Method Article

Определение термодинамической и кинетической ассоциации аптамера ДНК и тетрациклина с использованием изотермической титрационной калориметрии

DOI:

10.3791/64247

⸱

August 23rd, 2022

 ,  , 
1Aptagen LLC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол описывает использование изотермической титрационной калориметрии (ITC) для анализа кинетики ассоциации и диссоциации связывания между аптамером ДНК и тетрациклином, включая подготовку образцов, текущие стандарты и образцы, а также интерпретацию полученных данных.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Определение сродства связывания и поведения между аптамером и его мишенью является наиболее важным шагом в выборе и использовании аптамера для применения. Из-за резких различий между аптамером и малыми молекулами ученым необходимо приложить много усилий для характеристики их связывающих свойств. Изотермическая титрующая калориметрия (ITC) является мощным подходом для этой цели. ITC выходит за рамки определения констант диссоциации (Kd) и может обеспечить изменения энтальпии и стехиометрию связывания взаимодействия между двумя молекулами в фазе раствора. Этот подход проводит непрерывное титрование с использованием молекул без меток и регистрирует выделяемое тепло с течением времени при событиях связывания, производимых каждым титрованием, поэтому процесс может чувствительно измерять связывание между макромолекулами и их небольшими мишенями. В статье представлена пошаговая процедура измерения ITC выбранного аптамера с малой мишенью, тетрациклином. Этот пример доказывает универсальность методики и ее потенциал для других применений.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аптамеры представляют собой фрагменты сдНК или РНК, отобранные в процессе эволюции с высоким сродством связывания и специфичностью к желаемым мишеням 1,2, которые могут работать как элементы расширенного распознавания или химические антитела 3,4,5. Таким образом, сродство связывания и специфичность аптамеров с их мишенями играют решающую роль в выборе и применении аптамера, и изотермическая титрационная калориметрия (ITC) широко используется для этих целей характеристики. Многие подходы были использованы для определения сродства аптамеров, включая ITC, поверхностный плазмонный резонанс (SPR), колориметрическое титрование, микромасштабный термофорез (MST) и биослойную интерферометрию (BLI). Среди них ITC является одним из новейших методов определения термодинамической и кинетической ассоциации двух молекул в фазе раствора. Этот подход проводит непрерывное титрование с использованием молекул без меток и регистрирует выделяемое тепло с течением времени при событиях связывания, производимых каждым титрованием 6,7. В отличие от других методов, ITC может предложить сродство связывания, несколько сайтов связывания, а также термодинамическую и кинетическую ассоциацию (рисунок 1A). Из этих начальных параметров изменения свободной энергии Гиббса и энтропии определяются с помощью следующей зависимости:

ΔG = ΔH-TΔS

Это означает, что ITC предлагает полный термодинамический профиль молекулярного взаимодействия для выяснения механизмов связывания (рисунок 1B). Определение сродства связывания для малых молекул с аптамером затруднено из-за резко различающихся размеров между аптамером и мишенью. Между тем, ITC может обеспечить чувствительное измерение без маркировки и иммобилизации молекул, что обеспечивает средства сохранения естественной структуры аптамера и мишени во время измерения. С указанными атрибутами ЦМТ может использоваться в качестве стандартного метода для характеристики связывания между аптамером и малыми мишенями.

После выбора группой Gu этот аптамер был интегрирован с различными платформами, включая биосенсоры на основе электрохимического аптамера, конкурентный анализ аптамера, связанный с ферментами, и микротитерную пластину, которая может обеспечить высокую пропускную способность обнаружения тетрациклина 8,9,10. Однако его связующие характеристики не были выяснены достаточно хорошо, чтобы выбрать правильную платформу8; стоит охарактеризовать связывание аптамера с тетрациклином с помощью ITC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 показаны основные этапы эксперимента ITC по определению термодинамической и кинетической ассоциации аптамера ДНК и тетрациклина.

