Методическая статья

Минимально инвазивная, точная и эффективная методика интратермической инъекции мышам

2.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64309

⸱

23 августа 2022 г.

 ,  ,  , 
1Department of Radiology, Hackensack University Medical Center, 2Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health, 3Department of Pediatrics, Hackensack University Medical Center, 4Department of Oncology, Georgetown University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Настоящий протокол описывает интервенционную радиологическую процедуру, установленную для внутриутимической инъекции мышам, чтобы избежать риска открытой операции и повысить точность слепых чрескожных инъекций.

Аннотация

Интратермическая инъекция в мышиные модели является важным методом изучения тимической и иммунной функции, включая генетические и приобретенные Т-клеточные расстройства. Для этого требуются методы прямого осаждения реагентов и/или клеток в тимус живых мышей. Традиционные методы интратимических инъекций включают торакальную хирургию или минимально инвазивные чрескожные слепые инъекции, оба из которых имеют значительные ограничения. Сверхвысокочастотные ультразвуковые устройства визуализации сделали возможными чрескожные инъекции с визуальным контролем у мышей, значительно повысив точность инъекций чрескожного инъекционного подхода и позволив впрыскивать меньшие мишени. Тем не менее, инъекции с визуальным управлением полагаются на использование интегрированной железнодорожной системы, что делает эту процедуру жесткой и трудоемкой. Здесь представлен уникальный, безопасный и эффективный метод чрескожных внутриутомных инъекций у мышей, исключающий зависимость от рельсовой системы для инъекций. Метод основан на использовании микрозвукового блока высокого разрешения для неинвазивного изображения тимуса мыши. Используя технику свободной руки, радиолог может поместить кончик иглы непосредственно в тимус мыши под сонографическим руководством. Мышей очищают и анестезируют перед визуализацией. Для опытного радиолога, специалиста по ультразвуковым процедурам, период обучения заявленной методике довольно короткий, как правило, в течение одного сеанса. Метод имеет низкий уровень заболеваемости и смертности для мышей и намного быстрее, чем современные методы механической помощи для чрескожной инъекции. Это позволяет исследователю эффективно выполнять точные и надежные чрескожные инъекции тимуса любого размера (включая очень маленькие органы, такие как тимус пожилых или иммунодефицитных мышей) с минимальной нагрузкой на животное. Этот метод позволяет при желании вводить отдельные доли и облегчает крупномасштабные эксперименты благодаря экономящему времени характеру процедуры.

Введение

Тимус играет важную роль в развитии Т-клеток и иммунитета. Дефицит Т-клеток, который может быть вызван инволюцией тимуса, генетическими нарушениями, инфекциями и лечением рака, среди других факторов, приводит к высокой смертности и заболеваемости 1,2. Мышиные модели незаменимы как в фундаментальных, так и в трансляционных иммунологических исследованиях и используются в течение десятилетий для изучения биологии тимуса и развития Т-клеток, а также для разработки методов лечения для тех, кто страдает от дисфункции тимуса и дефицита Т-клеток 3,4,5.

Центральной частью исследований тимуса была внутритиремическая инъекция биологических материалов, таких как клетки, гены или белки в мышиных моделях 6,7,8,9,10,11,12. Обычные методы интратимических инъекций используют торакотомию с последующей внутриутимической инъекцией под прямой визуализацией или «слепой» чрескожной инъекцией в средостение. Хирургический подход значительно увеличивает риск пневмоторакса, среди прочих. Кроме того, повышенный стресс во время этой операции приводит к иммуносупрессии, что потенциально ставит под угрозу иммунологические данные13. Опытные исследователи, после некоторой практики, могут выполнить технику слепой инъекции, но такой подход менее точен и, следовательно, ограничивает подопытных молодыми мышами с большим тимусом.

