Методическая статья

Анализ проточной цитометрии гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников костного мозга мышей и стромальных нишевых клеток

DOI:

10.3791/64248

⸱

28 сентября 2022 г.

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S), Universidade do Porto, 2Department of Onco-Hematology, Instituto Português de Oncologia (IPO)-Porto, 3Unit of Biochemistry, Department of Biomedicine, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 4Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем простой протокол выделения и окрашивания клеток костного мозга мышей для фенотипа гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников вместе с поддерживающими нишевыми эндотелиальными и мезенхимальными стволовыми клетками. Также включен метод обогащения клеток, расположенных в эндостальных и центральных областях костного мозга.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Костный мозг (БМ) - это мягкие ткани, обнаруженные в костях, где в первую очередь происходит кроветворение, процесс, посредством которого образуются новые клетки крови. Таким образом, он содержит гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники (HSPC), а также поддерживающие стромальные клетки, которые способствуют поддержанию и регуляции HSPC. Гематологические и другие нарушения КМ нарушают кроветворение, воздействуя непосредственно на гемопоэтические клетки и/или через изменение ниши КМ. Здесь мы описываем метод изучения гемопоэза в норме и злокачественных новообразований с помощью фенотипического анализа БМ мышей HSPC и популяций стромальных ниш с помощью проточной цитометрии. В нашем методе подробно описаны необходимые шаги для обогащения клеток БМ в эндостальных и центральных фракциях КМ, а также соответствующие стратегии стробирования для идентификации двух ключевых типов нишевых клеток, участвующих в регуляции HSPC, эндотелиальных клеток и мезенхимальных стволовых клеток. Предложенный здесь фенотипический анализ может быть объединен с мутантами мышей, моделями заболеваний и функциональными анализами для характеристики компартмента HSPC и его ниши.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Проточная цитометрия является бесценным методом для характеристики и проспективного выделения иммунных и кроветворных клеток. Он также все чаще используется для анализа стромальных и эпителиальных популяций различных тканей. Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) обладают уникальными свойствами самообновления и мультипотентности. У взрослых млекопитающих ГСК в основном находятся в костном мозге (БМ), где они получают сигналы покоя и выживания из окружающей микросреды или ниши1. ГСК формально определяются в соответствии с функциональными анализами2. Тем не менее, несколько знаковых работ показали полезность проточной цитометрии для идентификации ГСК. Благодаря использованию ограниченных маркеров клеточной поверхности можно различать гемопоэтические популяции, которые сильно обогащены ГСК3. Таким образом, проточная цитометрия является центральным методом в области стволовых клеток. Он широко используется для оценки влияния предполагаемых типов нишевых клеток и нишевых факторов на ГСК. Сочетая проточную цитометрию с визуализацией и функциональными анализами, было показано, что ГСК критически поддерживаются периваскулярными мезенхимальными стволовыми клетками (МСК) и эндотелиальными клетками (ЭК). МСК BM представляют собой гетерогенную группу и имеют различные вклады цитокинов4, но хорошо известно, что рецептор лептина (LepR) + МСК являются ключевыми нишевыми клетками1. КМ ЭК также очень гетерогены и могут входить в состав синусоидов, артериол и сосудов типа Н/переходных сосудов5. Различные исследования показали нюансы вклада этих различных ЭК. Например, эндостальные синусоидальные ЭК пространственно ближе к покоящимся ГСК6, в то время как немигрирующие ГСК с более низкими уровнями активных форм кислорода расположены вблизи артериолярных ЭК7. Эндостальное расположение ниш по сравнению с центральным также очень важно. Эндостальные сосуды типа H связаны с периваскулярными стромальными клетками, которые теряются с возрастом, что приводит к потере ГСК8. При остром миелоидном лейкозе центральные ЭК расширяются, в то время как эндостальные сосуды и эндостальные ГСК теряются9.

