Методическая статья

Автоматизированный анализ внутриклеточных фенотипов сальмонеллы с помощью ImageJ

DOI:

10.3791/64263

⸱

9 августа 2022 г.

 ,  , 
1Risk Analysis and Genomic Epidemiology Unit, Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia-Romagna (IZSLER)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сальмонелла вторгается и реплицируется внутри эпителиальных клеток кишечника как в вакуолях, специфичных для сальмонеллы, так и свободно в цитозоле (гиперрепликация). Здесь описан высокопроизводительный протокол на основе флуоресцентной микроскопии для количественной оценки внутриклеточных фенотипов сальмонеллы с помощью двух дополнительных анализов изображений через ImageJ, достигая одноклеточного разрешения и оценки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сальмонелла является кишечным патогеном, способным вторгаться в эпителий кишечника и реплицироваться в энтероцитах, как внутри вакуолей, специфичных для сальмонеллы, так и свободно в цитозоле (цитозольная гиперрепликация). Эти различные фенотипы внутриклеточной репликации приводят к различным путям патогенеза, то есть цитозольная гиперрепликация вызывает воспалительную гибель клеток и экструзию в просвет кишечника, в то время как вакуолярная репликация приводит к проникновению трансэпителия и системному распространению. Значительные усилия были предприняты для создания инструментов микроскопии для изучения поведения сальмонеллы внутри захваченных клеток, таких как флуоресцентная репортерная плазмида pCHAR-Duo, которая позволяет различать вакуолярные и цитозольные бактерии по дифференциальной экспрессии mCherry и GFP. Тем не менее, внутриклеточные фенотипы часто оцениваются вручную, что является трудоемкой процедурой, которая ограничивает анализ небольшим количеством образцов и клеток. Чтобы преодолеть эти ограничения, были разработаны два дополнительных и автоматизированных анализа изображений с использованием ImageJ, свободно доступного программного обеспечения для анализа изображений. В протоколе с высокой пропускной способностью эпителиальные клетки были инфицированы сальмонеллой, несущей pCHAR-Duo, с использованием 96-луночных пластин. Визуализация проводилась с помощью автоматизированного флуоресцентного микроскопа. Затем были применены два метода анализа изображений для измерения внутриклеточного поведения сальмонеллы на разных уровнях детализации. Первый метод измеряет общую внутриклеточную бактериальную нагрузку и степень цитозольной гиперрепликации. Он быстрый и позволяет оценивать большое количество клеток и образцов, что делает его пригодным для высокопроизводительных анализов, таких как скрининговые эксперименты. Второй метод выполняет одноклеточный анализ для определения процента инфицированных клеток, средней вакуолярной нагрузки сальмонеллы и скорости цитозольной гиперрепликации, что дает более подробную информацию о поведении сальмонеллы внутри эпителиальных клеток. Протоколы могут быть выполнены специально разработанными скриптами ImageJ для автоматического выполнения пакетного анализа основных этапов взаимодействия сальмонеллы и энтероцитов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сальмонелла является наиболее часто регистрируемым бактериальным агентом, вызывающим вспышки болезней пищевого происхождения в Европейском союзе1. Первичным патологическим проявлением инфекции сальмонеллы является энтерит, который является результатом поведения возбудителя в кишечнике после приема внутрь и последующей местной воспалительной реакции2. Тем не менее, сальмонелла может также распространяться на внекишечные участки и вызывать системную инфекцию, особенно у людей с ослабленным иммунитетом. Тип взаимодействия между сальмонеллой и кишечным эпителием обусловливает исход инфекции. Попадая в просвет кишечника, сальмонелла вторгается и реплицируется внутри эпителиальных клеток кишечника. На внутриклеточном уровне сальмонелла может представлять два различных фенотипа репликации: цитозольную гиперрепликацию и интравакуолярную медленную репликацию в вакуоле, содержащих сальмонеллу (SCV). Цитозольная гиперрепликация вызывает воспалительную гибель клеток хозяина и экструзию сальмонеллы в просвет кишечника3; вакуолярная репликация приводит к проникновению трансэпителия и системному распространению4. Таким образом, степень инвазии и вакуолярная и цитозольная репликация влияют на течение инфекции.

Род Salmonella очень разнообразен, включая тысячи серотипов с различными диапазонами хозяев и способностями вызывать заболевания. Например, С. Typhimurium определяется как универсальный серовар, потому что он заражает несколько неродственных хозяев и представляет собой одну из основных причин сальмонеллеза человека. Иначе говоря, С. Дерби считается сероваром, адаптированным к свиньям, так как он в основном изолирован от свиней, но он также входит в пятерку лучших сероваров, ответственных за инфекцию человека1. Однако знания о поведении бактерий внутри эпителиальных клеток по существу ограничены изучением нескольких эталонных штаммов, таких как S. Typhimurium SL1344, которые не представляют собой огромное природное разнообразие патогенности сальмонеллы . Характеристика взаимодействия различных штаммов сальмонелл с эпителиальными клетками будет способствовать пониманию их различной патогенности. По этой причине был разработан высокопроизводительный протокол на основе флуоресцентной микроскопии для анализа внутриклеточного поведения большого количества штаммов быстрым и в значительной степени автоматизированным способом. В этом протоколе инфекцию эпителиальных клеток проводили в 96-луночных пластинах визуализации, а получение изображения производилось с помощью автоматизированного флуоресцентного микроскопа. Плазмида pCHAR-Duo использовалась для наблюдения за инвазией и репликацией фенотипов сальмонеллы внутри эпителиальных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии5. Эта плазмида несет ген, кодирующий красный флуоресцентный репортер mCherry, конститутивно экспрессируемый всеми трансформированными бактериальными клетками, и ген, кодирующий зеленый флуоресцентный репортер GFP, экспрессия которого активируется глюкозо-6-фосфатом, присутствующим исключительно в цитозоле эукариотических клеток и отсутствующим в SCV. Таким образом, плазмида позволяет различать вакуолярные и цитозольные бактерии по дифференциальной экспрессии репортеров mCherry и GFP.

Вакуолярные и цитозольные бактерии на микроскопических изображениях обычно количественно оцениваются путем ручной оценки6, но это трудоемкий метод, который ограничивает анализ небольшим количеством образцов. Поэтому были разработаны два взаимодополняющих и автоматизированных анализа изображений - анализ площади и анализ одной ячейки - с использованием ImageJ7, свободно доступного программного обеспечения для анализа изображений. Анализ площади измеряет общую внутриклеточную бактериальную нагрузку и степень цитозольной гиперрепликации с использованием данных областей, занятых эпителиальными клетками, красными и зелеными сальмонеллами в каждом полученном микроскопическом изображении. Этот метод может быть применен к изображениям, полученным при низком увеличении; поэтому он позволяет забить большое количество эпителиальных клеток с небольшим количеством изображений, сокращая время получения. Одноклеточный анализ использует сегментацию клеток для определения процента инфицированных клеток, средней вакуолярной нагрузки и процента инфицированных клеток, подвергающихся цитозольной гиперрепликации с одноклеточным разрешением.

