Методическая статья

Трансплантация ГАМЭргических нейронов, полученных из стволовых клеток человека, в ранний послеродовой гиппокамп мыши для смягчения нарушений нервного развития

3.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64272

⸱

11 ноября 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cellular Neurophysiology and Epilepsy Group, Epilepsy Centre, Department of Clinical Sciences, Lund University Hospital, 2Experimental Epilepsy Group, Epilepsy Centre, Department of Clinical Sciences, Lund University Hospital, 3Molecular Neurophysiology and Epilepsy Group, Epilepsy Center, Department of Clinical Sciences, Lund University Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Трансплантация человеческих плюрипотентных ГАМКергических нейронов, полученных из стволовых клеток, генерируемых нейронным программированием, может быть потенциальным подходом к лечению расстройств нервного развития. Этот протокол описывает генерацию и трансплантацию ГАМКергических нейронных предшественников, полученных из стволовых клеток человека, в мозг неонатальных мышей, что позволяет проводить долгосрочное исследование привитых нейронов и оценивать их терапевтический потенциал.

Аннотация

Уменьшенное количество или дисфункция ингибирующих интернейронов является распространенным фактором нарушения нервного развития. Поэтому клеточная терапия с использованием интернейронов для замены или смягчения эффектов измененных нейронных цепей является привлекательным терапевтическим направлением. С этой целью необходимо больше знаний о том, как ГАМКергические интернейроноподобные клетки (hdIN), полученные из стволовых клеток человека, созревают, интегрируются и функционируют с течением времени в схеме хозяина. Особое значение при нарушениях нервного развития имеет лучшее понимание того, влияют ли на эти процессы в трансплантированных клетках развивающийся и созревающий мозг хозяина. Настоящий протокол описывает быструю и высокоэффективную генерацию hdIN из эмбриональных стволовых клеток человека на основе трансгенной экспрессии транскрипционных факторов Ascl1 и Dlx2. Эти предшественники нейронов пересаживаются в одностороннем порядке, через 7 дней in vitro, в гиппокамп неонатальных 2-дневных мышей. Трансплантированные нейроны рассеиваются в ипси- и контралатеральном гиппокампе мышиной модели кортикальной дисплазии-синдрома фокальной эпилепсии и выживают до 9 месяцев после трансплантации. Этот подход позволяет исследовать клеточную идентичность, интеграцию, функциональность и терапевтический потенциал трансплантированных интернейронов в течение длительного времени в развитии здорового и больного мозга.

Введение

Установление, созревание и уточнение нейронных сетей происходит в перинатальном и раннем постнатальном периоде и является решающим временным окном для развития мозга1. От послеродового изобилия связи мозг развивается до тонкой настройки связей, которые простираются до подросткового возраста2. Следовательно, изменения в генах, экспрессируемых в эти периоды, а также внешние факторы или инсульты определяют предрасположенность человека к множественным нарушениям развития нервной системы. Нарушения в познании и двигательной функции разворачиваются с течением времени, а фармакологическое лечение ограничено, большинство из них нацелены на симптомы с риском серьезных побочных эффектов.

Было показано, что дисфункция эргического ингибирования гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) является основным фактором, способствующим основной причине различных нарушений нервного развития3, таких как синдром хрупкой Х, синдром Ангельмана, эпилепсия, шизофрения и аутизм. ГАМК является основным ингибирующим передатчиком центральной нервной системы и играет важную роль в поддержании возбуждающего/тормозного (E/I) баланса, синхронизации возбуждения нейронов и вычислений. ГАМКергические интернейроны представляют собой гетерогенную популяцию нейронов, с возрастающей функциональной сложностью в более сложных областях мозга4 и с эволюцией 5,6. Учитывая ограниченную эндогенную регенеративную способность человеческого мозга и последствия дисфункции интернейрона в нескольких неврологических расстройствах, трансплантация ГАМКергических интернейронов может быть многообещающим терапевтическим направлением для изучения. Таким образом, полученные из стволовых клеток человека ГАМКергические интернейроноподобные клетки (hdIN), по-видимому, являются наиболее трансляционным и жизнеспособным источником для этой цели по сравнению с аллогенными предшественниками нейронов грызунов или другими источниками, используемыми в других местах7. Протоколы для генерации ГАМКергических нейронов из различных клеточных источников доступны 8,9,10,11,12,13, но требуется больше знаний о том, как hdIN созревают, интегрируются и функционируют с течением времени в развивающемся патологическом мозге. В нескольких исследованиях были выявлены изменения в генах, активных во время кортикального паттерна, установления нейронной связности14 и настройки физиологического баланса E/I15. Неонатальная трансплантация hdIN в мышиные модели с соответствующими генетическими возмущениями позволяет нам следить за взаимодействием между хозяином и трансплантатом, что является знанием, необходимым для определения потенциальных терапевтических стратегий.