Большинство исследований в этой области были сосредоточены на самом кроветворении и на внешней регуляции клеток ГСК. Тем не менее, все шире признается необходимость более четкой характеристики ниш, которые регулируют другие предшественники, а именно мультипотентные предшественники (MPP), особенно с учетом того, что они являются основными движущими силами кроветворения в устойчивом состоянии10. В отличие от фиксированной иерархической структуры, недавние исследования показали, что кроветворение представляет собой континуум, в котором ГСК дифференцируются в смещенные MPP на ранней стадии11. MPP были названы в честь различных классификационных схем12, но в недавнем консенсусном документе Международного общества экспериментальной гематологии (ISEH) предлагалось различать MPP как ранние MPP и в соответствии с их лимфоидным (MPP-Ly), мегакариоцитарным и эритроидным (MPP-Mk / E) и миелоидным (MPP-G / M) смещением13. Использование проточной цитометрии будет иметь решающее значение для дальнейшего изучения важности ниш КМ в регуляции этих популяций. Современные методы проточной цитометрии используют стратегии переменного стробирования для дифференциации HSPC и идентификации стромальных клеток, а именно EC, с использованием противоречивых маркеров. Целью данного метода является представление простого и воспроизводимого рабочего процесса окрашивания БМ для идентификации субпопуляций HSPC, гетерогенных групп EC и LepR+ MSCs. Мы считаем, что этот метод, хотя и сопоставимый с ранее описанными методами (см., например, ссылку 14), обеспечивает обновленный и простой в реализации протокол фенотипического анализа гемопоэтических клеток в двух функциональных областях костного мозга, эндостальной и центральной BM 8,15, а также стромальных нишевых клеток BM.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Животные, использованные в этом протоколе, были размещены на животноводческом объекте i3S в определенных условиях, свободных от патогенов, в 12-часовом цикле свет-темнота и в среде с контролируемой температурой. Был обеспечен свободный доступ к стандартному корму для грызунов и воде. Все животные получали гуманный уход в соответствии с критериями, изложенными Федерацией европейских ассоциаций лабораторных животных по уходу и обращению с лабораторными животными (Директива ЕС 2010/63/ЕС). Экспериментальная процедура, проведенная на животных (эвтаназия), была одобрена Комитетом по этике животных i3S (ссылка DD_2019_15) и Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. Подробную информацию о материалах, используемых в этом протоколе, можно найти в таблице материалов.