1. Подготовка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы для КВТ должны быть подготовлены в одном буфере как для аптамера, так и для лиганда, с тем чтобы избежать выделения тепла, вызванного смешиванием различных буферов из ячейки образца и шприца. Обычно это достигается путем диализа всех материалов в один буфер. Буфер обменивается с помощью протокола, адаптированного из протокола концентратора отсечения молекулярной массы (MWC) 3 кДа с некоторыми модификациями, как показано ниже:

  1. Активируйте мембрану диализной колонны (3 кДа MWC) с 1x PBS, pH 7,4, приобретенную у производителя, используя следующие этапы: заполнить 1x буфером (PBS), уравновесить в течение 10 мин при RT и центрифугу при 5000 x g в течение 15 мин.
  2. Извлеките буфер и загрузите 500 мкл образцов аптамера в колонну, центрифугу при 5000 x g и повторите ее 4x, чтобы заменить исходный буфер на 1x PBS. Когда буфер проходит через мембрану, все молекулы с массой менее 3 кДа проходят через мембрану, а аптамер останется на верхней стороне мембраны.
  3. Соберите диализированный АПТАМЕР ДНК с помощью пипетки и перенесите его в новую трубку (трубки) объемом 1,5 мл.
  4. Соберите последний проточный буфер для растворения тетрациклина. Тетрациклиновый порошок чистый и мелкий, поэтому диализ не нужен. Однако используйте предыдущий диализованный буфер для ДНК для мишени, чтобы гарантировать, что буфер для эксперимента в шприце соответствует буферу в эталонной клетке.
  5. Снова определите концентрацию аптамера с помощью УФ-видимого спектрометра. Используйте последний буфер обмена, чтобы отрегулировать концентрацию до 40 мкМ тетрациклина и 2 мкМ аптамера.
  6. Сложите ДНК-аптамер нагреванием при 90 °C в течение 10 мин, охлаждением при 4 °C в течение 10 мин, а затем возвратом к RT в течение 20 мин.
  7. Дегазировать сложенный аптамер и диализованный тетрациклин с помощью станции дегазации или вакуумного насоса, установленного на 600 мм рт.ст. при 25 °C в течение 25 мин для удаления растворенных газов.

2. Мойка инструмента и запуск тестового комплекта

  1. Очистите отверстия растворителя, чтобы убедиться, что весь путь образца чист. Очистите, выбросив раствор отходов и загрузив их чистым метанолом, водой и буфером. Каждый порт содержит более 250 мл, чтобы обеспечить достаточное количество раствора для очистки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс очистки автоматически завершается программируемым пользователем программным обеспечением управления ITC.
  2. Проверьте чистоту машины, запустив ITC с помощью буфера в буфер (т. Е. 1x PBS в 1x PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальная базовая линия шума видна между крошечным буфером в пики впрыска буфера. Когда шприц титрования и канюли будут надлежащим образом очищены и полностью высохнут, исходный уровень будет стабильным; увеличение или уменьшение базового уровня отражает грязные приборы или пузырьки внутри инструмента, которые необходимо исправить перед запуском фактических образцов.
  3. Проверьте точность машины со стандартным комплектом, который включает в себя EDTA и CaCl2 (рисунок 3), используя программу по умолчанию и следуя инструкциям производителя.

3. Запуск образца для определения связывания между аптамером и тетрациклином

  1. Установите рабочие параметры: скорость перемешивания 200 об/мин, работающая при 25 °C, 2 мкМ аптамера и 40 мкМ тетрациклина, 30 инъекций по 2,0 мкл каждая, время задержки 180 с.
  2. Проверьте необходимые тома с помощью работающего калькулятора программ. С помощью этого рабочего параметра выполните измерение ITC с использованием 230 мкл тетрациклина 40 мкМ в шприце ITC и 485 мкл 2 мкМ аптамера в пробной ячейке ITC с использованием ITC.
  3. Загрузите диализированные тетрациклиновые пластины шприца и сложенный аптамер в клетку образца, избегая пузырьков, используя пипетку.
  4. Запустите инструмент ITC, нажав кнопку «Пуск» на программном обеспечении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс работы прибора ITC полностью автоматизирован после ручного заполнения пластин образцов эталонной ячейки и титранта.