Иммуномодуляция обычно и успешно используется при трансплантации ксенотрансплантата, чтобы избежать запуска иммунного ответа хозяина и отторжения16. Однако введение иммуносупрессивных препаратов, таких как циклоспорин А, вызывает почечную токсичность после хронического введения, является трудоемким из-за необходимости ежедневных внутрибрюшинных инъекций для достижения стабильных системных концентраций, вызывающих стресс у животных17, и имеет нецелевые эффекты, которые могут взаимодействовать с патологией18. Кроме того, было показано, что компрометация иммунной системы изменяет поведенческие фенотипы19 с изменениями в соответствующих нейроанатомических областях20. Было показано, что трансплантация в первую неделю жизни позволяет адаптироваться к трансплантированным клеткам21,22, в то время как другие сообщили о первоначальной выживаемости с последующим отторжением трансплантатов в течение первого постнатального месяца23,24.

Этот протокол описывает процедуры от генерации hdIN до трансплантации клеток у неонатальных мышей, приводящие к долгосрочной выживаемости трансплантата и позволяющие исследовать специфичность нейронов, синаптическую интеграцию, функцию и терапевтический потенциал трансплантированных интернейронов человека во время физиологического и патологического развития.

Протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены Советом по этике исследований животных Мальмё/Лунда, этическое разрешение No 12548-19, и проведены в соответствии с правилами Шведского агентства по защите животных и Директивой ЕС 2010/63/EU для экспериментов на животных. C57BL6/J и контактин-ассоциированные белковые 2 (Cntnap2) нокаутирующие (KO) мыши, как самцы, так и самки, использовались на послеродовой день (P) 2 для настоящего исследования. Использовались эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs). Животные и стволовые клетки были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов).

1. Генерация предшественников hdIN

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги в этом разделе выполняются в вытяжке клеточной культуры. HESCs поддерживались в виде клеток без кормушки на покрытых пластинах с использованием культуральной среды стволовых клеток и проходили в виде колоний.

  1. Выполните прямое программирование hESCs на предшественники hdIN (рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подход форвардного программирования основан на процедуре, описанной в Gonzalez-Ramos et al.8 и Yang et al.9.
    1. Трансдукция hESCs с лентивирусными векторами, содержащими систему Tet-On, в свежей среде культивирования стволовых клеток, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK (RI) (см. Таблицу материалов). Хранить при температуре 37 °C в инкубаторе.
    2. Измените среду на свежую среду культивирования стволовых клеток через 16 ч после трансдукции и поддерживайте трансдуцированные клетки так же, как и нетрансдуцированные гЭСК.
    3. При слиянии отсоединяйте гЭСК как одиночные клетки с помощью раствора для отсоединения клеток (см. Таблицу материалов) и обложите их покрытыми 6-луночными пластинами плотностью 3 х 105 клеток/лунка в культуральной среде стволовых клеток, содержащей 10 мкМ RI в день in vitro (DIV) −1.
    4. При 1 DIV замените среду культивирования средой N2, содержащей 2 г/л доксициклина (DOX, см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: DOX используется для индуцирования трансгенной экспрессии Ascl1 и Dlx29, от 1 DIV до 7 DIV, а затем продолжается in vivo путем его добавления в питьевую воду25.
    5. При 2 DIV начинается период отбора устойчивости к антибиотикам, который будет длиться до 5 DIV. Добавьте пуромицин (puro) и гигромицин (hygro) в свежую среду (см. Таблицу материалов). Измените носитель на 2 DIV, 4 DIV и 5 DIV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизировать концентрации puro и hygro перед протоколом дифференцировки с использованием трансдуцированных и нетрансдуцированных hESCs для обеспечения выживания только клеток, несущих кассеты устойчивости к антибиотикам. В этом протоколе использовалось 0,5 мкг/мл puro и 750 мкг/мл гигро.
    6. При 5 DIV период выбора антибиотика заканчивается. Переход на среду N2, дополненную 2 г/л DOX и 4 мкМ цитозина β-D-арабинофуранозида (Ara-C, см. Таблицу материалов).

figure-protocol-1
Рисунок 1: Генерация прекурсоров hdIN из hESCs путем гиперэкспрессии Ascl1 и Dlx2. (A) Схемы протокола дифференциации, используемого для генерации прекурсоров hdIN. (Б-Е) Иммуноцитохимия предшественников hdIN при 7 DIV для (B) нейронального маркера MAP2, (C) пролиферативного маркера Ki67, (D) общего ядерного окрашивания и (E) слияния предыдущих маркеров. Шкала: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Подготовка одноклеточной суспензии к трансплантации

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги в этом разделе выполняются в вытяжке клеточной культуры. На 7 DIV предшественники hdIN диссоциируются и используются для трансплантации.

