может способствовать пониманию врожденных пороков сердца, связанных с дефектами эндокардиальной подушки.
Введение
Сердце является первым функциональным органом эмбриона млекопитающего. Около эмбрионального дня (E) 7,5 у мышей двусторонние клетки прекардиальной мезодермы образуют сердечный полумесяц в вентральной стороне1. Сердечный полумесяц содержит две популяции прекардиальных клеток, которые включают предшественников миокарда и эндокарда2. Около E8.0 сердечные предшественники сливаются в средней линии, образуя примитивную сердечную трубку, состоящую из двух эпителиальных тканей, наружного миокарда и внутреннего эндокарда, который представляет собой специализированный эндотелий, разделенный внеклеточным матриксом, называемым серде....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Исследования на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) и Сообществом Мадрида (ref. PROEX 155.7/20). Все процедуры для животных соответствовали Директиве ЕС 2010/63EU и Рекомендации 2007/526/EC о защите животных, используемых в экспериментальных и других научных целях, принятым в испанском законодательстве в соответствии с Real Decreto 1201/2005.
1. Получение AVC и/или OFT (адаптировано из Xiao et al. 25)
- Устанавливайте кресты во второй половине дня между женским mTmG и мужским <....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Данные, сгенерированные с использованием этого протокола, показывают, что можно выполнить визуализацию лица эндокарда АВК. Первая цель состояла в том, чтобы проанализировать клеточную форму эндокарда во время формирования клапанов при клеточном разрешении (рисунок 1). Чтобы выделить отдельные клетки эндокарда при E9.5, мы использовали два трансгенных штамма мышей. (1) ROSAmT/mG представляет собой двухцветный флуоресцентный репортерный аллель Cre (tdTomato/mT<.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Эндокард представляет собой эпителиальный монослой, который покрывает всю внутреннюю поверхность эмбриональной сердечной трубки. Во время развития клапана клетки эндокарда в перспективных клапанных областях подвергаются ЭМТ, таким образом, клетки эндокарда трансформируются и перестраивают свой цитоскелет, чтобы расслоиться от эндокарда к сердечному желе. Мы и другие получили соответствующие данные о развитии клапанов у эмбрионов мышей путем анализа поперечных срезов эмбриональных сердец E8.5 и E9.5, где эндокард показан .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Это исследование было поддержано грантами PID2019-104776RB-I00 и CB16/11/00399 (CIBER CV) от MCIN/AEI/10.13039/501100011033 J.L.P.J.G.-B. финансировался Программой развития талантов из Мадридской коммуны (2020-5ª/BMD-19729). Т.Г.-К. финансировался организацией «Аюдас за формирование университетских профессоров» (FPU18/01054). Мы благодарим Отдел микроскопии и динамической визуализации CNIC, CNIC, ICTS-ReDib, совместно финансируемый MCIN/AEI /10.13039/501100011033 и FEDER «Способ сделать Европу» (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Мы также благодарим А. Галисию и Л. Мендеса за разведение мышей. Стоимость этой публикации была частично поддержана за счет средств Европейского фонда ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 4-OH-тамоксифен | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % параформальдейд | Электронная микроскопия Sciences | 157-10 | Разбавленный до 4% в воде |
| анти-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| анти-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| козы анти-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Козий антимышиный Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Слайды Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 мм x 75 мм x 1,0 мм |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Монтаж Средние | векторные лаборатории | H-1000-10 |
Ссылки
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbou....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