1. Приготовление растворов и окрашивание коктейлей

  1. Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS): растворите пять таблеток PBS в 1 л дистиллированной воды. Хранить при комнатной температуре (RT).
  2. PBS 2% фетальная бычья сыворотка (FBS): добавьте 10 мл FBS к 500 мл PBS. Хранить при температуре 4 °C.
  3. Буфер для лизиса эритроцитов (1x): Добавьте 50 мл 10-кратного буфера для лизиса эритроцитов к 450 мл деионизированной воды. Хранить при температуре 4 °C.
  4. Раствор коллагеназы IV и диспазы II: растворите 30 мг коллагеназы IV и 60 мг диспазы II в 30 мл HBSS для 1 мг / мл раствора коллагеназы IV и 2 мг / мл раствора диспазы II. Перед употреблением подготовьте свежий.
  5. Раствор, блокирующий Fc-рецепторы: добавьте 10 мкл очищенного антитела CD16/32 против мыши к 490 мкл PBS 2% FBS. Готовьте свежими или в предыдущий день. Хранить при температуре 4 °C до использования.
  6. Раствор для окрашивания красителя жизнеспособности флуоресцентных клеток: добавьте 2 мкл красителя жизнеспособности флуоресцентных клеток к 1 мл PBS. Перед употреблением подготовьте свежий.
  7. Коктейль происхождения биотина: смешайте 100 мкл каждого из следующих антител: биотин против мыши CD3ε, биотин против мыши CD4, биотин против мыши CD8a, биотин против мыши / CD11b человека, биотин против мыши / человека CD45R / B220, биотин против мыши Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) и биотин против мыши TER-119 / эритроидные клетки. Хранить при температуре 4 °C до использования.
  8. Первичный коктейль окрашивания ГСК: добавьте 10 мкл коктейля линии биотина, 10 мкл иммунофлуоресцентно меченного 510 антимышиного CD150 (SLAM), 10 мкл фикоэритрина (PE) против мыши Flk2 (CD135), 10 мкл перидинин-хлорофилл-протеина (PerCP) против мыши Ly-6A / E (Sca-1), 10 мкл PE / Cyanine7 против мыши CD48 и 10 мкл аллофикоцианина (APC) / Cyanine7 против мыши CD117 (c-kit) к 940 мкл PBS 2% FBS. Готовьте свежими или в предыдущий день. Хранить при температуре 4 °C в защищенном от света месте до использования.
  9. Коктейль для первичного окрашивания стромы: добавьте 5 мкл биотинилированного антитела мыши к лептину R, 6,7 мкл антитела к эндомуцину мыши против ПЭ, 10 мкл антимышиного Ly-6A/E (Sca-1) PerCP, 4 мкл PE/Cyanine7 антимышиного CD31, 10 мкл APC/Cyanine7 антимышиного CD45 и 10 мкл APC/Cyanine7 антимышиного TER-119/эритроидных клеток к 954 мкл PBS 2% FBS. Готовьте свежими или в предыдущий день. Хранить при температуре 4 °C в защищенном от света месте до использования.
  10. ГСК / раствор для вторичного окрашивания стромы: добавьте 1 мкл стрептавидина APC к 1 мл PBS 2% FBS. Готовьте свежими или в предыдущий день. Хранить при температуре 4 °C в защищенном от света месте до использования.
  11. Коктейль для окрашивания ECs: добавьте 10 мкл антитела к эндомуцину PE против мыши, 10 мкл PerCP против мыши Ly-6A / E (Sca-1), 10 мкл PE / Cyanine7 против мыши CD31, 10 мкл Alexa Fluor 647 против мыши CD54 / ICAM-1, 10 мкл APC / Cyanine7 против мыши CD45 и 10 мкл APC / Cyanine7 против мыши TER-119 / эритроидных клеток к 940 мкл PBS 2% FBS. Готовьте свежими или в предыдущий день. Хранить при температуре 4 °C в защищенном от света месте до использования.
  12. Раствор для окрашивания DAPI: добавьте 1 каплю реагента DAPI в 500 мкл PBS. Перед употреблением подготовьте свежий.

2. Отбор образцов

  1. Усыпить животное путем вывиха шейки матки (подробную информацию о животных, использованных для получения данных, представленных в этом исследовании, можно найти в дополнительной таблице 1). Положите животное животом вверх на чашку Петри и сбрызните 70% этанолом. Сделайте разрез над животом с помощью ножниц и стяните кожу до лодыжек.
  2. Возьмитесь за одну ногу и с помощью ножниц отрежьте ее нижнюю часть (там, где находится сустав между ногой и бедром), чтобы отделить ее от животного. Этот шаг также послужит вторичным подтверждающим методом эвтаназии. Снимите стопу с ноги, разрезав лодыжку. Поместите ногу в ледяной PBS 2% FBS. При необходимости повторите шаг с другой ногой.
  3. Возьмитесь за тазобедренную кость и, используя ножницы, отрежьте за ней отделение, чтобы отделить ее от животного. Поместите тазобедренную кость в ледяной PBS 2% FBS. При необходимости повторите шаг с другой тазобедренной костью.
  4. Поместите ногу (ноги) и тазобедренную кость (кости) в чашку Петри и стерильным скальпелем очистите кости. Разделите большеберцовую и бедренную кости, разрезав колено скальпелем. Поместите чистые кости в ледяной PBS 2% FBS.

3. Обработка образцов для анализа популяций гемопоэтических клеток в общем костном мозге