Использование ультразвукового наведения было введено в качестве точной и минимально инвазивной альтернативы традиционным интратермическим инъекционным подходам14. Однако эта процедура очень трудоемка при использовании интегрированной рельсовой системы вместо техники свободной руки. Выполнение инъекций с помощью инжекторного крепления требует тщательной оптимизации изображения и позиционирования датчика с помощью различных приспособлений, таких как стойка и крепление преобразователя, система позиционирования X, Y и Z, а также умелое управление микроманипуляторами и расширения рельсовой системы. Здесь представлена простая альтернативная методика, ультразвуковая инъекция тимуса, выполняемая рентгенологом с использованием подхода15 от руки, который является одновременно быстрой и точной минимально инвазивной альтернативой вышеописанным методам. Важно отметить, что нынешний подход может быть выполнен с любой системой ультразвуковой визуализации высокого разрешения без необходимости установки для инъекций и интегрированной рельсовой системы. Он особенно полезен для исследований, требующих инъекции большого числа мышей11, для экспериментов, включающих инъекцию обеих долей тимуса, или для точной инъекции небольших тимусов у пожилых, облученных или иммунокомпрометированных мышей12.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами по уходу за животными в Центре открытий и инноваций (протокол IACUC 290). Для настоящего исследования мыши C57BL/6 (самки, 4-6 недель), мыши C57BL/6 (самка, 6 месяцев), самки мышей J:NU, самки мышей NOD scid gamma (NSG) и B6; Мыши CAG-luc, -GFP использовались в качестве модели молодой мыши, модели стареющей мыши, атимической модели обнаженной натуры, иммунодефицитной модели и источника биолюминесцентных клеток соответственно. Мыши были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Эта процедура обычно требует двух человек (один должен оставаться стерильным во время выполнения инъекций, а другой - для обработки мышей).

1. Подготовка животных

  1. Индуцировать анестезию у мышей с использованием 3%-4% изофлуранового газа и поддерживать анестезию с использованием 1%-3% изофлуранового газа, вводимого через носовой конус и точно откалиброванный испаритель (см. Таблицу материалов).
  2. Подтвердите соответствующую анестезирующую глубину/бессознательность невосприимчивостью к защемлению задней лапы.
  3. Удалите мех из передней части грудной клетки мышей, нанеся тонкий слой крема для депиляции менее чем на 1 минуту. Используйте влажное бумажное полотенце, чтобы полностью удалить крем вместе с рыхлым мехом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение слишком большого количества крема приведет к воспалению кожи в области груди.
  4. Поместите по одной мыши за раз, лежа на спине, на нагретой платформе станции ультразвуковой визуализации мелких животных (см. Таблицу материалов) с носовым конусом на месте (рисунок 1).
  5. Закрепите мышь на сцене с помощью медицинской клейкой ленты на задней и передней конечностях (рисунок 1).
  6. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
  7. Продезинфицируйте кожу верхней части грудной клетки без меха с помощью аппликатора хлоргексидина глюконата (см. Таблицу материалов).