  1. Выполните отсоединение клеток, выполнив следующие действия.
    1. Удалите среду и тщательно промойте клетки DPBS без кальция и магния.
    2. Добавляют 400 мкл раствора клеточного отсоединения (см. Таблицу материалов) к каждой лунке 6-луночной пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте покрытие всей поверхности раствором.
    3. Инкубировать в течение 2-3 мин при 37 °С в инкубаторе до тех пор, пока граница клеток не начнет выглядеть блестящей, что свидетельствует о ферментативной деградации белков клеточной поверхности и отслоении от поверхности лунки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы увеличить выживаемость клеток, не ждите слишком долго, когда все клетки полностью отделяются и плавают вокруг.
    4. Затем добавляют 600 мкл свежей среды N2 к каждой лунке 6-луночной пластины, чтобы остановить фермент, и механически с помощью пипетки помогают отсоединить клетки для получения одноклеточной суспензии.
    5. Переложите клеточную суспензию в пластиковую трубку (15 мл) и центрифугу при 180 х г в течение 4 мин при комнатной температуре (RT).
  2. Выполните повторное суспендирование клеток.
    1. Откажитесь от супернатанта с помощью вакуумной системы (осторожно, не нарушая гранулу) и повторно суспендируйте гранулу в трансплантационной среде, содержащей 10 мкМ RI, 1 мкг/мл ДНКазы и 2 мкг/мкл DOX.
    2. Подсчитайте общее количество ячеек в суспензии с помощью счетной камеры и ручного счетчика ячеек и отрегулируйте объем до конечной концентрации 100 000 клеток/мкл.
    3. Держите клеточную суспензию в закрытой трубке на льду до трансплантации максимум 4 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трансплантация должна быть выполнена в тот же день, что и приготовление клеточной суспензии (7 DIV).

3. Внутригиппокампальная трансплантация клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги в этом разделе выполняются за пределами капюшона клеточной культуры в животном учреждении. Ранняя постнатальная трансплантация клеток в мозг проводилась на Р2, считая Р0 днем рождения.

  1. Подготовьтесь к эксперименту по трансплантации, выполнив следующие действия.
    1. Автоклавировать весь хирургический материал или, если нет возможности, стерилизовать другим утвержденным методом.
    2. Установите инъекционный шприц в держатель без какого-либо стеклянного капилляра. Промойте иглу водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Игла должна быть 33 г.
    3. Изгиб на 90° кончика инсулиновой иглы весом 30 г.
    4. Создайте самодельную сцену, похожую на Play-Doh, для позиционирования щенка с плоской головой (рисунок 2A).
    5. Возьмите клетку мышей с матерью и щенками, прежде чем готовить что-либо к операции, чтобы позволить им акклиматизироваться в новой среде.
    6. Подготовьте лоток с мокрым льдом и пустую клетку с бумагой для изофлурана.
  2. Обезболить щенка мыши.
    1. Замочите лист бумаги изофлураном (см. Таблицу материалов) и поместите его в пустую клетку. Осторожно возьмите одного щенка и поместите его в клетку с бумагой, пропитанной изофлураном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не оставляйте с мамой менее трех детенышей. Не превышайте 20-30 с изофлурановой анестезии, иначе щенок может погибнуть.
    2. Проверьте эффект анестезии путем прекращения движения.
    3. Сразу после анестезии поместите щенка на влажную ткань на поверхности влажного льда. Держите животное на льду в течение 3 минут, пока верхние конечности не станут беловатыми (рисунок 2B, синяя стрелка). Обычно это занимает 2-3 мин.
    4. Используйте это время для загрузки шприца клеточной суспензией. Перед этим тщательно суспендируйте клетки пипеткой.
    5. Поместите щенка на стереотаксическую рамку. Используйте ушные вкладыши в противоположном направлении (рисунок 2А, пурпурные стрелки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Задняя сторона ушных решеток менее заостренная, и, поскольку у щенков P2 нет ушей, используйте более плоскую сторону, чтобы избежать причинения вреда животному.
    6. Сбоку проверьте, прямая ли голова. Голова должна быть плоской; используйте сцену Play-Doh-like, чтобы приспособиться к этому.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Щенки в этом возрасте еще не открыли глаза, поэтому никаких дополнительных шагов в этом отношении делать не нужно. У щенков в этом возрасте нет шерсти, поэтому бритье участка не требуется. Никакого специфического лечения боли не проводится, так как это не открытый разрез на коже, и наложение швов не проводится.
    7. Держите щенка покрытым льдом (поверх папиросной бумаги) в течение всего периода операции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не размещайте лед в непосредственном контакте с кожей щенка.
  3. Выполните инъекцию.
    1. Очистите поверхность кожи с помощью мягких тканей, пропитанных этанолом.
    2. Определите лямбду и установите координаты равными нулю на консоли цифрового дисплея стереотаксического прибора (рисунок 2C, желтая пунктирная линия). Сагиттальные и лямбдовидные швы хорошо видны глазом, так как они васкуляризированы, в виде красных линий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы испытываете трудности с визуализацией лямбды, поместите небольшой кусочек льда на кожу и подождите пару минут, пока он остынет. Затем удалите кусочек льда, и тонкое отбеливание кожи позволит визуализировать.
    3. Переместите инъекционную иглу в нужные координаты. В описанном протоколе целевой областью был гиппокамп, а координаты были следующими: передне-задний (AP) +0,85 и медио-латеральный (ML) +1,35.
    4. Используйте изогнутую на 90° инсулиновую иглу, чтобы проникнуть в череп и создать крошечное отверстие.
    5. Опустите инъекционную иглу до тех пор, пока она не пересечет череп, и обнулите координаты дорсо-вентральной (DV). Опустите иглу до нужных координат DV. В описанном протоколе координаты были DV −1.1.
    6. Вводят в соответствии с заданными временными интервалами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В описанном протоколе точные сроки были следующими: (i) после спуска к координате DV подождите 3 мин, (ii) введите 1 мкл объема в течение 5 минут и (iii) после того, как весь объем был введен, подождите 3 мин.
    7. Медленно втягивайте иглу.
  4. Завершите процедуру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Операция не может длиться более 15 минут, чтобы обеспечить выживание щенка и избежать любых повреждений, полученных от анестезии при гипотермии.
    1. Разогрейте щенка руками, пока он не начнет двигаться, прежде чем отдать его обратно матери.
    2. Вводят ДОКС в концентрации 1 мг/мл в 0,5% растворе сахарозы в виде питьевой воды в течение не менее 2 дней до и 3 недель после трансплантации (ПТ) для продолжения дифференцировки клеток in vivo.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Стереотаксическая трансплантация у детенышей новорожденных мышей в P2. (A) Стадия, похожая на Play-Doh, для удержания тела щенка в положении и перевернутые ушные перекладины (пурпурные стрелки). (B) Белая передняя лапа (синяя стрелка), указывающая на снижение кровотока в этой области, так что щенок испытывает анестезию путем переохлаждения. (C) Обзор установки со щенком, уже покрытым льдом над мягкой папиросной бумагой. (c#) Закрытый зум головы щенка, при этом инъекционная игла уже вставлена в мозг (желтая пунктирная линия, обозначающая лямбда- и лямбдовидные швы). Эта цифра адаптирована из Gonzalez Ramos et al. 27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