В этом протоколе все этапы анализа изображений подробно описаны для выполнения вручную, но тот же анализ может быть автоматизирован нашими специально разработанными скриптами ImageJ. Эти скрипты также позволяют запускать пакетный анализ для автоматического анализа нескольких изображений и, таким образом, ускорять выполнение метода.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Инфицирование эпителиальных клеток сальмонеллой , несущей pCHAR-Duo репортерную плазмиду

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать многоканальную пипетку.

  1. Покройте 96-луночные пластины с черными стенками и плоским стеклянным дном коллагеном прямо перед использованием.
    1. Разбавляют ледниковую уксусную кислоту (17,4 М) в стерильной деминерализованной воде под химическим вытяжкой для получения раствора уксусной кислоты 20 мМ. В стерильных условиях фильтруйте раствор через шприцевой фильтр с размером пор 0,2 мкм. Оставьте раствор в стойке при температуре 0-4 °C на 5 мин.
    2. Разбавить 3 мг/мл коллагена до 50 мкг/мл в предварительно охлажденном 20 мМ растворе уксусной кислоты. Перемешайте путем инвертирования 10 раз, а затем дозируйте 30 мкл раствора коллагена на лунку (5 мкг коллагена /см2), держа раствор в стойке 0-4 °C, чтобы избежать гелеобразования коллагена.
    3. Убедитесь, что дно скважины полностью покрыто коллагеном, а затем оставьте пластину под ламинарным потоком на 1 ч при комнатной температуре (RT).
    4. Аккуратно удалите раствор и выполните три промывки 30 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Используйте многоканальную пипетку 100 мкл или 50 мкл, чтобы избежать отслоения коллагена.
  2. Культивирование эпителиальных клеток INT407 в покрытых коллагеном пластинах визуализации за 20-24 ч до заражения.
    1. Обычно культивируют клетки INT407 в колбах размером25 см2 в минимально необходимой среде с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), далее определяемой культуральной средой (CM), дополненной пенициллином 100 Ед / мл и стрептомицином 100 мкг / мл (Pen / Strep).
    2. Дважды промыть колбы INT407 5 мл PBS, а затем отделить клетки 1 мл раствора трипсина-ЭДТА в течение 3-5 мин при 37 °C в увлажненной 5%CO2 атмосфере за 20-24 ч до заражения. Подсчитайте ячейки и приготовьте 3 х 105 клеток/мл суспензии в СМ.
    3. Дозируйте 100 мкл клеточной суспензии/хорошо в пластинах визуализации с коллагеновым покрытием для получения 100% слияния. Инкубировать при 37 °C в увлажненной 5% co2 атмосфере в течение 1 ч для облегчения клеточной адгезии. Затем добавляют 100 мкл СМ и инкубируют при 37 °C в увлажненной 5% CO2 атмосфере в течение 20-24 ч до заражения (стадия 1.4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить изображение внутриклеточных бактерий, штаммы сальмонеллы трансформируются с помощью репортерной плазмиды pCHAR-Duo, которая была любезно предоставлена доктором Оливией Стил-Мортимер. Протестированные здесь штаммы были отобраны для представления разнообразия фенотипов, охватываемых протоколом, и проверки анализа изображений в разделе 4. Смотрите репрезентативные результаты для получения более подробной информации о штаммах, используемых в этом исследовании.
  3. Готовят стационарные фазовые культуры штаммов сальмонелл , несущих репортерную плазмиду pCHAR-Duo.
    1. Возьмите образец бульона глицерина сальмонеллы кончиком пипетки объемом 10 мкл и привите его в 1 мл бульона Luria Bertani (10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г хлорида натрия на литр), дополненного ампициллином 100 мкг / мл.
    2. Инкубируют инокулят статически при 37 °C в течение 20 ч до заражения, чтобы достичь стационарной фазы роста, соответствующей ~1 x 109 колониеобразующим единицам (КОЕ)/мл8.
  4. Инфицировать эпителиальные клетки INT407 сальмонеллой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инфекции проводятся в трех экземплярах.
    1. Аккуратно промыть клетки INT407 200 мкл PBS/лунку.
    2. Приготовьте Salmonella inoculum путем разбавления бактерий в ночной культуре в CM для получения желаемого количества КОЕ на эпителиальную клетку, определяемого как множественность инфекции (MOI). Здесь использовался MOI 100.
    3. Инокулируют 200 мкл/лунку, а затем покрывают пластину дышащей уплотнительной мембраной и инкубируют при 37 °C в увлажненной 5% атмосфере CO2 в течение 1 ч. Инокуляция считается нулевой временной отрезком инфекции.
    4. Удалите инокулятор и аккуратно промойте 200 мкл PBS/лунку, а затем добавьте 200 мкл CM с гентамицином 100 мкг/мл на лунку. Накройте пластину дышащей уплотнительной мембраной, а затем инкубируйте при 37 °C в увлажненной 5% CO2 атмосфере в течение 1 ч.
    5. Удалите СМ с гентамицином 100 мкг/мл и аккуратно вымойте 200 мкл PBS/хорошо. Добавьте 200 мкл СМ с гентамицином 10 мкг/мл на лунку, накройте пластину дышащей уплотнительной мембраной, а затем инкубируйте при 37 °C в увлажненной 5% атмосфере CO2 в течение 8 ч.

2. Фиксация образца и окрашивание эпителиальных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Держите образцы защищенными от прямого воздействия света. Объемы указаны для скважин 96-луночного плиты. Оптимизация объема требуется для различных пластин или опор клеточных культур.

  1. Через 8 ч после заражения удалите КМ и аккуратно промыть три раза 200 мкл/лунку PBS. Удалите PBS, перевернув пластину на абсорбирующей бумаге; избегайте аспирации.
  2. Зафиксируйте инфицированные монослои 100 мкл/лунку параформальдегида (ПФА) 4% в ПБС в течение 20 мин при RT. Удалите ПФА 4% и трижды промыть 200 мкл/лунку ПБС. Пластина может храниться максимум 16-24 ч при 4 °C. Перейдите к следующему шагу.
  3. Окрашивают эпителиальные клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК-пятно DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) (шаг 2.3.1) используется для анализа площади только для окрашивания ядер, а пятно скрининга высокого содержания (HCS) (шаг 2.3.2) используется для одноклеточного анализа для окрашивания всей эпителиальной клетки. Можно использовать и другие клеточные пятна, но требуется оптимизация получения и анализа изображений.
    1. Анализ площади: дозировать 100 мкл/лунку DAPI (300 нМ раствора в PBS) и инкубировать 5 мин на RT, защищенном от света.
    2. Одноклеточный анализ: пермеабилизировать 100 мкл/лунку тритона 0,1x в PBS в течение 15 мин при RT. Промыть три раза PBS и дозировать 100 мкл/лунку окрашивания HCS, разбавленного 1:2000 в PBS. Инкубировать в течение 30 мин на RT, защищенном от света.
  4. Удалите окрашивающий раствор и трижды промойте 200 мкл/лунку PBS. Добавьте 50 мкл/лунку PBS для автоматического получения изображений.