4. Анализ данных с помощью программного обеспечения

  1. Откройте программное обеспечение для анализа данных, дважды щелкнув, чтобы начать анализ данных.
  2. Откройте путь к сохраненным необработанным данным, чтобы узнать тенденцию привязки.
  3. Откройте вкладку моделирования и используйте различные модели привязки, чтобы найти наиболее подходящую для кривой данных. Затем программное обеспечение автоматически вычисляет термограмму ITC и различные термодинамические параметры, включая энтальпию (ΔH), энтропию (ΔS), свободную энергию (ΔG), константу равновесного связывания (Ka) и стехиометрию.
  4. Соберите термодинамические параметры, определенные на основе данных и информации о модели подгонки.
  5. Создайте отчет, включающий изображения термограммы ITC и различных термодинамических параметров, как показано на рисунке 4 и в таблице 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ITC обеспечивает точную константу разъединения (Kd), стехиометрию связывания и термодинамические параметры двухмолекулярных взаимодействий6. В этом примере аптамер, выбранный Kim et al.9,11, связывается с тетрациклином со сродством связывания Kd 1 = 13 мкМ, Kd 2 = 53 нМ. Интересно, что это связывание определяли с использованием метода равновесной фильтрации и сообщаемого K

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод, представленный здесь, был модифицирован в соответствии с инструкцией от TA Instruments и достаточен для определения сродства связывания и термодинамики многих выбранных аптамеров и мишеней в нашем центре. Важные шаги из этой процедуры включают обмен буфером, чтобы иметь целевой объект, соответствующий лиганду, запуск образцов с надлежащими параметрами и поиск подходящей модели привязки для анализа данных. Непрерывная регистрация выделения тепла требует устранения всего шумового тепла, например, от несоответствия б...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано финансированием исследований и разработок от Aptagen LLC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG
C TTGGGTTGGTCCCACTGCG
TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'Integrated		DNA Technologies, IncПоследовательность взята из исследования Гу, которое не идентифицировало Kd с помощью ITC (см. ссылки 8 и 9)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µ М) Система в комплекте; Gold CellsTA Instruments61000.901Изотермическая титрованная калориметрическая система
CaCl2Avantor (VWR)E506-100MLХлорид кальция 1 М в водном растворе, биотехнологическая степень, стерильная
центрифугаEppendorf5417REppendorf 5417R непревзойденна по безопасности, надежности и простоте использования. Очень прост в обслуживании благодаря бесщеточному двигателю, который вращается со скоростью до 16 400 об/мин с максимальным RCF до 25 000 x g.
Станция полной дегазации (110/230 В)TA Instruments6326Этот дегазатор оснащен автономной платформой для перемешивания, вакуумной камерой, вакуумным портом, контролем температуры и электронным таймером для надлежащей подготовки образцов.
EDTATekNovaE0375EDTA 500 мМ, pH 7,5
NanoDrop Один микрообъемный УФ-Вид спектрофотометрThermoFisherND-ONE-WUV-VIS Спектрофотометр
Nanosep, Nanosep MF и NAB Центробежные устройстваPall LaboratoryOD030C343 кДа концентратор отсечения молекулярной массы
PBS pH 7,4IBI НаучныйIB70165Буфер, содержащий фосфат натрия, хлорид натрия, фосфат калия и хлорид калия сверхчистый стерильный, отфильтрованный с использованием 0,2 &микро; м. Автоклавный при 121 градусе; C более 20 мин.
Микроцентрифужные пробирки Posi-Click 1,7 млlabForce (торговая марка Thomas Scientific)1149K01
Тетрациклин, гидрохоридEMD Millipore CorperationCAS64-75-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  2. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  3. Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
  4. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076(2017).
  5. Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
  6. Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826(2020).
  7. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
  8. Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
  9. Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
  10. Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
  11. Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
  12. Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272(2017).
  13. Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
  14. Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
  15. Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
  16. Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
  17. Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Isothermal Titration CalorimetryDNA Aptamer BindingTetracycline InteractionBinding AffinityThermodynamic ParametersKinetic AssociationAptamer FoldingBuffer ExchangeSequential Binding ModelMicroscale Thermophoresis

Related Articles