2. Подготовка ультразвукового аппарата и стерильного поля

  1. Активируйте самый высокочастотный линейный зонд, как правило, зонд с самым высоким пространственным разрешением для размера изображения животного. Активируйте зонд, нажав соответствующую кнопку после экрана запуска.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого применения с мышами используемый зонд разработан специально для использования с мышами и маленькими крысами (см. Таблицу материалов).
  2. Оптимизируйте настройки ультразвука для визуализации и инъекций, выполнив следующие действия.
    1. Отрегулируйте глубину поля зрения до размера, соответствующего целевому животному, отрегулировав вертикально ориентированные ползунки в правой части экрана (рисунок 2). Максимальная установка глубины обычно составляет около 6-8 мм для молодых мышей.
    2. Отрегулируйте усиление оттенков серого, переместив кнопку вдоль горизонтальной полосы в нижней части экрана (рисунок 2). Цель состоит в том, чтобы начать с изображения, которое немного темнее, чем типичный «серый» внешний вид.
    3. Отрегулируйте фокусную зону (синяя стрелка справа от экрана, рисунок 2) до ожидаемого уровня тимуса. Для молодых мышей это будет около 4 мм глубины.
    4. Если требуется захват изображения, проверьте функциональность кнопок «Сохранить изображение » и «Сохранить клип », чтобы убедиться, что изображения могут быть надлежащим образом сохранены на протяжении всей процедуры. Выполните это, нажав кнопку Save Clip (Сохранить клип) в правом нижнем углу экрана или нажав кнопку Freeze (Заморозить ), а затем нажав Save Image (рисунок 2).
  3. Нанесите небольшое количество (~1 мл) ультразвукового геля на поверхность преобразователя (см. Таблицу материалов), пока он находится в вертикальном положении, либо в держателе ультразвукового аппарата, либо в руках помощника.
  4. Подготовьте небольшое стерильное поле рядом с отапливаемой платформой. Оптимальное позиционирование для этого обычно находится между платформой и ультразвуковым аппаратом.
    1. Опорожните эти предметы на стерильное поле: стерильную крышку зонда, резинку, стерильные перчатки и стерильный ультразвуковой гель (см. Таблицу материалов).
    2. Установив стерильное поле и поставив предметы на место, наденьте стерильные перчатки.
    3. Осторожно поместите стерильную крышку зонда на ультразвуковой преобразователь (а также на гель, который изначально был помещен на зонд). Сохраняйте стерильность и прикасайтесь только к стерильному чехлу, больше ничего. Сдвиньте стерильную резинку на стерильную крышку зонда, чтобы удержать ее на месте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Воздушные очаги, независимо от размера, могут мешать ультразвуковой визуализации. Следовательно, важно наносить ультразвуковой гель между датчиком и стерильной крышкой зонда, а также поверх крышки зонда, чтобы обеспечить безвоздушный интерфейс между ультразвуковым зондом и животным.
    4. Поместите умеренное количество (2-3 мл) стерильного ультразвукового геля на датчик.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь пользователь готов к созданию изображения анестезированной мыши.

3. Визуализация и определение местоположения тимуса

  1. Сохраняя стерильность, поместите ультразвуковой гелеобразный зонд вертикально на продезинфицированную часть передней грудной стенки мыши для первоначальной визуализации.
    1. Найдите минутку, чтобы посмотреть на ультразвуковое изображение и оптимизировать его дальше. Вернитесь к шагу 2.2 и настройте его, чтобы получить внешний вид, аналогичный тому, который показан на рисунке 3.
  2. Сканируйте переднюю грудную клетку мыши в поперечной плоскости. Выполните это, удерживая датчик вертикально и перемещая его вверх и вниз от шеи к животу кистью или «размашистым» движением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сердце будет самой узнаваемой структурой в грудной клетке благодаря ее быстрому движению и «камерному» виду. Как только сердце локализовано, это может быть использовано в качестве ориентира для получения изображения тимуса.
  3. С сердцем, сосредоточенным в поле зрения, проведите датчик немного к шее. Просто превосходя сердце, тимус обычно встречается.
  4. Визуализируйте тимус как двулопастную, пирамидальную, гипоэховую («темную» или «черную», появляющуюся на экране) структуру, которая центрирована по средней линии, передней к аорте и задней части грудины (рисунок 3А).
  5. Обратите внимание на две круглые парные черные (то есть «гипоэхогенные») структуры по обе стороны верхней части груди.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это двусторонние venae cavae. Аорта представляет собой аналогичную криволинейную гипоэховую структуру в средней линии между двумя венами. Их легко узнать по пульсирующим движениям.