3. Получение изображений с помощью автоматизированного флуоресцентного микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь низкое увеличение (10x/0.3 NA, объектив 1 мкм/пиксель) на шаге 3.1.1 для анализа площади и высокое увеличение (40x/0.75 NA, объектив 0,255 мкм/пиксель) на шаге 3.1.2 для анализа одноэлементов используются в протоколе сбора. Можно использовать и другие увеличения, но требуется оптимизация получения и анализа изображений. Если это разрешено доступным микроскопом, получайте изображения в виде областей плитки (TR), «мозаики» смежных полей, называемых плитками, для записи больших площадей выборки. Установите автофокус в центре TR вместо установки одного для каждой плитки, чтобы уменьшить экспозицию образца во время процедуры автофокусировки.

  1. Используйте программную автофокусировку в канале окрашивания клеток (синий канал для окрашивания HCS и ядерное окрашивание DAPI) в качестве эталонного z-положения. Получение изображений в канале окрашивания клеток (465 нм, клетки или ядра) и в репортерных каналах pCHAR-Duo mCherry (610 нм, внутриклеточные сальмонеллы) и GFP (509 нм, цитозольные гиперреплицирующиеся сальмонеллы).
    1. Анализ площади: изображение ≥104 ячейки/техническая репликация (т.е. рекомендуется по меньшей мере три ТР из четырех плиток/скважин, соответствующих технической реплике) при 10-кратном увеличении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одной z-плоскости достаточно для изображения как клеток, содержащих вакуолярные, так и клеток, содержащих цитозольные гиперреплицирующие сальмонеллы при 10-кратном увеличении.
    2. Анализ одной ячейки: изображение ≥1000 ячеек/техническая репликация (т.е. рекомендуется по меньшей мере два ТР по 16 плиток/скважина, соответствующая технической реплике) при 40-кратном увеличении. Несколько z-плоскостей необходимы для изображения как клеток, содержащих вакуолярные, так и клеток, содержащих цитозольные гиперреплицирующие сальмонеллы. Определение оптимального z-стека (3,85 мкм z-стек с интервалом 0,55 мкм для получения восьми z-плоскостей показано для изображения INT407 клеток, инфицированных цитозольными гиперреплицирующимися сальмонеллами в 40x). Каждая z-плоскость далее идентифицируется как n/8, с n между 1 (соответствует нижней z-плоскости) и 8 (соответствует верхней z-плоскости).
  2. Выходными данными каждого приобретения является файл с именем Acquisition.czi, который содержит изображения всех полей, каналов и z-плоскостей. Если были получены TR, объедините плитки вместе, чтобы получить общее изображение каждого TR, используя один файл Acquisition.czi в качестве входных данных для метода Stitching.

4. Анализ изображений с помощью ImageJ

ПРИМЕЧАНИЕ: Этап 4.1 и шаг 4.2 специально разработаны для эксперимента и приобретения, описанных выше. Другие экспериментальные установки могут потребовать оптимизации анализа. Описан анализ одного файла Acquisition.czi. Для пакетного анализа найдите сценарий анализа одной ячейки и сценарий анализа области в качестве дополнительных файлов (дополнительный файл 1 и дополнительный файл 2). Метки, используемые в скриптах и командах ImageJ, выделены жирным шрифтом в разделах ниже.