Следуя протоколу, представленному здесь и проиллюстрированному на рисунке 1A, предшественники hdIN еще не были пролиферативными при 7 DIV, как определено (i) отрицательной иммунореактивностью для маркера клеточного цикла Ki67 и (ii) экспрессирующими нейрональными маркерами, такими как микротрубочки-ассоциированный белок 2 (MAP2) (Рисунок 1B-E). Эта характеристика проводилась на оставшихся клетках, повторно покрытых в течение 24 ч после прохождения всех этапов процедуры. Кроме того, анализ экспрессии генов, опубликованный ранее, показал, что быстрый переход от плюрипотентного состояния к нейрональному фенотипу происходит около 4 DIV и 7 DIV8. В целом, эти результаты подтвердили наличие постмитотических клеток и отсутствие риска образования тератомы.

Затем выживаемость предшественников hdIN после ранней постнатальной трансплантации в гиппокамп мышей дикого типа (WT) была проверена иммуногистохимией против цитоплазматического маркера человека STEM121. Предшественники hdIN были пересажены в правый дорсальный гиппокамп наивных иммунокомпетентных мышей в P2, которые затем были принесены в жертву при P14 и 2 месяцах PT. Привитые клетки были обнаружены по всему дорсальному гиппокампу, а также рассеяны через мозолистое тело и контралатеральный гиппокамп в обеих временных точках. Более того, в обеих временных точках привитые hdIN экспрессировали Ascl1, один из индукционных факторов транскрипции (дополнительный рисунок 1), и не были пролиферативными, о чем свидетельствует отсутствие экспрессии Ki67 (дополнительный рисунок 2).

Важно отметить, что иммунная реакция или местное воспаление против трансплантированных клеток не было обнаружено ни при P14, ни через 2 месяца PT, что оценивалось по отсутствию реактивной микроглии, идентифицированной с использованием Iba1, CD68 и галектина-3 (Gal3) (Рисунок 3), степень астроглиоза, определяемая глиальным фибриллярным кислым белком (GFAP) и воспалительными цитокинами, такими как интерлейкин-1 (IL-1), и отсутствие цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8) (рисунок 4).

figure-results-1
Рисунок 3: hdIN в P14 и 2 месяца PT в гиппокамп новорожденных мышей WT без запуска иммунного отторжения из ткани хозяина. Иммунофлуоресценция для маркеров Iba1, CD68 и Gal3 в ткани мозга от (A-D) близости ишемизированной области ядра в модели электрокоагуляционного инсульта мыши (положительный контроль, Ctrl +), (E-H) отрицательные контрольные животные (Ctrl-) через 2 месяца и (M-P) P14, и (I-L) животные, которые подверглись трансплантации клеток через 2 месяца и (Q-T) ) П14. Белые стрелки указывают на некоторые примеры кровеносных сосудов, видимых во всех каналах из-за автофлуоресценции. Сокращения: Ctx = кора; Бедро = гиппокамп; DG = зубчатая извилина; CA1 = cornu ammonis 1. Шкала: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 4: hdIN через 2 месяца PT в гиппокамп новорожденных мышей WT, не вызывая иммунного отторжения из ткани хозяина. Иммунофлуоресценция для маркеров IL1, GFAP и CD8 в ткани мозга от (A-D) близости ишемизированной области ядра в модели электрокоагуляционного инсульта мыши (положительный контроль, Ctrl +), (E-H) отрицательных контрольных животных (Ctrl-) через 2 месяца и (I-L) животных, которые подверглись трансплантации клеток через 2 месяца. Сокращения: Ctx = кора; Бедро = гиппокамп; DG = зубчатая извилина. Шкала: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Аналогичным образом, предшественники hdIN также были пересажены в гиппокамп мышей Cntnap2 KO, модель расстройства аутистического спектра и синдрома кортикальной дисплазии-фокальной эпилепсии. У мышей Cntnap2 KO, действительно, hdIN выжили до 9 месяцев PT и были локализованы в месте инъекции, хотя они также были рассеяны по ипсилатеральному и даже контралатеральному гиппокампу, как наблюдалось у мышей WT (рисунок 5). Кроме того, большинство привитых hdIN были иммунореактивными для маркеров интернейрона, как и ожидалось из предыдущих результатов in vitro 8,26 и у взрослых грызунов in vivo25.

figure-results-3
Рисунок 5: Привитые hdIN в гиппокампе мышей Cntnap2 KO через 9 месяцев PT. (A) Иммунохимия против цитоплазматического человеческого маркера STEM121 у клеточных трансплантированных (слева) и фиктивных (справа) мышей. (а1 и а2) Увеличенные изображения положительных клеток STEM121. (B) Иммунофлуоресценция для STEM121 (пурпурный) и интернейронных маркеров парвальбумина (PV) и соматостатина (SST). Белые стрелки указывают на двойные положительные клетки для STEM121 и соответствующего маркера интернейрона. (C) Ортогональный вид привитого иммунореактивного hdIN для STEM121 и PV. Шкала: 200 мкм (A и B), 100 мкм (a1 и a2), 20 мкм (небольшое квадратное увеличение в a1 и a2 и C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Привитые hdIN через 2 месяца PT в гиппокамп новорожденных мышей WT, экспрессирующих Ascl1. Иммунофлуоресценция против Ascl1 и цитоплазматического человеческого маркера STEM121 в (A) CA3 и (B) DG у клеточных трансплантированных мышей WT. (a) Увеличенное изображение положительной клетки STEM121. Белые стрелки указывают на двойные положительные клетки для STEM121 и Ascl1. Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Постмитотические привитые hdIN через 2 месяца PT в гиппокамп новорожденных мышей WT. Иммунофлуоресценция против пролиферативного маркера Ki67 и цитоплазматического человеческого маркера STEM121 у (А) наивных и (В) трансплантированных клеток мышей WT. (b) Увеличенное изображение положительной клетки STEM121. Желтая стрелка указывает на положительную клетку для Ki67 и отрицательную для STEM121. Белая стрелка указывает на положительные клетки для STEM121 и отрицательные для Ki67. Белая звездочка указывает на боковой желудочек. Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Настоящий протокол описывает надежную, быструю, простую и широко доступную методологию генерации предшественников hdIN in vitro и ее использование в качестве ранней интервенционной клеточной терапии в доклинических моделях нарушений нервного развития.

Несмотря на то, что некоторые из характерных фенотипов нарушений нервного развития возникают в подростковом или взрослом возрасте, патофизиологические изменения уже присутствуют в раннем развитии. По этой причине раннее вмешательство было бы очень оправдано для достижения благотворного эффекта, действуя в критические периоды развития мозга до симптоматики или клинического проявления. В будущем генетический скрининг и разработка биомаркеров позволят профилактическое или предсимптоматическое лечение, что изменит правила игры для этих пациентов. Таким образом, предшественники hdIN были пересажены в начале после рождения в мышиную модель Cntnap2 KO, когда эпилептогенные изменения в нейронной сети могут продолжаться28 и в точку времени, когда клеточные изменения были описаны в этой модели29 животных. Важно, однако, учитывать потенциальные подводные камни экстраполяции возраста и времени определенных процессов в мыши по сравнению с человеческим мозгом.

Ориентируясь на саму процедуру, представленный здесь протокол дифференцировки основан на использовании факторов транскрипции, которые позволяют быстро и высокоэффективно программировать стволовые клетки по сравнению с другими протоколами в других местах на основе малых молекул10,30. Потенциальным недостатком этого подхода может быть потребность в лентивирусных векторах, что сопряжено с риском вставочного мутагенеза. Двумя критическими шагами в протоколе являются добавление антибиотиков и антимитотического агента в среду для отбора клеток, экспрессирующих факторы транскрипции, и устранения пролиферативных клеток, избегая риска образования тератомы, соответственно. Хотя в этом исследовании были протестированы только предшественники hdIN, ожидается, что процедура будет осуществима с другими источниками клеток и протоколами программирования / дифференцировки. Тем не менее, другие нейронные подтипы и/или модели должны быть проверены.