  1. Поместите бедренную или большеберцовую кость в ступку с ледяным PBS 2% FBS и раздавите кость, осторожно прижав ее к стенке ступки с помощью пестика. Клетки БМ высвобождаются в раствор, содержащийся в растворе.
  2. Пипеткой полученную клеточную суспензию вверх и вниз с помощью пипетки объемом 10 мл гомогенизируют и переносят в пробирку объемом 50 мл через клеточный фильтр размером 40 мкм, расположенный поверх пробирки.
  3. Если измельченные кости не выглядят белыми в этот момент, добавьте больше PBS 2% FBS в раствор и повторите дробление, а затем пипетку вверх и вниз и перенесите раствор в ту же пробирку объемом 50 мл через то же ситечко для клеток 40 мкм.
  4. Промойте раствор еще небольшим количеством PBS 2% FBS и перенесите раствор в ту же пробирку объемом 50 мл через тот же сетчатый фильтр для клеток 40 мкм. Центрифугируйте пробирку объемом 50 мл при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  5. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 5 мл буфера лизиса эритроцитов (1x) при RT путем пипетки вверх и вниз несколько раз. После 2-минутной инкубации при ЛТ добавьте 15 мл PBS 2% FBS.
  6. Центрифугируйте пробирку объемом 50 мл при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Если гранулы клетки по-прежнему выглядят красноватыми, вернитесь к шагу 3.5. Если нет, выбросьте надосадочную жидкость, ресуспендируйте гранулу в 200 мкл PBS и перенесите клеточную суспензию в лунку 96-луночной пластины с V-образным дном для окрашивания.
  7. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на абсорбирующую бумагу, и снова суспендируйте гранулу в 200 мкл раствора для окрашивания флуоресцентного красителя. Выдерживают пластину в течение 15 минут при РТ в темноте.
  8. Центрифужная пластина при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на впитывающую бумагу, и снова суспендируйте гранулу в 200 мкл PBS 2% FBS для промывки.
  9. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на абсорбирующую бумагу, и ресуспендируйте гранулу в 100 мкл раствора, блокирующего Fc-рецепторы. Выдерживают пластину в течение 10 мин при температуре 4 °C в защищенном от света месте.
  10. Добавьте 100 мкл PBS 2% FBS и пипеткой вверх и вниз несколько раз для промывки. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на абсорбирующую бумагу, и ресуспендируйте гранулу в 100 мкл коктейля первичного окрашивания ГСК. Выдерживают пластину в течение 15 минут при РТ в темноте.
  11. Добавьте 100 мкл PBS 2% FBS и пипеткой вверх и вниз несколько раз для промывки. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на абсорбирующую бумагу, и ресуспендируйте гранулу в 100 мкл вторичного окрашивающего раствора ГСК. Выдерживают пластину в течение 15 минут при РТ в темноте.
  12. Добавьте 100 мкл PBS 2% FBS и пипеткой вверх и вниз несколько раз для промывки. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на впитывающую бумагу.
  13. Ресуспендируют гранулу в 250 мкл PBS 2% FBS и переносят суспензию ячейки в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл через сетчатый фильтр ячейки 40 мкм. Хранить на льду в защищенном от света месте до проведения проточного цитометрического анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы заинтересованы в определении абсолютного количества популяций гемопоэтических клеток, добавьте шарики калибра в полистирольные пробирки перед анализом в цитометре16.

4. Обработка образцов для анализа популяций стромальных клеток в общем костном мозге