  1. Анализ площадей
    1. Откройте файл Acquisition.czi в ImageJ с именем AcquisitionTitle в скрипте: Файл > Открыть > AcquisitionTitle.czi. Откроется окно со всеми каналами. Каналы обозначаются как c:1-3/3 в зависимости от порядка приобретения. Здесь c:1/3 соответствует синему (DAPI), c:2/3 — mCherry ( внутриклеточные сальмонеллам) и c:3/3 — GFP (цитозольным гиперреплицирующим сальмонеллам).
    2. Уменьшение случайного шума для подготовки изображений к измерению площади на этапах 4.1.6 и 4.1.7.
      1. Создайте дубликат окна AcquisitionTitle с помощью image > Duplicate > OK , чтобы получить окно AcquisitionTitle1 .
      2. Применение гауссовского размытия к AcquisitionTitle1 с помощью фильтра > процесса > размытия Гаусса. Оставьте значение Sigma по умолчанию равным 2 и нажмите OK. Откроется окно Process Stack? , нажмите кнопку Да , чтобы обработать все каналы.
      3. Вычтите отфильтрованный по Гауссу AcquisitionTitle1 из исходного файла AcquisitionTitle by Process > Image Calculator: выберите AcquisitionTitle как Image1, выберите операцию Subtract в раскрывающемся списке, а затем выберите AcquisitionTitle1 как Image2. Нажмите OK. Откроется окно Стек процессов? . Нажмите кнопку Да , чтобы обработать все три изображения (каналы) для получения окна ResultsOfAcquisitionTitle .
    3. Разделение каналов с помощью > цветовых > разделенных каналов. Каждое изображение канала теперь отображается в отдельном окне, автоматически называемом ImageJ как C-ResultsOfAcquisitionTitle. Здесь C1-ResultsOfAcquisitionTitle соответствует DAPI, C2-ResultsOfAcquisitionTitle to mCherry (внутриклеточные сальмонеллы) и C3-ResultsOfAcquisitionTitle to GFP (цитозольные гиперреплицирующие сальмонеллы).
    4. Обработайте изображение C1-ResultsOfAcquisitionTitle для измерения площади, занимаемой ядрами эпителиальных клеток.
      1. Перейдите в раздел Обработка > Гладкий , чтобы гомогенизировать ядро, которое выглядит как отверстия внутри области ядер.
      2. Пороговое значение для изображения C1-ResultsOfAcquisitionTitle, чтобы исключить фон с помощью Image > Adjust > Threshold: установите флажок Dark Background (Темный фон ) и выберите Red в раскрывающемся списке. Установите автоматическое пороговое значение треугольника , а затем с помощью верхнего ползунка установите минимальное пороговое значение, когда ядра отображаются красным, а фон — черным (Threshold = 100, применяется в этом протоколе).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Автопороговые значения, описанные на этапах 4.1.4.2, 4.1.7, 4.2.3.6.1 и 4.2.4.3, предлагаются пользователю в качестве руководства для определения наиболее подходящего порога для ядер/эпителиальных клеток и бактерий вручную, соответственно. Значение автопорогового значения будет переопределено в скрипте заданным ручным порогом. Заданное пороговое значение вручную будет применено ко всему пакетному анализу.
    5. Выберитеинтересующие измерители с помощью команды Анализ > Набор измерений: Проверьте предел до порога , чтобы ограничить измерение пороговыми пикселями. Контрольная область, соответствующая общей площади, занимаемой пороговыми пикселями (т.е. ядра в C1-ResultsOfAcquisitionTitle, внутриклеточные сальмонеллы в C2-ResultsOfAcquisitionTitle, цитозольные гиперреплицирующие сальмонели в C3-ResultsOfAcquisitionTitle). Установите флажок Display Label( Метка отображения ), чтобы записать название и канал получения для каждого изображения в таблице результатов.
    6. Измерьте площадь, занимаемую ядрами, с помощью анализа > измерения. Измерения записываются в автоматически открывающуюся таблицу результатов.
    7. Процесс C2-ResultsOfAcquisitionTitle и C3-ResultsOfAcquisitionTitle для измерения площади, занимаемой общими внутриклеточными сальмонеллами и цитозольными гиперреплицирующимися сальмонеллами соответственно. Следуйте шагам 4.1.4-4.1.6 с некоторыми изменениями: пропустите шаг сглаживания на шаге 4.1.4.1 и используйте автоматический порог Otsu вместо треугольника на шаге 4.1.4.2 в качестве руководства для установки минимального порогового значения (верхний ползунок), когда сальмонели кажутся красными, а фон черным (рекомендуется порог = 200).
    8. Сохраните таблицу результатов с помощью функции «Файл > Сохранить как > все файлы».
    9. Откройте таблицу Результат в электронной таблице, чтобы рассчитать коэффициенты площадей для каждого анализируемого файла AcquisitionTitle :
      1. Рассчитайте коэффициент инфицирования: разделите площадь, занимаемую общими внутриклеточными сальмонеллами (здесь красный канал, С2-) на площадь, занимаемую ядрами эпителиальных клеток (здесь DAPI, C1-).
      2. Рассчитайте коэффициент гиперрепликации: разделите площадь, занимаемую цитозольными гиперреплицирующимися сальмонеллами (зеленый канал, С3-), на площадь, занимаемую общими внутриклеточными сальмонеллами (красный канал, С2-).
  2. Одноклеточный анализ
    1. Откройте файл Acquisition.czi в ImageJ с именем AcquisitionTitle в скрипте: Меню файл > Открыть > Acquisition.czi. Откроется окно, показывающее изображения всех каналов и всех z-плоскостей.
    2. Разделите каналы по > цвету изображения > разделенным каналам. Каналы теперь отображаются в отдельных окнах, автоматически называемых ImageJ как C-AcquisitionTitle. Здесь окно C1-AcquisitionTitle соответствует эпителиальным клеткам (синий), окно C2-AcquisitionTitle — внутриклеточным сальмонеллам (mCherry) и окно C3-AcquisitionTitle — цитозольному гиперреплицируемому каналу сальмонелл (GFP). Каждое окно C-AcquisitionTitle включает в себя все приобретенные z-плоскости.
    3. Обработайте C1-ПриобретениеЗаголовок окно, соответствующее эпителиальным клеткам, сегментированным клеткам.
      1. Выберите изображение z-плоскости, которое будет использоваться для сегментации ячеек. Выберите окно C1-AcquisitionTitle и используйте Image > Duplicate: запишите номер выбранной z-плоскости (т.е. 1, чтобы выбрать z 1/8), напишите C1Zplane в поле Title, снимите флажок Duplicate Stack, а затем нажмите OK , чтобы дублировать только выбранное изображение z-плоскости. Откроется окно под названием C1Zplane, показывающее выбранное изображение z-плоскости.
      2. Обработайте полученное изображение C1Zplane для повышения контрастности изображения. Откройте Process > Enhance Contrast: отрегулируйте насыщенные пиксели (т.е. здесь используется 1%) и проверьте Normalize. Затем нажмите OK , чтобы применить технику повышения контрастности для получения контрастно-нормализованного изображения C1Zplane .
      3. Обработайте контрастно-нормализованное изображение C1Zplane для сегментации эпителиальных клеток. Используйте функцию «Процесс > «Найти максимумы », чтобы открыть меню FindMaxima : сначала пометьте флажок «Выбор точки предварительного просмотра», чтобы установить «Допуск на шум», чтобы присвоить только одну точку максимума каждой эпителиальной ячейке. Флаг Исключить Край Максима. Выберите тип вывода Сегментированные частицы и нажмите OK , чтобы получить C1ZplaneSegmented, новое двоичное маскоподобное изображение, показывающее каждую сегментированную частицу на максимальную точку, отмеченную.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Алгоритм Find Maxima ImageJ используется для сегментации ячеек. Максимальные точки (пики интенсивности пикселей) обнаруживаются по всему изображению, потенциально соответствующие ячейкам. Устанавливается порог шума (толерантность к шуму), и смежная область вокруг точек максимумов анализируется для создания двоичного маскоподобного изображения, определяющего каждую сегментированную частицу на точку максимума, следовательно, каждую ячейку.
      4. Обработка C1ZplaneСегментированное изображение для создания маски сегментированных ячеек. Использовать «Анализировать > «Анализировать частицы»: выберите опцию «Показывать маски » и «Исключать по краям». Настройте диапазон площадей сегментированных частиц для включения в маску, соответствующий параметру Size , чтобы исключить неправильно сегментированные объекты, такие как кластеры ячеек и фракции ячеек. Чтобы оценить площадь ошибочно сегментированных объектов, используйте инструмент трассировки «Палочка » на панели инструментов: выберите частицу с помощью палочки, а затем откройте Анализ > Мера , чтобы измерить площадь ошибочных объектов. Установите интервал размеров (рекомендуемый диапазон 250-1700 пикселей2) и нажмите OK , чтобы получить двоичную маску MaskofC1ZplaneSegmented .
      5. По умолчанию двоичная маска MaskOfC1ZplaneSegmented имеет инвертирующий LUT. Используйте LUT > Инвертировать LUT на панели инструментов.
      6. Обработайте маску MaskOfC1ZplaneСегментированную двоичную маску для коррекции сегментации ячеек:
        1. Пороговое контрастно-нормированное изображение плоскости C1Z, полученное на шаге 4.2.3.2. Используйте image > Adjust > Threshold: установите флажок Темный фон. Установите параметр автоматического порогового значения по умолчанию . Выберите параметр «Красный» и отрегулируйте минимальное значение отсечения (верхняя полоса) до тех пор, пока ячейки не станут полностью красными, оставив темный фон (пороговое значение = 8 000 применено в этом протоколе). Затем нажмите « Применить», чтобы преобразовать контрастное нормализованное изображение C1Zplane в двоичное изображение с ячейками белого цвета и фоном в черном.
        2. Правильная сегментация ячеек в MaskOfC1ZplaneСегментированная двоичная маска. Использование обработки > image Calculator: выберите MaskOfC1ZplaneSegmented as Image1, выберите операцию AND в раскрывающемся списке, а затем выберите пороговую нормализованную контрастность C1Zplane как Image2. Нажмите OK. Выходное изображение автоматически называется ImageJ как Результаты маски сегментированной плоскости C1Z.
      7. Результаты процесса маски C1Zplane Сегментированы для маркировки каждой односегментированной ячейки как интересующей области (ROI). Используйте Анализ > Анализ частиц. Отрегулируйте Размер , как показано на шаге 4.2.3.4, а затем выберите параметр Показать ничего. Установите флажок Добавить в менеджер , чтобы добавить все частицы (сегментированные ячейки) в инструмент МЕНЕДЖЕР ОКУПАЕМОСТИ ИНВЕСТИЦИЙ. Кроме того, установите флажок Исключить по краям. Нажмите OK. В меню МЕНЕДЖЕРА ROI отобразится список всех частиц (сегментированных ячеек), определенных как ROI, уникально помеченных соответствующими координатами y и x.
      8. Сохраните данные ROI как ROI-cells-AcquisitionTitle.zip через меню менеджера ROI , щелкнув Дополнительные > Сохранить. ROI-cells-AcquisitionTitle.zip будет открыт на шаге 4.2.4.6 для анализа одной клетки.
    4. Обработайте C2-AcquisitionTitle окно (здесь красный канал), соответствующее внутриклеточному Salmonellae, для измерения количества инфицированных клеток и внутриклеточной вакуолярной нагрузки.
      1. Вычтите зеленый канал (C3-) из красного канала (C2-), чтобы удалить расфокусированные пиксели цитозольных гиперреплицирующих сальмонелл.
        1. Используйте процесс > калькулятор изображений. Выберите C2-Acquisitiontitle как Image1, выберите операцию Вычитать в раскрывающемся списке, а затем выберите C3-Acquisitiontitle как Image2. Установите флажок Создать новое окно и нажмите OK.
        2. Применить вычитание ко всему z-стеку, щелкнув Да в стеке процессов? окно. Окно вывода в скрипте называется ResultsOfC2AcquisitionTitle .
      2. Результаты процессаOfC2AcquisitionЗаголовок для уменьшения случайного шума.
        1. Продублируйте окно ResultsOfC2AcquisitionTitle , щелкнув меню изображение > Дублировать. Установите флажок Duplicate Stack и нажмите OK , чтобы получить окно ResultsOfC2AcquisitionTitle1 .
        2. Применение размытия Гаусса к окну ResultsOfC2AcquisitionTitle1 с помощью фильтра process > > размытия Гаусса. Оставьте значение Sigma как 2 или настройте его (т.е. здесь использовалась Sigma: 4). Нажмите OK и примените размытие Гаусса ко всему z-стеку, нажав кнопку Да в окне Process Stack? .
        3. Вычтите отфильтрованные по Гауссу ResultsOfC2AcquisitionTitle1 в ResultsOfC2AcquisitionTitle , щелкнув Процесс > Калькулятор изображений. Выберите ResultsOfC2AcquisitionTitle as Image1, выберите Операция вычитания в раскрывающемся списке, а затем выберите ResultsOfC2AcquisitionTitle1 как Image2. Нажмите OK. Примените вычитание ко всему z-стеку, щелкнув Да в окне Process Stack?, чтобы получить окно, автоматически названное ImageJ как Results of Results of C2-AcquisitionTitle.
      3. Обработайте результаты результатов C2-AcquisitionTitle, чтобы отделить сальмонеллы от фона. Используйте Image > Adjust > Threshold: установите флажок Темный фон и установите автоматическое пороговое значение Otsu . Отрегулируйте минимальное значение отсечки (верхний бар) до тех пор, пока сальмонелла не станет полностью красным, оставив темный фон (порог = 100 применяется в этом протоколе). Нажмите «Применить », и откроется окно «Конвертировать в двоичный файл »: отметьте «Черный фон», а затем нажмите «ОК». Полный z-стек теперь преобразуется в двоичные изображения.
      4. Выберите среднюю Z-плоскость, соответствующую вакуолярной плоскости фокусировки сальмонелл , в результатах двоичного окна Результаты C2-AcquisitionTitle из шага 4.2.4.3: Стеки > изображения > Set Slice и запишите номер z-плоскости выбора (например, здесь используется z: 4/8). Нажмите OK.
      5. Установите измерения для записи для каждой окупаемости инвестиций (ячейки). Используйте Анализ > Измерение набора: контрольная область, соответствующая общей площади каждого ROI. Установите флажки Доля площади и Предел до порога , чтобы записать только фракцию площади, занятую пороговыми пикселями (внутриклеточными сальмонеллами) для каждой рентабельности инвестиций. Проверьте на Display Label , чтобы пометить каждую рентабельность инвестиций заголовком изображения, каналом, z-плоскостью и координатами x-y в таблице результатов.
      6. Обработайте выбранную z-плоскость внутриклеточных сальмонелл в метки записи, Площадь и %Площадь, занимаемую сальмонеллами для каждой отдельной ячейки (ROI): откройте файл ROI-cells-AcquisitionTitle.zip , сохраненный на шаге 4.2.3.8, с помощью файла > Открыть и нажать «Измерить» в меню менеджера ROI. Выходные данные представляют собой таблицу, сообщающую о выбранных измерениях.
      7. Сохраните таблицу результатов с помощью команды Файл > Сохранить как в окне результатов.
      8. Откройте Таблицу результатов в электронной таблице: метка Площадь и %Площадь, занимаемая внутриклеточными сальмонеллами , указаны для каждого ROI, соответствующего контурной клетке, однозначно идентифицированной координатами x и y.
      9. Измерьте количество инфицированных клеток, соответствующее ROI, показывая %Area > 0, занятых пороговыми пикселями, соответствующими сальмонеллам (т. Е. Здесь %Area > 0,2% считается для идентификации инфицированных клеток). Затем рассчитайте процент инфицированных клеток на общее количество клеток.
      10. Измерьте вакуолярную нагрузку сальмонеллы / клетки, рассчитав среднюю процентную площадь, занимаемую вакуолярными сальмонеллами для всех инфицированных клеток.
    5. Обработайте зеленый канал (C3-AcquisitionTitle) для измерения количества клеток, показывающих цитозольные гиперреплицирующие сальмонеллы. Следуйте шагам 4.2.4.2-4.2.4.9, но с некоторыми изменениями.
      1. Работа над верхними z-плоскостями (здесь z:7/8), так как клетки, показывающие цитозольные гиперреплицирующие сальмонеллы , выступают из монослоя; поэтому они находятся в фокусе на другой плоскости по сравнению с клетками без гиперреплицирующих сальмонелл.
      2. Измерьте количество клеток, содержащих цитозольные гиперреплицирующиеся сальмонеллы (зеленый), путем оценки клеток (ROI), показывающих высокую процентную площадь, занимаемую сальмонеллами (например, %Площадь > 20% считается идентифицирующей клетки, содержащие цитозольные гиперреплицирующиеся сальмонеллы). Затем рассчитайте процент клеток, содержащих цитозольные гиперреплицирующие сальмонеллы, от общего числа инфицированных клеток, набранных на этапе 4.2.4.9.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заражение эпителиальных клеток штаммами сальмонеллы
Этот протокол был разработан для анализа клеточной инвазии и цитозольной репликации (рисунок 1А) против вакуолярной нагрузки (рисунок 1B) сальмонеллы внутри эпителиальных клеток. Протокол был подтвержден с использованием трех следующих штаммов сальмонеллы, S. Эталонный штамм Typhimurium SL1344 (S. Тм), С. Дерби ER1175 дикий тип (S. Derby wt) и изогенный мутант S. Дерби ER1175 без гена sipA (S. Дерби ΔsipA). Штамм S. Derby ER1175 был выделен из свиней и относится к коллекции изолятов сальмонеллы IZSLER. Штаммы были отобраны для того, чтобы представить разнообразие фенотипов, охватываемых протоколом. В частности, эти штаммы были выбраны потому, что их поведение внутри эпителиальных клеток, как уже было известно, различалось с точки зрения инвазии или репликации9; таким образом, они были ценными средствами контроля для проверки того, позволяет ли протокол количественно различать различия во внутриклеточных фенотипах сальмонеллы. В частности, С. Тм и С. Дерби wt были включены, потому что мы ранее продемонстрировали, что S. Tm имеет более высокую эффективность инвазии и внутриклеточной репликации, чем S. Дерби wt9 в то время как S. Derby ΔsipA был добавлен в качестве штамма с нарушением гиперрепликации, поскольку эффектор вирулентности SipA играет решающую роль в начале гиперрепликации10,11. Ранее об этом сообщалось для S. Тм, что цитозольная репликация начинается через 4 ч после инвазии, а затем цитозольная популяция быстро гиперреплицируется, чтобы заполнить эпителиальную клетку на 8 ч11,12. Последовательно, инфекция длиной 8 часов была пригодна для наблюдения и количественной оценки цитозольного гиперрепликационного фенотипа также в S. Дерби wt и S. Дерби ΔsipA.