Возраст предшественника hdIN для трансплантации, 7 DIV, был определен на основе (i) отсутствия пролиферативных клеток, оцениваемых иммунореактивностью в отношении Ki67, (ii) вместе с ранее сообщенными наблюдениями снижения экспрессии генов плюрипотентности, таких как POU5F1, и появления нейронального маркера MAP2 и интернейронного маркера GAD1 в этой точкевремени 8 . Тем не менее, оригинальная работа, описывающая этот протокол, выполняла трансплантацию при 14 DIV после отмены DOX9. Это поднимает вопросы о том, может ли DOX в питьевой воде матери достичь клеток, привитых в мозг кормящих щенков через молоко, или 7 DIV индукции DOX достаточно, чтобы установить ГАМКергическую судьбу. Хотя Янг и др. определили 14 дней DOX как достаточные для генерации стабильных нейрональных клеток in vitro9, Gonzalez-Ramos et al.8 обнаружили экспрессию гена GAD1 уже при 7 DIV, что указывает на то, что последующая активация GAD67 Ascl1 и Dlx2 уже произошла в этот момент времени. Следовательно, моделирование началось с 7 DIV и может быть менее зависимым от лечения DOX. Кроме того, данные на грызунах и людях указывают на наличие DOX вгрудном молоке 31,32, а результаты, представленные здесь, показывают, что привитые hdIN были иммунореактивными для Ascl1 через 2 недели и 2 месяца PT и интернейронные маркеры позже через 9 месяцев PT. В привитой популяции, помимо PV и SST-положительных нейронов, другие маркеры субпопуляций интернейронов также были обнаружены в более низких количествах, таких как кальретинин (CR) и кальбиндин (CB).

Сложным аспектом этой процедуры является координация сроков как для дифференциации, так и для возраста щенков. Обычно беременность мыши занимает 21 день после установки брачной клетки, хотя иногда это может варьироваться. Такой сценарий не возникает при выполнении трансплантации клеток у взрослых грызунов, когда все можно тщательно спланировать и организовать. Тем не менее, это можно легко смягчить, установив две-три клетки для спаривания с интервалом в 2 дня или две-три партии дифференциации с 2-дневным интервалом друг от друга.

Хотя мыши, использованные в этом исследовании, не были ни иммунодефицитными, ни иммуносупрессированными, трансплантированные клетки выживали до 9 месяцев in vivo, а маркеры иммунной реакции против ксеногенных клеток или местного воспаления не наблюдались ни на P14, ни на 2 месяцах PT. Иммунное отторжение трансплантированных ксеногенных клеток запускается против MHC / пептидов, а ключевыми клеточными медиаторами отторжения трансплантата являются Т-лимфоциты и микроглиальные клетки33, 34. Поэтому была исследована иммунореактивность к маркерам Т-клеток, а также реактивная микроглия. Никаких признаков иммунного отторжения трансплантированных клеток в ткани хозяина не было обнаружено ни по уровням реактивной микроглии, ни по присутствию Т-лимфоцитов у мышей WT через P14 или 2 месяца. Кроме того, не наблюдалось местного воспаления на основе оцененных уровней астроглиоза и воспалительных цитокинов. Этот исход может частично зависеть от неонатальной иммунной толерантности 35,36,37, наблюдаемой другими клеточными идентичностями, местоположениями и животными моделями 35,38. Englund et al. идентифицировали региональные различия в исходе трансплантированных клеток с точки зрения миграции и созревания, включая наблюдение за привитыми клетками в соседнем белом веществе35.