  1. Поместите бедренную или большеберцовую кость в ступку с ледяным PBS 2% FBS и раздавите кость, осторожно прижав ее к стенке ступки с помощью пестика. Отрежьте кончик наконечника P1000 ножницами и используйте его, чтобы перенести все содержимое раствора в пробирку объемом 50 мл (не пропускайте через сетчатое фильтр).
  2. Центрифугируйте пробирку объемом 50 мл при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 3 мл раствора коллагеназы IV и диспазы II. Инкубировать пробирку при 37 °C в течение 40 мин.
  3. Долейте пробирку до 25 мл PBS 2% FBS и перемешайте. Перенесите содержимое пробирки объемом 50 мл в новую пробирку объемом 50 мл через сетчатое фильтр для клеток размером 100 мкм. Добавьте 15 мл PBS 2% FBS в старую пробирку объемом 50 мл и перенесите раствор в ту же новую пробирку объемом 50 мл через тот же клеточный фильтр. Центрифуга при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  4. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 5 мл буфера лизиса эритроцитов (1x) при RT путем пипетки вверх и вниз несколько раз. После 2-минутной инкубации при ЛТ добавьте 15 мл PBS 2% FBS.
  5. Центрифугируйте пробирку объемом 50 мл при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Если гранула ячейки по-прежнему выглядит красноватой, вернитесь к шагу 4.4. Если нет, выбросьте надосадочную жидкость, ресуспендируйте гранулу в 200 мкл PBS 2% FBS и перенесите клеточную суспензию в лунку 96-луночной пластины с V-образным дном для окрашивания. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C.
  6. Если вы выполняете стромальное окрашивание, перейдите к шагу 4.7. Если вы выполняете окрашивание ЕС, перейдите к шагу 4.12.
  7. Выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на абсорбирующую бумагу, и ресуспендируйте гранулу в 100 мкл коктейля стромального первичного окрашивания. Выдерживают пластину в течение 15 минут при РТ в темноте.
  8. Добавьте 100 мкл PBS 2% FBS и пипеткой вверх и вниз несколько раз для промывки. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на абсорбирующую бумагу, и ресуспендируйте гранулу в 100 мкл раствора для вторичного окрашивания стромы. Выдерживают пластину в течение 15 минут при РТ в темноте.
  9. Добавьте 100 мкл PBS 2% FBS и пипеткой вверх и вниз несколько раз для промывки. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на впитывающую бумагу.
  10. Ресуспендируют гранулу в 250 мкл PBS 2% FBS и переносят суспензию ячейки в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл через сетчатый фильтр ячейки 40 мкм. Держать на льду в защищенном от света месте.
  11. Непосредственно перед подведением к цитометру добавьте 35 мкл окрашивающего раствора DAPI в пробирку, содержащую клеточную суспензию, для анализа проточной цитометрии и инкубируйте пробирку при ЛТ в течение 5 минут в темноте. После этой инкубации храните на льду в защищенном от света месте до анализа проточной цитометрии.
  12. Выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на абсорбирующую бумагу, и снова суспендируйте гранулу в 100 мкл коктейля для окрашивания ЭК. Выдерживают пластину в течение 15 минут при РТ в темноте.
  13. Добавьте 100 мкл PBS 2% FBS и пипеткой вверх и вниз несколько раз для промывки. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C.
  14. Выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на впитывающую бумагу. Ресуспендируют гранулу в 250 мкл PBS 2% FBS и переносят суспензию ячейки в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл через сетчатый фильтр ячейки 40 мкм. Держать на льду в защищенном от света месте.
  15. Непосредственно перед подведением к цитометру добавьте 35 мкл окрашивающего раствора DAPI в пробирку, содержащую клеточную суспензию, для анализа проточной цитометрии и инкубируйте пробирку при ЛТ в течение 5 минут в темноте. После этой инкубации храните на льду в защищенном от света месте до анализа проточной цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы заинтересованы в определении абсолютного количества популяций стромальных и эндотелиальных клеток, добавьте шарики калибра в полистирольные пробирки перед анализом в цитометре16.

5. Обработка образцов для анализа популяций гемопоэтических клеток в измельченных и промытых КМ

  1. Поместите бедренную кость на чашку Петри и отрежьте концы кости с помощью стерильного скальпеля.
  2. Промывают центральную часть кости (диафиз), пропуская 100 мкл PBS 2% FBS через внутреннюю часть кости по одному разу с каждой стороны, используя инсулиновый шприц без мертвого объема 0,5 мл и собирая раствор в микроцентрифужную пробирку, содержащую 1 мл PBS 2% FBS. Затем перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 50 мл, помеченную как промытый BM, содержащую 4 мл PBS 2% FBS. Держитесь на льду.
  3. Поместите концы кости в ступку с ледяным PBS 2% FBS и раздавите, осторожно прижав ее к стенке ступки с помощью пестика. Пипеткой полученную клеточную суспензию вверх и вниз с помощью пипетки объемом 10 мл гомогенизируют и переносят в пробирку объемом 50 мл, помеченную как измельченный BM, через сетчатое фильтр для клеток размером 40 мкм.
  4. Если раздробленная кость не выглядит белой в этот момент, добавьте в ступку еще PBS 2% FBS и повторите дробление. Затем пипеткой вверх и вниз и перенесите раствор в ту же пробирку объемом 50 мл (измельченный BM) через тот же сетчатый фильтр для клеток размером 40 мкм.
  5. Промойте раствор еще небольшим количеством PBS 2% FBS и перелейте раствор в ту же пробирку объемом 50 мл (измельченный BM) через тот же сетчатый фильтр для клеток 40 мкм.
  6. Центрифугируют пробирки объемом 50 мл, соответствующие промытым и измельченным образцам, в концентрации 500 x g в течение 3 мин при 4 °C.
  7. Выполните шаги с 3.5 по 3.13 (раздел 3) с промытыми и измельченными образцами BM.