Анализ площадей
Анализ площади на этапе 4.1 обеспечивает измерение общей колонизации эпителиальных клеток сальмонеллой (коэффициент инфекции) вместе с измерением гиперрепликации (коэффициент гиперрепликации). В рабочем процессе анализа области, описанном на рисунке 2, случайный шум уменьшается, а затем каналы разделяются и обрабатываются независимо. Для каждого канала устанавливается пороговое значение, чтобы исключить фон из измерения области. Затем для каждого канала измеряется площадь, занимаемая пороговыми пикселями. Результатом анализа площади является таблица, сообщающая для каждого файла приобретения расширение областей, занятых ядрами эпителиальных клеток (синий канал), внутриклеточными mCherry-экспрессирующими сальмонеллами (красный канал) и цитозольными гиперреплицирующимися сальмонеллами , которые экспрессируют GFP (зеленый канал) вместе с mCherry. Коэффициент инфицирования рассчитывается путем деления площади, занимаемой mCherry-экспрессирующими сальмонеллами , на площадь, занимаемую ядрами клеток-хозяев. Результаты испытаний штаммов показали, что S. Tm показывает значительно более высокий коэффициент инфицирования по сравнению с обоими S. Дерби напрягается, как и ожидалось (рисунок 3А). Таким образом, эти результаты демонстрируют эффективность анализа площади в обнаружении различий в способности штаммов сальмонеллы колонизировать эпителиальные клетки. Коэффициент гиперрепликации сальмонеллы измеряется путем деления площади, занятой GFP-экспрессирующими сальмонеллами , на площадь, занимаемую внутриклеточными мвышне-экспрессирующими сальмонеллами. В соответствии с ролью SipA в определении гиперрепликации, значительно снижается коэффициент гиперрепликации для S. Штамм Derby ΔsipA измеряли по сравнению с S. Дерби wt, (Рисунок 3B). Различий в гиперрепликации между S не наблюдалось. Тм и С. Дерби вт. В целом, анализ площади эффективно выявил различные уровни гиперрепликации среди анализируемых штаммов.