4. Инъекция тимуса

  1. При необходимости нанесите на датчик больше (2-3 мл) стерильного ультразвукового геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Относительно большое количество стерильного геля на преобразователе (по сравнению с размером грудной клетки мыши) будет действовать как «гелевая прокладка» вокруг грудной стенки мыши. Это уменьшит количество ультразвуковых артефактов, сделанных воздухом в поле зрения.
  2. Используя ультразвуковой зонд, найдите самую широкую часть тимуса, которая обычно является идеальным целевым местом для инъекции. Предугадывайте горизонтальную траекторию иглы в выбранном месте.
    1. Обратите внимание, где основные кровеносные сосуды (SVC и aorta) расположены в этом месте. Избегайте их во время инъекции.
    2. Кровеносные сосуды будут гипоэхогенными, пульсирующими структурами, как описано в шаге 3.7. Если вы не уверены, используйте цветовой доплеровский режим для проверки потока внутри сосудов (рисунок 4A). Активируйте цветовой доплеровский режим, нажав кнопку «Цвет» на экране.
    3. Если ожидается, что один из основных кровеносных сосудов (или сердце) будет находиться вдоль ожидаемой траектории иглы, выберите новую целевую область или найдите другой подход / траекторию.
  3. Держите датчик в одной руке и иглу инсулина 30 г (см. Таблицу материалов) с 10 мкл инъекционного введения в другой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция будет варьироваться в зависимости от экспериментальной конструкции. В настоящем исследовании использовали фосфатно-буферный физиологический раствор, трипан синий или D-люциферин (0,1 мкг/10 мкл).
  4. Чтобы начать процесс инъекции, переместите преобразователь в боковом направлении так, чтобы тимус находился вне центра в ультразвуковом поле зрения. Убедитесь, что другая сторона поля зрения состоит в основном из ультразвукового геля и ничего больше.
  5. Поместите кончик иглы в гель под датчик и медленно перемещайте иглу, пока она не будет визуализирована рядом с поверхностью кожи (рисунок 4B).
  6. При непрерывной визуализации иглы под ультразвуком вставьте иглу в вилочковую железу с чрескожной траекторией, вдали от кровеносных сосудов.
    1. Используйте горизонтальную траекторию «поперечного тимуса», чтобы поместить кончик иглы в глоток тимуса, противоположный месту входа. Это объясняет потенциальную утечку вдоль игольчатого тракта (рисунок 5А).
  7. Как только кончик иглы окажется внутри желаемой части тимуса, быстро введите содержимое (например, 10 мкл трипан-синего или D-люциферина, 0,1 мкг/10 мкл) из шприца 30 г с использованием сонографической визуализации.
    1. Чтобы стабилизировать шприц во время введения и инъекции иглы, держите шприц между большим и третьим пальцами и управляйте плунжером шприца указательным пальцем.
  8. Извлеките иглу после того, как все содержимое будет отложено.