6. Подготовка одноцветных контрольных (ПКК) для анализа проточной цитометрии

  1. Выполните шаги с 3.1 по 3.6 (раздел 3) с дополнительной костью одного из животных, не используемых для основного анализа, перенеся конечную клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку, содержащую 1 мл PBS 2% FBS вместо лунки 96-луночной пластины с V-образным дном.
  2. Перенесите 100 мкл клеточной суспензии в 8 лунок 96-луночной пластины с V-образным дном, 100 мкл в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл, содержащую 100 мкл PBS 2% FBS, помеченного как DAPI SCC, и оставшуюся клеточную суспензию в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл, содержащую 100 мкл PBS 2% FBS, помеченного как неокрашенный. Держите трубки на льду в защищенном от света месте.
  3. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 ° C и выбросьте надосадочные жидкости, перевернув пластину на абсорбирующую бумагу.
  4. Ресуспендируют одну гранулу в 100 мкл раствора для окрашивания флуоресцентного красителя, а остальные - в 100 мкл PBS 2% FBS.
  5. Добавьте 0,5 мкл следующих антител, кроме коктейля антител по происхождению, для которого добавляют 2 мкл и антитела PECy7 CD31, для которого добавляют 0,3 мкл, в каждую из лунок с клеточной суспензией в PBS 2% FBS (одно антитело на лунку, те же антитела, которые используются в основных панелях анализа, или те же флуорофорные антитела с аналогичной интенсивностью флуоресценции и содержанием эпитопов): коктейль биотиновой линии, иммунофлуоресцентно меченный 510 антимышиный CD150 (SLAM), PE анти-мышиный Flk2 (CD135), PerCP антимышиный Ly-6A/E (Sca-1), иммунофлуоресцентно меченный 647 анти-мышиный CD54/ICAM-1, PE/Cyanine7 анти-мышиный CD48 и APC/Cyanine7 анти-мышиный CD117 (c-kit). Выдерживают пластину в течение 15 минут при РТ в темноте.
  6. Добавьте 100 мкл PBS 2% FBS в каждую лунку и несколько раз пипеткой вверх и вниз для промывки. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 ° C и выбросьте надосадочные жидкости, перевернув пластину на абсорбирующую бумагу.
  7. Ресуспендируют все гранулы, кроме тех, которые соответствуют клеткам, инкубированным с коктейлем антител в 180 мкл PBS 2% FBS, и переносят клеточные суспензии в 5 мл полистирольных пробирок с круглым дном через клеточные сетчатые фильтры 40 мкм. Хранить на льду в защищенном от света месте до проведения проточного цитометрического анализа.
  8. Ресуспендируют клетки, инкубированные с коктейлем антител в 100 мкл раствора вторичного окрашивания ГСК / стромы. Выдерживают пластину в течение 15 минут при РТ в темноте.
  9. Добавьте 100 мкл PBS 2% FBS и пипеткой вверх и вниз несколько раз для промывки. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C.
  10. Ресуспендируют гранулу в 180 мкл PBS 2% FBS и переносят клеточную суспензию в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл через сетчатый фильтр ячейки 40 мкм. Хранить на льду в защищенном от света месте до проведения проточного цитометрического анализа.
  11. Непосредственно перед подойдя к цитометру, добавьте 35 мкл окрашивающего раствора DAPI в пробирку DAPI SCC и инкубируйте пробирку при ЛТ в течение 5 минут в темноте. После этой инкубации храните на льду в защищенном от света месте до анализа проточной цитометрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Репрезентативные графики проточного цитометрического анализа ГСК и МПП у здоровой молодой взрослой мыши C57Bl/6 показаны на рисунке 1. Стратегия стробирования соответствует последней гармонизирующей номенклатуре, предложенной ISEH13. При анализе воздействия возмущения, такого как инфекция или рак, важно использовать управляющую мышь в качестве эталона для обычных ворот. Управление флуоресценцией минус один (FMO) может быть особенно полезным для очерчивания границ воро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя описанный протокол прост и удобен в исполнении, особое внимание следует уделить конкретным шагам. Например, при получении промытого БМ (этап 5.2) не следует превышать объем или количество раз, указанное для прохождения PBS 2% FBS через внутреннюю часть центральной части кости, так как это может привести к значительному загрязнению промытого образца популяциями эндостальных клеток.