Одноклеточный анализ
Одноклеточный анализ позволяет количественно оценить инвазию сальмонеллы и вакуолярную нагрузку по сравнению с цитозольной репликацией внутри эпителиальных клеток с одноклеточным разрешением. Как описано в шаге 4.2, для каждого файла сбора синий, красный и зеленый каналы обрабатывались независимо друг от друга (рисунок 4). В частности, синий канал, соответствующий эпителиальным клеткам, обрабатывали на стадии 4.2.3 для получения сегментации клеток. Затем сегментированные ячейки были добавлены в менеджер области интереса (ROI) для получения списка ROI, соответствующего всем сегментированным ячейкам, уникально помеченным координатами y-x. Чтобы удалить расфокусированные пиксели GFP-экспрессирующих гиперреплицирующих сальмонелл, пиксели зеленого канала были вычтены из пикселей красного канала. Выходная таблица анализа одиночных клеток сообщает для каждого ROI, площадь и процент площади ROI, занимаемой сальмонеллами , выражающими только конститутивный репортер mCherry или репортер, реагирующий на цитозол GFP. Процент площади клетки, занимаемой экспрессирующими сальмонеллами только вишни, обрабатывали на этапе 4.2.4 для расчета процента инфицированных клеток и средней вакуолярной нагрузки (рисунок 5А). Анализ вакуолярной нагрузки показал, что S. Штаммы Дерби генерируют среднюю вакуолярную нагрузку значительно ниже , чем S. Tm (рисунок 5B). И наоборот, в S наблюдалось лишь незначительное и незначительное снижение процента инфицированных клеток. Штаммы Дерби по сравнению с S. Tm (рисунок 5А). Процент площади клетки, занимаемой GFP-экспрессирующими сальмонеллами, обрабатывали на этапе 4.2.5 для получения скорости гиперрепликации. Никакой разницы между S. не наблюдалось. Тм и С. Дерби wt, в то время как S. Derby ΔsipA показал значительное снижение гиперрепликации, что согласуется с результатом анализа площади (рисунок 5C) и ролью SipA в индуцировании гиперрепликации.

figure-results-1
Рисунок 1: Сальмонелла цитозольная гиперрепликация и вакуолярная нагрузка. Показаны репрезентативные изображения (А) гиперрепликации сальмонеллы и (В) вакуолярной нагрузки, полученной при большом увеличении (40x). Панель B показывает различные плоскости фокусировки клеток, содержащих гиперреплицирующиеся сальмонеллы (z:7/8), по сравнению с негипер-реплицирующимися сальмонеллами (z:4/8). Белые шкалы имеют размер 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Рабочий процесс анализа области. Показан рабочий процесс анализа площади для репрезентативного захвата с низким увеличением (10x) клеток INT407, инфицированных в течение 8 ч сальмонеллой , несущей плазмиду pCHAR-Duo (MOI 100). Сначала уменьшается случайный шум, а затем каналы разделяются на C1, C2 и C3 и обрабатываются независимо. Для каждого канала устанавливается пороговое значение, чтобы исключить фон из области измерения. Затем для каждого канала измеряется площадь, занимаемая только пороговыми пикселями, соответствующими клеточным ядрам в С1, всем внутриклеточным сальмонеллам в С2 и цитозольным сальмонеллам в С3. Изображения, проанализированные здесь, являются результатами четырех плиток, полученных при 10-кратном увеличении, слитых вместе сшиванием. Белые шкалы имеют размер 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Результаты анализа площади. Показаны результаты анализа площади. (A) Коэффициент инфицирования рассчитывается путем деления площади, занимаемой mCherry-экспрессирующими сальмонеллами (канал C2), представляющими все внутриклеточные бактерии, на площадь, занимаемую ядрами клеток-хозяев (канал C1). (B) Коэффициент гиперрепликации измеряли путем деления площади, занимаемой GFP-экспрессирующими сальмонеллами (канал C3), представляющими только цитозольные гиперреплицирующие бактерии, на площадь, занятую всеми внутриклеточными вишнево-экспрессирующими сальмонеллами. Каждая точка представляет реплику. Анализ проводился на трех биологических репликах, каждая из которых тестировалась в трех экземплярах. Черные линии обозначают средние значения. Значимость была рассчитана с помощью двуххвостого t-теста, и сообщается о значениях p . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Рабочий процесс одноклеточного анализа. Показан рабочий процесс одноклеточного анализа для репрезентативного получения с высоким увеличением (40x) клеток INT407, инфицированных в течение 8 ч сальмонеллой , несущей плазмиду pCHAR-Duo (MOI 100). Во-первых, каналы разделяются на C1, C2 и C3 и обрабатываются независимо. Синий канал (C1), соответствующий эпителиальным клеткам, обрабатывается для получения сегментации клеток, а затем каждая сегментированная клетка определяется как область интереса (ROI), уникально помеченная координатами y-x. Красный канал (C2) обрабатывают путем вычитания зеленого канала (C3) для удаления нефокусных цитозольных гиперреплицирующих сальмонелл, оставляя все вакуолярные сальмонеллы , экспрессирующие только mCherry, а затем случайный шум уменьшается, и порог устанавливается для исключения фона из измерений. Наконец, измеряется площадь, занимаемая вакуолярными сальмонеллами для каждого ROI. Зеленый канал (C3), соответствующий общему цитозольному GFP-экспрессирующему сальмонеллам, обрабатывают аналогичным образом. Изображения, проанализированные здесь, являются результатами 16 плиток, слитых вместе сшиванием. Белые шкалы имеют размер 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Результаты одноклеточного анализа. Показаны результаты одноклеточного анализа. (A) Процент инфицированных клеток получают путем деления числа клеток с процентом площади, занимаемой только экспрессирующими сальмонеллами mCherry> 0,2 на общее количество клеток. (B) Средняя вакуолярная нагрузка была получена путем расчета средней процентной площади, занимаемой только экспрессирующими сальмонеллами только вишни в инфицированных клетках. (C) Скорость гиперрепликации рассчитывали путем деления числа клеток с процентом площади, занимаемой GFP-экспрессирующими сальмонеллами≥20% от общего числа инфицированных клеток. Представлены данные трех-четырех биологических реплик, протестированных в трех экземплярах. Полосы указывают на стандартную погрешность измерения. Значимость была рассчитана с помощью двуххвостого t-теста, и сообщается о значениях p . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Скрипт анализа области. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Сценарий анализа одной клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

То, как сальмонелла колонизирует эпителиальные клетки кишечника, влияет на исход инфекции. При инвазии цитозольная гиперрепликация вызывает воспаление кишечника3, тогда как вакуолярная репликация может привести к системному распространению4. Штаммы сальмонеллы могут различаться по своей способности вторгаться и реплицироваться внутри эпителиальных клеток кишечника9. Действительно, сальмонелла является чрезвычайно разнообразным родом, включающим более 2 500 сероваров, которые обладают различными способностями вызывать заболевания. Кроме того, сальмонелла является наиболее часто регистрируемой причиной вспышек пищевого происхождения в Европейском союзе, что указывает на большое распространение в человеческой популяции1. Поэтому наличие надежных, высокопроизводительных методов количественной оценки внутриклеточных фенотипов сальмонеллы имеет большое значение для оценки различий в вирулентности среди большого числа штаммов сальмонеллы и в конечном итоге позволяет точно и специфическо оценивать риск этого патогена.

Протокол, описанный здесь, измеряет поведение сальмонеллы внутри эпителиальных клеток быстрым и автоматизированным способом. Инфицирование эпителиальных клеток выполняется в 96-луночных визуальных микропластинках, а для получения изображений используется автоматизированный флуоресцентный микроскоп, что делает протокол подходящим для высокопроизводительных приложений. Этот протокол использует преимущества плазмиды pCHAR-Duo, которая позволяет отличить вакуолярные от цитозольных сальмонелл посредством дифференциальной экспрессии двух флуоресцентных репортеров5. Внутриклеточные фенотипы сальмонеллы часто анализируются с помощью ручной оценки, трудоемкой процедуры, которая непригодна для анализа большого количества штаммов и клеточных культур на штамм и подвержена ошибкам оператора и межоператорным вариациям. Для преодоления этих ограничений были разработаны два взаимодополняющих и автоматизированных анализа изображений: анализ площади и анализ одной клетки. ImageJ, свободно доступное программное обеспечение, использовалось для разработки двух анализов. Чтобы ускорить выполнение протокола, скрипты ImageJ для пакетного анализа нескольких файлов сбора без вмешательства оператора предоставляются в качестве дополнительных файлов.

Анализ площади был разработан для количественной оценки в несколько этапов общей колонизации эпителиальных клеток (коэффициент инфекции) и уровня гиперрепликации (коэффициент гиперрепликации) путем измерения областей, специально занятых ядрами эпителиальных клеток и сальмонеллами, экспрессирующими либо mCherry, либо mCherry вместе с GFP. Анализ площади применяется к изображениям, полученным при низком увеличении, где как вакуолярные, так и гиперреплицирующиеся сальмонеллы находятся в фокусе в одной и той же z-плоскости, и большое количество эпителиальных клеток отображается на микроскопическое поле, уменьшая размер и количество файлов приобретения. Анализ площади позволяет проводить автоматизированный, быстрый и вычислительно-легкий анализ большого количества образцов, что делает его пригодным для высокопроизводительных анализов, таких как скрининговые эксперименты.

