Здесь мы описываем простой протокол выделения и окрашивания клеток костного мозга мышей для фенотипа гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников вместе с поддерживающими нишевыми эндотелиальными и мезенхимальными стволовыми клетками. Также включен метод обогащения клеток, расположенных в эндостальных и центральных областях костного мозга.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ проточной цитометрии гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников костного мозга мышей и стромальных нишевых клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Костный мозг (БМ) - это мягкие ткани, обнаруженные в костях, где в первую очередь происходит кроветворение, процесс, посредством которого образуются новые клетки крови. Таким образом, он содержит гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники (HSPC), а также поддерживающие стромальные клетки, которые способствуют поддержанию и регуляции HSPC. Гематологические и другие нарушения КМ нарушают кроветворение, воздействуя непосредственно на гемопоэтические клетки и/или через изменение ниши КМ. Здесь мы описываем метод изучения гемопоэза в норме и злокачественных новообразований с помощью фенотипического анализа БМ мышей HSPC и популяций стромальных ниш с помощью проточной цитометрии. В нашем методе подробно описаны необходимые шаги для обогащения клеток БМ в эндостальных и центральных фракциях КМ, а также соответствующие стратегии стробирования для идентификации двух ключевых типов нишевых клеток, участвующих в регуляции HSPC, эндотелиальных клеток и мезенхимальных стволовых клеток. Предложенный здесь фенотипический анализ может быть объединен с мутантами мышей, моделями заболеваний и функциональными анализами для характеристики компартмента HSPC и его ниши.
Введение
Проточная цитометрия является бесценным методом для характеристики и проспективного выделения иммунных и кроветворных клеток. Он также все чаще используется для анализа стромальных и эпителиальных популяций различных тканей. Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) обладают уникальными свойствами самообновления и мультипотентности. У взрослых млекопитающих ГСК в основном находятся в костном мозге (БМ), где они получают сигналы покоя и выживания из окружающей микросреды или ниши1. ГСК формально определяются в соответствии с функциональными анализами2. Тем не менее, несколько знаковых работ показали полезность проточной цито....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Животные, использованные в этом протоколе, были размещены на животноводческом объекте i3S в определенных условиях, свободных от патогенов, в 12-часовом цикле свет-темнота и в среде с контролируемой температурой. Был обеспечен свободный доступ к стандартному корму для грызунов и воде. Все животные получали гуманный уход в соответствии с критериями, изложенными Федерацией европейских ассоциаций лабораторных животных по уходу и обращению с лабораторными животными (Директива ЕС 2010/63/ЕС). Экспериментальная процедура, проведенная на животных (эвтаназия), была одобрена Комитетом по этике животных i3S (ссылка DD_2019_15) и Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. Подроб....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Репрезентативные графики проточного цитометрического анализа ГСК и МПП у здоровой молодой взрослой мыши C57Bl/6 показаны на рисунке 1. Стратегия стробирования соответствует последней гармонизирующей номенклатуре, предложенной ISEH13. При анализе воздействия возмущения, такого как инфекция или рак, важно использовать управляющую мышь в качестве эталона для обычных ворот. Управление флуоресценцией минус один (FMO) может быть особенно полезным для очерчивания границ воро.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хотя описанный протокол прост и удобен в исполнении, особое внимание следует уделить конкретным шагам. Например, при получении промытого БМ (этап 5.2) не следует превышать объем или количество раз, указанное для прохождения PBS 2% FBS через внутреннюю часть центральной части кости, так как это может привести к значительному загрязнению промытого образца популяциями эндостальных клеток.
В протокол могут быть внесены изменения, облегчающие его выполнение исследователем. При отборе проб (секция 2.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Благодарности
LM был поддержан грантом Мемориального фонда леди Тата. JR был поддержан стипендией PhD от Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; стипендия FCT UI/BD/150833/2021). ML был поддержан стипендией PhD от FCT (стипендия FCT 2021.04773.BD). DD был поддержан грантами Американского общества гематологов, Фонда Паблова, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) и Португальского общества гематологии. Мы благодарим за поддержку доктора Катарину Мейрелеш и Эмилию Кардозо из центра TRACY в i3s.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Антитело Alexa Fluor 647 против мыши CD54/ICAM-1 | BioLegend | 116114 | |
| APC стрептавидин | BioLegend | 405207 | |
| антитело против мыши APC/Cyanine7 CD117 (c-kit) BioLegend | 105826 | ||
| антитело APC/Cyanine7 против мыши CD45 антитело | BioLegend | 103116 | |
| антитело против мышиного TER-119 / эритроидных клеток APC/Cyanine7 | BioLegend | 116223 | |
| Биотин антимышиный CD3ε антитело | BioLegend | 100304 | |
| Биотин антимышиный CD4 антитело | BioLegend | 100404 | |
| биотин антимышиное антитело CD8a | BioLegend | 100704 | |
| биотин антимышиный Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) антитело | BioLegend | 108404 | |
| биотин антитело против мышиного TER-119/эритроидных клеток | BioLegend | 116204 | |
| антитела Biotin против мыши/человеческого CD11b антитела | BioLegend | 101204 | |
| биотин против мыши/человеческого антитела CD45R/B220 BioLegend | 103204 | ||
| Brilliant Violet 510 антитела против мыши CD150 (SLAM) | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 Color Beads | BD Biosciences | ||
| Коллагеназа IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, квалифицированная, инактивированная при нагревании, одобренная ЕС, южноамериканское происхождение | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| сбалансированный раствор соли Хэнкса (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Мышиный лептин R Биотинилированное антитело | R& D systems | BAF497 | |
| NucBlue Реагент с фиксированными клетками (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI реагент |
| PE антитело против мышиного эндомуцина | ThermoFisher | Scientific 12-5851-82 | |
| PE антимышиный Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 антимышиный антитело CD31 | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cyanine7 антитело к мышиному CD48 | BioLegend | 103424 | |
| PerCP антитело против мыши Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend | 108122 | |
| фосфатно-солевой буфер (PBS) таблетки | Merck Life Science | P4417 | |
| Очищенное антитело против мыши CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| буфер для лизиса эритроцитов 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Dye | BioLegend | 423114 | флуоресцентным красителем |
Ссылки
- Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