В протокол могут быть внесены изменения, облегчающие его выполнение исследователем. При отборе проб (секция 2...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LM был поддержан грантом Мемориального фонда леди Тата. JR был поддержан стипендией PhD от Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; стипендия FCT UI/BD/150833/2021). ML был поддержан стипендией PhD от FCT (стипендия FCT 2021.04773.BD). DD был поддержан грантами Американского общества гематологов, Фонда Паблова, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) и Португальского общества гематологии. Мы благодарим за поддержку доктора Катарину Мейрелеш и Эмилию Кардозо из центра TRACY в i3s.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антитело Alexa Fluor 647 против мыши CD54/ICAM-1BioLegend116114
APC стрептавидинBioLegend405207
антитело против мыши APC/Cyanine7 CD117 (c-kit) BioLegend105826
антитело APC/Cyanine7 против мыши CD45 антителоBioLegend103116
антитело против мышиного TER-119 / эритроидных клеток APC/Cyanine7BioLegend116223
Биотин антимышиный CD3ε антителоBioLegend100304
Биотин антимышиный CD4 антителоBioLegend100404
биотин антимышиное антитело CD8aBioLegend100704
биотин антимышиный Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) антителоBioLegend108404
биотин антитело против мышиного TER-119/эритроидных клетокBioLegend116204
антитела Biotin против мыши/человеческого CD11b антителаBioLegend101204
биотин против мыши/человеческого антитела CD45R/B220 BioLegend103204
Brilliant Violet 510 антитела против мыши CD150 (SLAM)BioLegend115929
Calibrite 2 Color BeadsBD Biosciences
Коллагеназа IVMerck Life ScienceC1889
Dispase IIMerck Life ScienceD4693
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, квалифицированная, инактивированная при нагревании, одобренная ЕС, южноамериканское происхождениеThermoFisher Scientific10500064
сбалансированный раствор соли Хэнкса (HBSS)ThermoFisher Scientific14175095
Мышиный лептин R Биотинилированное антителоR& D systemsBAF497
NucBlue Реагент с фиксированными клетками (DAPI)ThermoFisher ScientificR37606DAPI реагент
PE антитело против мышиного эндомуцинаThermoFisherScientific 12-5851-82
PE антимышиный Flk2 (CD135)ThermoFisher Scientific12-1351-82
PE/Cyanine7 антимышиный антитело CD31BioLegend102524
PE/Cyanine7 антитело к мышиному CD48BioLegend103424
PerCP антитело против мыши Ly-6A/E (Sca-1)BioLegend108122
фосфатно-солевой буфер (PBS) таблеткиMerck Life ScienceP4417
Очищенное антитело против мыши CD16/32BioLegend101302
буфер для лизиса эритроцитов 10xBioLegend420302
Zombie Violet Fixable Viability DyeBioLegend423114флуоресцентным красителем
349502 антитело

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
  2. Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
  3. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  4. Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
  5. Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189(2021).
  6. Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
  7. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  8. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  9. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  10. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
  11. Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  12. Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  13. Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
  14. Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
  15. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  16. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  17. Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519(2018).
  18. Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
  19. Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532(2018).
  20. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449(2018).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936(2016).
  22. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  23. DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
  24. Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
  25. Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Bone Marrow CellsHematopoietic Stem CellsEndosteal Bone MarrowCentral Bone MarrowMesenchymal Stem CellsEndothelial CellsPhenotypic Analysis

Похожие статьи