Экспериментальная количественная оценка взаимодействий между системами доставки лекарств и клетками in vitro: руководство по доклинической наномедицинской оценке

Summary

Продемонстрирован рабочий процесс для абсолютной количественной оценки взаимодействий между лекарственными средствами и клетками-носителями с использованием проточной цитометрии, чтобы обеспечить лучшую рациональную оценку новых систем доставки лекарств. Этот рабочий процесс применим к носителям лекарств любого типа.

Abstract

Основной компонент разработки систем доставки лекарств касается того, как усиливать или ослаблять взаимодействия с конкретными типами клеток. Например, химиотерапевтический препарат может быть функционализирован антителом для усиления связывания с раковыми клетками («нацеливание») или функционализирован полиэтиленгликолем, чтобы помочь избежать распознавания иммунных клеток («скрытность»). Даже на клеточном уровне оптимизация связывания и поглощения лекарственного носителя является сложной проблемой биологического дизайна. Таким образом, важно отделить то, насколько сильно новый носитель взаимодействует с клеткой, от функциональной эффективности груза перевозчика после доставки в эту ячейку.

Продолжая химиотерапевтический пример, «насколько хорошо он связывается с раковой клеткой» является отдельной проблемой от «насколько хорошо он убивает раковую клетку». Количественные анализы in vitro для последних хорошо известны и обычно полагаются на измерение жизнеспособности. Тем не менее, большинство опубликованных исследований по взаимодействиям между клетками и носителями являются качественными или полуколичественными. Как правило, эти измерения основаны на флуоресцентной маркировке носителя и, следовательно, сообщают о взаимодействиях с клетками в относительных или произвольных единицах. Однако эта работа может быть стандартизирована и сделана абсолютно количественной с небольшим количеством экспериментов по характеристике. Такая абсолютная количественная оценка ценна, поскольку она облегчает рациональное, меж- и внутриклассовое сравнение различных систем доставки лекарств - наночастиц, микрочастиц, вирусов, конъюгатов антитело-лекарство, инженерных терапевтических клеток или внеклеточных везикул.

Кроме того, количественная оценка является предпосылкой для последующих мета-анализов или подходов к моделированию in silico . В этой статье представлены видеоруководства, а также дерево решений о том, как достичь количественной оценки in vitro для систем доставки лекарств-носителей, которые учитывают различия в размере носителя и способе маркировки. Кроме того, обсуждаются дополнительные соображения по количественной оценке передовых систем доставки лекарств. Это призвано служить ценным ресурсом для улучшения рациональной оценки и проектирования для следующего поколения медицины.

Introduction

Дизайн конструкций доставки лекарств, которые демонстрируют специфическое, спроектированное поведение в зависимости от того, с каким типом клеток они сталкиваются, привлек значительный исследовательский интерес. Потенциальные конструкции доставки лекарств или «носители» включают липидные составы, нано-выращенные неорганические вещества, полимерные сборки, внеклеточные везикулы, функционализированные бактериальные клетки или модифицированные вирусы. Все они могут проявлять специфичность органов, тканей или клеток из-за физических свойств, свойств поверхности или инженерных химических функционализаций, таких как присоединение антител ^1,2

Protocol

1. Выбор подходящего потока

1. Следуйте дереву решений, показанному на рисунке 1 , чтобы определить лучший рабочий процесс (поток) (рисунок 2) для используемой экспериментальной установки. Обратитесь к обсуждению для дальнейших комментариев по этому выбору потока.
2. Если вы следуете за потоком цитометра, перейдите к шагам 2.1.1-2.2.7. Если вы следуете за массовым потоком, перейдите к шагам 3.1.1.1-3.1.5.7.

Results

Как обсуждалось ранее, различные типы носителей лекарств требуют использования различных методов для абсолютной количественной оценки ассоциации клеточных носителей. Например, 633 нм дисульфид-стабилизированные частицы поли(метакриловой кислоты) (PMA_SH) ядра-оболочки являются большими и достаточно плотными для обнаружения с помощью чувствительного проточного цитометра. Таким образом, эти частицы были помечены флуоресцентно, затем закрыты и подсчитаны с использованием бокового углового рассеяния света (SALS, ан.......

Discussion

Характеристика взаимодействий между носителями лекарств и клетками становится все более важной в разработке новых систем доставки лекарств. В частности, чтобы обеспечить рациональную оценку и сравнение различных конструкций носителей, абсолютная количественная оценка производительности указанного носителя для взаимодействия с целевыми и нецелевыми клетками имеет решающее значение. Этот протокол описывает двухпоточную методологию, которая позволяет любому исследователю, работающему с носителем лекарственного средства, пре.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	pH-стабильный краситель, используемый для маркировки носителей PMASH 150 нм, 235 нм или 633 нм; пример хорошего красителя для использования в исследованиях ассоциаций клеток-носителей
Apogee A50 Microflow	Apogee		Чувствительный проточный цитометр, способный обнаруживать мелкие носители для подсчета
CytoFLEX S Проточный цитометр	Beckman Coulter		Чувствительный проточный цитометр, способный обнаруживать малые носители для подсчета и считывания для финальных экспериментов по клеточному барьеру
FCS Express	De Novo Программное		обеспечение используется для анализа данных проточной цитометрии, т.е. выполнения гейтинга и получения медианных значений интенсивности флуоресценции выбранных популяций. Альтернативы включают FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Стандартный считыватель микропланшетов, используемый для объемных флуоресцентных измерений носителей в растворе
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Менее чувствительный проточный цитометр, но более общедоступный для исследователей. Может использоваться для считывания итогового эксперимента с клеточным носителем
NanoSight, NS300	Malvern Panalytical		Instrument, используемый для анализа отслеживания наночастиц
Prism 8	GraphPad		Software, используемый для построения графиков и расчета стандартных кривых. Альтернативы включают Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python и многие другие
наборы Quantum MESF, Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Absolute quantitation beads для проточной цитометрии. Используется для преобразования интенсивностей флуоресценции, измеренных в объеме на считывателе микропланшетов, в интенсивности флуоресценции, измеренные на проточном цитометре с использованием стандарта MESF