Наконец, наблюдалась большая дисперсия привитых клеток в гиппокампе по сравнению с другими исследованиями, трансплантированными взрослым грызунам, где hdIN оставались в виде привитого ядра25. Эта дисперсия также отличалась от результатов, наблюдаемых ранее Янгом и др.9, что может быть объяснено в данном случае возрастом клеток на момент трансплантации.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Этот проект финансировался Шведским исследовательским советом (номер гранта: 2016-02605, M.A.), Шведским фондом мозга F02021-0369 (M.A.), Фондом Крафурда (M.A.) и Программой Европейского Союза Horizon 2020 (H2020-MSCA-ITN-2016) в рамках проекта Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network Training4CRM No. 722779 (M.K.). Мы чрезвычайно благодарны за помощь Андресу Мигесу из лаборатории Хосепа Марии Каналса (Лаборатория стволовых клеток и регенеративной медицины, Университет Барселоны) за обучение трансплантации стереотаксических клеток у новорожденных мышей P2 и Маккензи Ховард, руководителя группы в Техасском университете в Остине, за советы и предварительные координаты для трансплантации клеток в гиппокамп новорожденных мышей P2. Мы благодарим Сюзанну Герес за помощь в уходе за животными и Лин Цао за помощь в обработке тканей, а также студентов, которые так или иначе внесли свой вклад в исследование, и в частности Диану Хатамиан. Наконец, некоторые из графиков, используемых для иллюстрации этой статьи, были созданы с BioRender.com.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Игла 30 GB Braun4656300
33 G игла для шприца HamiltonHamilton7762-06
4-луночные планшетыThermo Scientific176740
AccutaseSTEMCELL Technologies7920Использование раствора для отделения клеток для расщепления клеток (предшественники hESC и hdIN)
Пипетки с регулируемым объемом 10, 20, 200, 1000 и микро; L
Alexa Fluor Plus 488/555/647Thermo Fisher1:1000
Анти-CD68 (Крыса)Bio-RadMCA19571:200
Анти-CD8 (Кролик)Abcam2030351:200
Анти-галектин 3 (КозаR& D systemsAF11971:500
Anti-GFAP (Свинка Гиена)Синаптические системы1730041:500
Anti-Iba1 (Кролик)WAKO191197411:500
Anti-IL1 (Коза)Santa Cruz BiotechSC-1061:400
Anti-Ki67Abcamab166671:250
Anti-Ki67 (Кролик)NovocastraNCL-Ki67p1:250
Анти-MAP2 (Курица)Abcamab53921:2000
Анти-Маш1 (Ascl1)Abcamab740651:1000
Анти-парвальбумин (кролик)СвантПВ 271:5000
Анти-соматостатин (крыса)MilliporeMAB3541:150
Анти-STEM121 (мышь)Takara BioY404101:400
Авидин/Биотин Блокирующий наборVECTOR LaboratoriesSP-2001
B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/JJackson Laboratory17482Животная модель
Биотинилированная лошадь против мышиVECTOR LaboratoriesBA-20011:200
Камера БеркераThermo Fisher Scientific10628431
C57BL/6JJanvier LabsЖивотная модель
Центрифугадля пробирок 15 мл
Конфокальный микроскопNikon Конфокальный микроскоп
Costar 6-луночный прозрачный TC-обработанный Corning3516
Cy3 СтрептавидинJackson ImmunoResearch016-160-0841:200
Цитозин β-D-арабинофуранозид (AraC)SigmaC17684 µ M
DAB Substrate Kit, пероксидаза (с никелем)VECTOR LaboratoriesSK-4100
Digital StereotaxKOPFModel 940
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11320082использование для N2 среды
DNase I Solution STEMCELLTechnologies79001 µ г/мл
ДоксициклинSigma-AldrichD9891 2& микро; г/мл
DPBS -/-Gibco14190144
Эпифлуоресцентный микроскопOlympusBX51 Микроскоп
этанолSolveco70%, 95%, 99,8%
FUW-rTAAddgene20342Лентивирусный вектор
FUW-TetO-Ascl1-T2A-пуромицинAddgene97329Лентивирусный вектор
FUW-TetO-Dlx2-IRES-гигромицинAddgene97330Лентивирусный вектор
H1 (WA01) ESCWiCellWA01Линия эмбриональных стволовых клеток человека в соответствии с соглашением
MTA H2O2Sigma-Aldrich18304
Hamilton SyringeHamilton7634-015 µ L
HBSSGibco14175095Без кальция, без магния - Среда для трансплантации
Hoechst 33342InvitrogenH35701:1000
Гигромицин BGibco (Invitrogen)10687010
Инкубатор5% CO2, 37° C
IsofluraneBaxter Apoteket AB
Ручной счетчик клетокVWR720-1984
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-freeCorning354277Для покрытия
MethanolMerck Millipore1060091000
Microscope Coverclosures 24 x 60 ммThermo ScientificBBAD02400500#A113MNZ#0##
Предметные стекла для микроскопаVWR631-1551
Программное обеспечение для микроскопаOlympusCellSens
Монтажные носителиMerck10981PVA-Dabco 
Мышиный адаптер к стереотаксуRWD68030
mTeSR1STEMCELL Technologies85850Kit Basal Medium and 5X Supplement - Среда для культивирования стволовых клеток
N2 добавкаGibco17502048
NaOHSigma-AldrichS80451M
Пенициллин-СтрептомицинSigma-AldrichP0781
PertexHistoLab811
Пипетка Наполнитель
Play-Doh
Пуромицин (Дигидрохлорид)GibcoA1113803
Круглая крышка стекла толщиной No1,5H (тол. ± 5 μ н) 13 мм и Oslash;MarienfeldMARI0117530Для иммуноцитохимии
СывороткаThermo FisherКозлятник, Осел, Лошадь
Стерильные наконечникиДля объемов 0,1-1000 &; L
Стерильные серологические пипетки5, 10, 25 мл
Стерильная вода BraunB
Sigma-AldrichS8501Для 0,5% раствора сахарозы
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Trypan Blue SolutionGibco15250061
TubesSarstedt15 мл, Eppendorf 1,5 мл
ПинцетVWR
Ультрачистая водаMilliQ Water System
XyleneVWR28973.363
Y-27632 (ингибитор ROCK)STEMCELL Technologies7230410 &m; М
)A1RHD пипетки Сахароза 3626873