5. Постинъекционный мониторинг животных

  1. Переведите животное в пустую клетку и наблюдайте, пока оно не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полное восстановление после анестезии ожидается в течение 2 минут.
  2. Наблюдайте за животным в течение дополнительных 10 минут на наличие признаков дистресса, затрудненного дыхания или кровотечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Боль после инъекции не ожидается, и, как правило, нет необходимости в послеинъекционной анальгезии.
  3. После полного выздоровления и после периода наблюдения после инъекции верните введенное животное в компанию других животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешная реализация этого метода зависит от нескольких ключевых шагов, которые необходимо выполнить. Во-первых, должна быть обеспечена достоверная идентификация самой вилочковой железы. У молодых мышей это просто из-за большого размера железы (рисунок 3A). У старых мышей или иммунодефицитных мышей это может быть более сложной задачей; тем не менее, это все еще очень осуществимо с современным ультразвуковым оборудованием (рисунок 3B, C). Во-вторы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ультразвуковая инъекция в свободную руку является высокоточным методом доставки учебных материалов к тимусу эффективным и асептическим способом. После первоначальной стерилизации кожи в месте инъекции стерильность сохраняется во время процедуры благодаря использованию стерильных перчаток, стерильных ультразвуковых зондовых чехлов и стерильного ультразвукового геля. В отличие от слепого чрескожного подхода10,17 или использования хирургических разрезов для прямой в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют каких-либо конфликтов интересов для раскрытия.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Раймонда Х. Торнтона за его проницательную и всестороннюю раннюю работу над этой техникой. Это исследование финансировалось грантовой поддержкой Национального института рака (NCI 1R37CA250661-01A1), Ассоциации исследований лейкемии у детей, Медицинской школы Hackensack Meridian и Фонда HUMC / Tackle Kids Cancer.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Aquasonic 100 Ультразвуковой гельParker Laboratories (Фэрфилд, Нью-Джерси, США)01-01Стерильный гель для ультразвуковой передачи
B6; CAG-luc, -GFP мышьЛаборатория Джексона (Бар Харбор, Массачусетс, США)025854Биолюминесцентный источник клеток
BD Инсулиновые шприцы с иглойBecton Dickinson (Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США)328431Ультратонкая игла - 12,7 мм, 30 г
C57BL/6 мышь - состареннаяThe Jackson Laboratory (Бар Харбор, Массачусетс, США)000664возраст 6 месяцев; состаренная модель
мышь C57BL/6 - молодаяЛаборатория Джексона (Бар Харбор, Массачусетс, США000664возраст 4-6 недель; молодая модель
Chloraprep One-step 0,67 млCareFusion (Эль-Пасо, Техас, США)260449аппликатор хлоргексидина глюконата
Curity Cotton Tiped ApplicatorCardinal Health (Дублин, Огайо, США)A5000-2Стерильный, 6"
D-LuciferinGold Biotechnology (Сент-Луис, Миссури, США)LUCK-1G
ИзофлуранHenry Schein (Мелвилл, Нью-Йорк, США)1182097
IVIS Lumina X5PerkinElmer (Мелвилл, Нью-Йорк, США)н/дБиолюминесцентная система визуализации in vivo
J:NU мышьThe Jackson Laboratory (Бар Харбор, Массачусетс, США)007850Атимическая обнаженная модель
Kendall Гипоаллергенная бумажная лентаCardinal Health (Дублин, Огайо, США)1914C
Kimtech Хирургические нитриловые перчаткиKimberly-Clark Professional (Ирвинг, Техас, США)56892Стерильные перчатки
Nair Hair Remover LotionChurch and Dwight (Трентон, Нью-Джерси, США)n/aДепиляторное средство
NOD scid gamma (NSG) мышьThe Jackson Laboratory (Бар Харбор, Массачусетс, США)005557Иммунодефицитная модель
Фосфатно-солевой буфер (PBS), 1xCorning (Corning, NY, США)21-040-
Puralube Vet OintmentMed Vet InternationalPH-PURALUBE-VETEye Omatment
Coatment Technologies (Morgan Hill, CA, США)10040Стерильные крышки ультразвукового зонда
Sure-Seal Induction ChamberBraintree Scientific (Braintree, MA, США)EZ-17 85Датчик индукционной камеры для анестезии
MX550DFUJIFILM VisualSonics ( Торонто, Онтарио, Канада)ДатчикVevo 3100 (25-55 МГц, Центр: 40 МГц)
Trypan Blue, 0,4% раствор в PBSMP Biomedicals (Солон, Огайо, США)91691049
Система визуализации Vevo 3100FUJIFILM VisualSonics (Торонто, Онтарио, Канада)Системаультразвуковой визуализации
Vevo 3100 Лабораторное программное обеспечениеFUJIFILM VisualSonics (Торонто, Онтарио, Канада)Версия 3.2.7 для визуализации и анализа
Vevo Compact Dual Anesthesia SystemFUJIFILM VisualSonics (Торонто, Онтарио, Канада)n/aНастольная анестезиологическая установка на основе изофлурана
Vevo Imaging StationFUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)/aПроцедурная платформа
года CV n

Ссылки

  1. Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. Changes in primary lymphoid organs with aging. Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).
  2. Gruver, A. L., Sempowski, G. D. Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy. Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).
  3. Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology. Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).
  4. Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: a review. Laboratory Animals Research. 38 (1), 18(2022).
  5. McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: What have we learned from mice. Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).
  6. Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
  7. Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line. Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).
  8. Schwarz, B. A., Bhandoola, A. Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential. Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).
  9. Marodon, G., et al. Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors. Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).
  10. Adjali, O., et al. In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer. Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).
  11. Tuckett, A. Z., et al. Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy. Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).
  12. Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency. Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 109(2017).
  13. Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. Surgery induced immunosuppression. Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).
  14. Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. An alternative method for intrathymic injections in mice. Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).
  15. Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).
  16. Küker, S., et al. The value of necropsy reports for animal health surveillance. BMC Veterinary Research. 14 (1), 191(2018).
  17. Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).
  18. Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
  19. de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. Refinement of intrathymic injection in mice. Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи