Необходимым шагом в разработке противоопухолевого аптамера является проверка его связывания с мишенью. Мы демонстрируем анализ на основе проточной цитометрии для изучения этого связывания, подчеркивая важность включения отрицательного контрольного аптамера и раковых клеток, которые являются положительными или отрицательными для этого конкретного белка.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ связывания белка клеточной поверхности на поверхности проточной цитометрии для оценки селективности и специфичности противоопухолевого аптамера
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ключевой задачей при разработке противоопухолевого аптамера является эффективное определение селективности и специфичности разработанного аптамера к белку-мишени. Благодаря своим преимуществам перед моноклональными антителами, разработка аптамера приобрела огромную популярность среди исследователей рака. Систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX) является наиболее распространенным методом разработки аптамеров, специфичных для интересующих белков. Следуя SELEX, быстрый и эффективный связывающий анализ ускоряет процесс идентификации, подтверждая селективность и специфичность аптамера.
В этой статье объясняется пошаговый проточный цитометрический анализ связывания аптамера, специфичного для молекулы клеточной адгезии эпителия (EpCAM). Трансмембранный гликопротеин EpCAM чрезмерно экспрессируется в большинстве карцином и играет роль в инициации, прогрессировании и метастазировании рака. Поэтому он является ценным кандидатом для адресной доставки лекарств к опухолям. Для оценки селективности и специфичности аптамера к мембранно-связанному EpCAM требуются EpCAM-положительные и -отрицательные клетки. Кроме того, требуется несвязывающий аптамер EpCAM с аналогичной длиной и 2-мерной (2D) структурой, что и EpCAM-связывающий аптамер. Анализ связывания включает в себя различные буферы (блокирующий буфер, буфер промывки, буфер инкубации и буфер FACS) и этапы инкубации.
Аптамер инкубируется с клеточными линиями. После этапов инкубации и промывки клетки будут оценены с использованием чувствительного анализа проточной цитометрии. Анализ результатов показывает связывание EpCAM-специфического аптамера с EpCAM-положительными клетками, а не с EpCAM-отрицательными клетками. В EpCAM-положительных клетках это изображается как сдвиг полосы в связывании аптамера EpCAM вправо по сравнению с несвязывающим контролем аптамера. В EpCAM-отрицательных клетках соответствующие полосы EpCAM-связывающих и -несвязывающих аптамеров перекрываются. Это демонстрирует избирательность и специфичность аптамера EpCAM. Хотя этот протокол ориентирован на аптамер EpCAM, протокол применим к другим опубликованным аптамерам.
Введение
Рак по-прежнему является одной из ведущих причин смертности во всем мире1. Несмотря на значительное улучшение лечения рака в последние десятилетия, разработка противоопухолевых препаратов по-прежнему является весьма обсуждаемой темой. Это связано с тем, что химиотерапия, как основа лечения рака, сопровождается серьезными побочными эффектами, которые ограничивают соблюдение пациентом лечения. Кроме того, вызванная химиотерапией устойчивость рака к лечению ограничила его применение в качестве единственного выбора медицинского вмешательства. Применение моноклональных антител (mAbs) вводило усиленный ответ на лечение рака2. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом эксперимента наденьте средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат, перчатки и очки. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации о материалах, реагентах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе.
1. Буферы, необходимые для анализа
- Подготовьте буферы, необходимые для этого эксперимента — буфер SELEX, необходимый для складывания аптамера, блокирующий буфер (BB), буфер промывки (WB) и буфер связывания (BiB) (таблица 1) — в день эксперимента и держите их на льду или при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧА....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Важным аспектом открытия и разработки новых лекарств является обеспечение избирательности и специфичности препарата-кандидата. Это означает, что препарат-кандидат должен уметь различать разные клетки и влиять только на интересующую популяцию клеток (селективность). Селективность изучается с использованием клеточных линий, отличающихся с точки зрения экспрессии интересующего белка. В этом исследовании клеточные линии MDA-MB-231 и HEK 293T были выбраны в качестве EpCAM-положительных и отрицательных клеток. Специфичность яв.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Ключевой проблемой при разработке новых аптамеров является отсутствие стандартных руководящих принципов, которые применяются к различным этапам этого процесса. McKeague et al. недавно продемонстрировали некоторые из связанных с этим проблем, которые приводят к неясному представлению данных в публикациях и неспособности воспроизвести исследование. Они предложили фундаментальные руководящие принципы, необходимые для рассмотрения при характеристике аптамеров19. Анализ связывания аптамеров является кр.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Благодарности
Авторы признают финансирование Seed Института психического и физического здоровья и клинического перевода (IMPACT), программу «Стипендия Альфреда Дикина для постдокторских исследований» в Университете Дикина и «Стипендию Австралийской правительственной исследовательской учебной программы».
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с прикрепленной крышкой | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 мл CellStar синий завинчивающийся колпачок, коническая нижняя пробирка | Greiner Bio One | 188271 | |
| серологические пипетки объемом 5 мл | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Цитометр | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| Бычья сыворотка Альбумин (BSA), Лиофилизированный порошок | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| Bright-line Гемоцитометр | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco' s Модифицированная среда Eagle Medium (DMEM) Порошок с высоким содержанием глюкозы | Life Technologies | 12100046 | |
| Dulbecco' s Фосфатно-солевой буфер (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | Американская коллекция типовых культур | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 Инкубатор | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 лунка, F-дно (дымоход), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Фосфатно-солевые буферные таблетки (PBS) | Life Technologies | 18912014 | |
| Сверхчистая вода без пирогена и РНКазы | Milli-Q | ||
| T75 Колба для клеточных культур | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| Транспортная РНК (тРНК) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
Ссылки
- Cancer. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022).
- Liu, J. K. H. The history of monoclonal antibody development ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