Одноклеточный анализ был разработан для количественной оценки фенотипов сальмонеллы внутри эпителиальных клеток с одноклеточным разрешением, полученным путем сегментации клеток и измерения клеточной площади и процента площади, занимаемой вакуолярными и цитозольными гиперреплицирующимися сальмонеллами. Общая колонизация эпителиальных клеток, характеризуемая с помощью анализа площади, здесь разбита на три количественных параметра: процент инфицированных клеток, средняя вакуолярная нагрузка и скорость гиперрепликации, что позволяет оценить и количественно оценить вклад каждого фенотипа в общую колонизацию, таким образом, дополняя результаты анализа области. Более подробная информация, предлагаемая одноклеточным анализом, происходит за счет более медленного получения и анализа изображений. Фактически, чтобы достичь одноячеистого разрешения, получение изображения выполняется с большим увеличением. Это означает, что для наблюдения как вакуолярных, так и цитозольных сальмонелл в фокусе необходимо несколько z-плоскостей и что для оценки большого количества эпителиальных клеток необходимо приобретение большого количества полей на образец, что увеличивает время получения по сравнению с анализом площади. Кроме того, анализ нескольких крупных файлов сбора является вычислительно сложным, поэтому требуется подходящая рабочая станция (использовалась рабочая станция с 6 ядрами и 32 ГБ ОЗУ). Таким образом, одноклеточный анализ может быть использован в качестве автономного в условиях ограниченной пропускной способности или в качестве метода второго уровня в сочетании с анализом площади, чтобы получить более глубокое понимание фенотипов сальмонеллы внутри эпителиальных клеток.

Два взаимодополняющих анализа были подтверждены с использованием S. Тм, С. Дерби wt, и S. Дерби ΔsipA, выбранный потому, что их поведение внутри эпителиальных клеток, как уже было известно, отличалось с точки зрения инвазии или репликации 9,10. Результаты площадного и одноклеточного анализов показывают, что протокол позволил количественно различить различия внутриклеточных фенотипов сальмонеллы в соответствии с характеристиками испытуемых штаммов. Кроме того, эти результаты показывают, что одноклеточный анализ позволяет количественно оценить вклад каждого внутриклеточного фенотипа (инвазия, вакуолярная нагрузка и цитозольная репликация) в общую оценку колонизации с использованием анализа площади.

Этот протокол был применен здесь для изучения патогенности in vitro различных штаммов сальмонеллы, но он может иметь и другие применения, такие как изучение случайных мутантов для идентификации генов, участвующих в инвазии и / или репликации внутри эпителиальных клеток. Кроме того, протокол может быть адаптирован для анализа поведения сальмонеллы внутри других клеточных линий, чем клетки INT407. Он также может быть использован в качестве отправной точки для разработки аналогичных методов изучения клеточно-патогенного взаимодействия других внутриклеточных микроорганизмов.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Оливию Стил-Мортимер за то, что она поделилась плазмидой pCHAR-Duo. Эта работа финансировалась Министерством здравоохранения Италии, гранты PRC2019014 и PRC2021004.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
96-луночный микропланшет для визуализацииEppendorf30741030Клеточная культура и инфекция
АмпициллинSigma-Aldrich59349Бактериальная культура
Axio наблюдательный инвертированный микроскопZEISSАвтоматизированный флуоресцентный микроскоп
Axiocam 305 MonoМикроскоп ZEISSКамера
Дышащая герметизирующая мембранаSigma-AldrichZ380059Инфекционный анализ
Colibrì 5/7ZEISSСветодиодный источник света
Коллаген I крысиный хвостLife TechnologiesA1048301Коллагеновое покрытие
DAPIInvitrogenD3571Окрашивание клеток
Фетальная бычья сывороткаGibco10099-141Клеточная культура и инфекция
ГентамицинSigma-AldrichG12664Анализ на инфекцию
Ледяная уксусная кислотаCarlo Erba401391Коллагеновое покрытие
HCS CellMask BlueInvitrogenH32720Окрашивание клеток
ImageJНациональные институты здравоохранения и Лаборатория оптического и вычислительного приборостроения (LOCI, Университет Висконсина)Программное обеспечение для обработки изображений
Minimum Essential Eagle's MediumSigma-AldrichM5650-500MLКлеточная культура и инфекция
Параформальдегид 4%InvitrogenFB002Фиксация клеток
Хлорид калияPanReac AppliChem131494.1211Препарат PBS
Одноосновной фосфат калияSigma-Aldrich60220PBS препарат
Хлорид натрияPanReac AppliChem131659.1214Препарат для культивирования бактерий и PBS
фосфат натрия DibasicSigma-Aldrich71640Препарат PBS
Колба для культуры тканей 25 см2 заглушка уплотнение завинчивающаяся крышкаEurocloneET7025Клеточная культура
Triton X-100Biorad1610407окрашивание клеток
Trypsin-EDTA (0.25%)Gibco25200056Клеточная культура и инфекция
ТриптонОксоидLP0042BКультура бактерий
Экстракт дрожжейBiolife4122202Культура бактерий

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. European Food Safety Authority & European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union One Health 2020 Zoonoses Report. EFSA Journal. 19 (12), 6971(2021).
  2. Fattinger, S. A., Sellin, M. E., Hardt, W. D. Salmonella effector driven invasion of the gut epithelium: breaking in and setting the house on fire. Current Opinion in Microbiology. 64, 9-18 (2021).
  3. Knodler, L. A., et al. Dissemination of invasive Salmonella via bacterial-induced extrusion of mucosal epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17733-17738 (2010).
  4. Fulde, M., et al. Salmonella SPI2 T3SS mediates transcytosis in polarized enterocytes in vivo. Cell Host & Microbe. , (2019).
  5. Cooper, K. G., Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. Predictable, tunable protein production in Salmonella for studying host-pathogen interactions. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 475(2017).
  6. Klein, J. A., Grenz, J. R., Slauch, J. M., Knodler, L. A. Controlled activity of the Salmonella invasion-associated injectisome reveals its intracellular role in the cytosolic population. mBio. 8 (6), 01931(2017).
  7. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  8. Ibarra, J. A., et al. Induction of Salmonella pathogenicity island 1 under different growth conditions can affect Salmonella-host cell interactions in vitro. Microbiology. 156 (4), 1120-1133 (2010).
  9. Tambassi, M., et al. Mutation of hilD in a Salmonella Derby lineage linked to swine adaptation and reduced risk to human health. Scientific Reports. 10 (1), 21539(2020).
  10. Finn, C. E., Chong, A., Cooper, K. G., Starr, T., Steele-Mortimer, O. A second wave of Salmonella T3SS1 activity prolongs the lifespan of infected epithelial cells. PLoS Pathogens. 13 (4), 1006354(2017).
  11. Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9 (1), 84681(2014).
  12. Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. A role for the Salmonella Type III Secretion System 1 in bacterial adaptation to the cytosol of epithelial cells. Molecular Microbiology. 112 (4), 1270-1283 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SalmonellaSalmonellaImageJ

Похожие статьи