Ссылки

  1. Kostović, I., Jovanov-Milošević, N. The development of cerebral connections during the first 20-45 weeks' gestation. Seminars in Fetal and Neonatal. 11 (6), 415-422 (2006).
  2. Innocenti, G. M., Price, D. J. Exuberance in the development of cortical networks. Nature Reviews Neuroscience. 6 (12), 955-965 (2005).
  3. Tang, X., Jaenisch, R., Sur, M. The role of GABAergic signalling in neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neuroscience. 22 (5), 290-307 (2021).
  4. Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
  5. DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: Comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
  6. Radonjić, N. V., et al. Diversity of cortical interneurons in primates: The role of the dorsal proliferative niche. Cell Reports. 9 (6), 2139-2151 (2014).
  7. Turner, D. A., Shetty, A. K. Clinical prospects for neural grafting therapy for hippocampal lesions and epilepsy. Neurosurgery. 52 (3), 632-644 (2003).
  8. Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050(2021).
  9. Yang, N., et al. Generation of pure GABAergic neurons by transcription factor programming. Nature Methods. 14 (6), 621-628 (2017).
  10. Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
  11. Yuan, F., et al. Induction of human somatostatin and parvalbumin neurons by expressing a single transcription factor LIM homeobox 6. eLife. 7, 37382(2018).
  12. Fandel, T. M., et al. Transplanted human stem cell-derived interneuron precursors mitigate mouse bladder dysfunction and central neuropathic pain after spinal cord injury. Cell Stem Cell. 19 (4), 544-557 (2016).
  13. Noakes, Z., et al. Human pluripotent stem cell-derived striatal interneurons: Differentiation and maturation in vitro and in the rat brain. Stem Cell Reports. 12 (2), 191-200 (2019).
  14. Parikshak, N. N., Gandal, M. J., Geschwind, D. H. Systems biology and gene networks in neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. Nature Reviews Genetics. 16 (8), 441-458 (2015).
  15. Marín, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
  16. Sloan, D. J., Wood, M. J., Charlton, H. M. The immune response to intracerebral neural grafts. Trends in Neurosciences. 14 (8), 341-346 (1991).
  17. Diehl, R., et al. Immunosuppression for in vivo research: State-of-the-art protocols and experimental approaches. Cellular & Molecular Immunology. 14 (2), 146-179 (2017).
  18. Osman, M. M., et al. Cyclosporine-A as a neuroprotective agent against stroke: Its translation from laboratory research to clinical application. Neuropeptides. 45 (6), 359-368 (2011).
  19. Quinnies, K. M., Cox, K. H., Rissman, E. F. Immune deficiency influences juvenile social behavior and maternal behavior. Behavioral Neuroscience. 129 (3), 331-338 (2015).
  20. Fernandes, D. J., et al. Mouse models of immune dysfunction: their neuroanatomical differences reflect their anxiety-behavioural phenotype. Molecular Psychiatry. 27 (7), 3047-3055 (2022).
  21. Lund, R. D., Rao, K., Hankin, M. H., Kunz, H. W., Gill, T. J. Transplantation of retina and visual cortex to rat brains of different ages. Maturation, connection patterns, and immunological consequences. Annals of the New York Academy of Sciences. 495, 227-241 (1987).
  22. Olsson, M., Bentlage, C., Wictorin, K., Campbell, K., Björklund, A. Extensive migration and target innervation by striatal precursors after grafting into the neonatal striatum. Neuroscience. 79 (1), 57-78 (1997).
  23. Mattis, V. B., et al. Neonatal immune-tolerance in mice does not prevent xenograft rejection. Experimental Neurology. 254, 90-98 (2014).
  24. Nato, G., et al. Immune-tolerance to human iPS-derived neural progenitors xenografted into the immature cerebellum is overridden by species-specific differences in differentiation timing. Scientific Reports. 11, 651(2021).
  25. Allison, T., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell-derived interneurons via single-cell analysis. Stem Cell Reports. 16 (10), 2548-2564 (2021).
  26. Waloschková, E., et al. Human stem cell-derived GABAergic interneurons establish efferent synapses onto host neurons in rat epileptic hippocampus and inhibit spontaneous recurrent seizures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13243(2021).
  27. Gonzalez Ramos, A. Enhancing neuronal inhibition by cell and gene therapy as a novel treatment for epilepsy. , Lund University, Faculty of Medicine. PhD thesis (2022).
  28. Paterno, R., et al. Hippocampal gamma and sharp-wave ripple oscillations are altered in a Cntnap2 mouse model of autism spectrum disorder. Cell Reports. 37 (6), 109970(2021).
  29. Penagarikano, O., et al. Absence of CNTNAP2 leads to epilepsy, neuronal migration abnormalities, and core autism-related deficits. Cell. 147 (1), 235-246 (2011).
  30. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
  31. Angeletti, B., et al. An in vivo doxycycline-controlled expression system for functional studies of the retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (2), 755-760 (2003).
  32. Doxycycline. Drugs and Lactation Database (LactMed). , National Library of Medicine. Bethesda, MD. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK500561 (2021).
  33. Barker, R. A., Widner, H. Immune problems in central nervous system cell therapy. NeuroRX. 1 (4), 472-481 (2004).
  34. Hoornaert, C. J., et al. Concise review: Innate and adaptive immune recognition of allogeneic and xenogeneic cell transplants in the central nervous system. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1434-1441 (2017).
  35. Englund, U., Fricker-Gates, R. A., Lundberg, C., Bjorklund, A., Wictorin, K. Transplantation of human neural progenitor cells into the neonatal rat brain: Extensive migration and differentiation with long-distance axonal projections. Experimental Neurology. 173 (1), 1-21 (2002).
  36. Fainstein, N., Ben-Hur, T. Brain region-dependent rejection of neural precursor cell transplants. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 136(2018).
  37. Denham, M., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, 11(2012).
  38. Miguez, A., et al. In vivo progressive degeneration of Huntington's disease patient-derived neurons reveals human-specific pathological phenotypes. bioRxiv. , (2022).

Перепечатки и разрешения

Теги

Трансплантация ГАМЭргических нейронов, полученных из стволовых клеток человека, в ранний послеродовой гиппокамп мыши для смягчения нарушений нервного развития
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.