Методическая статья

Обнаружение целей на основе аптамеров, чему способствует 3-ступенчатая G-квадруплексная изотермическая реакция экспоненциального усиления

DOI:

10.3791/64342

⸱

6 октября 2022 г.

 ,  , 
1Aptagen LLC

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол демонстрирует использование быстрого 3-ступенчатого анализа экспоненциального усиления на основе аптамеров для обнаружения целей. Подготовка образцов, усиление сигнала и проявление цвета рассматриваются для реализации этой системы для распознавания присутствия теофиллина по сравнению с присутствием кофеина.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аптамеры представляют собой молекулы распознавания мишеней, которые связываются с высоким сродством и специфичностью. Эти характеристики могут быть использованы для управления другими молекулами, способными генерировать сигналы. Для системы, описанной в настоящем описании, распознавание мишени через аптамерный домен, Stem II модифицированного рибозима молоткоголового типа, активирует саморасщепляющийся рибозим путем стабилизации первоначально неструктурированной конструкции. Цис-расщепляющая РНК действует на стыке Stem III и Stem I, создавая два продукта расщепления. Более длинное произведение расщепления запускает изотермическую реакцию экспоненциального усиления (EXPAR) двух подобных каталитически активных G-квадруплексов. Эти результирующие продукты амплификации катализируют восстановление пероксидазы, которое связано с восстановлением колориметрического субстрата с выходом, который может быть обнаружен невооруженным глазом. Система, состоящая из 3 частей, описанная в настоящем исследовании, улучшает методы обнаружения, такие как иммуноферментные анализы (ИФА), производя визуально обнаруживаемый сигнал, указывающий на присутствие всего 0,5 мкМ теофиллина всего за 15 минут.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аптамеры обычно представляют собой одноцепочечную ДНК или РНК, отобранную в ходе эволюционного процесса с высоким сродством и специфичностью связывания с желаемыми мишенями1. В дополнение к связывающей способности, аптамеры могут быть связаны и управлять мотивами с функциями сигнала-вывода2,3, усиливая указанный сигнал и улучшая чувствительность системы. Система G-квадруплексной изотермической реакции экспоненциального усиления (GQ-EXPAR) представляет собой трехчастную систему (рис. 1), которая развивает визуальный сигнал при добавлении последовательных компонентов в один реакционный сосуд для получения визуального выхода4. Эта система позволяет обнаруживать конкретную мишень, в данном случае теофиллин, в данном образце в течение 15 минут, используя оптимизированный рабочий процесс, чтобы обеспечить быстрое и специфическое обнаружение интересующей цели. Этот метод следует рассматривать для образцов, где конкретное количественное определение целевой концентрации является меньшей проблемой, чем высокая специфичность ответа за короткий промежуток времени.

Аллостерический рибопереключатель, молекула РНК (рибозим), которая подвергается саморасщеплению, производит начальный сигнал. Эта конструкция основана на рибозиме-молотке с аптамерным доменом, введенным в Stem II в качестве регулятора активности расщепления. Его функция саморасщепления активируется, когда его аптамерный домен стабилизируется при связывании с мишенью5. В противном случае коммутатор неактивен в исходном состоянии.

Последующая реакция экспоненциальной амплификации (EXPAR) использует высвобождение саморасщепляющейся цепи РНК с первой стадии для запуска изотермической реакции амплификации6. Продукт амплификации EXPAR обладает пероксидазной активностью7, выступая в качестве основы для последней стадии системы. Когда некоторые субстраты окисляются в сочетании с распадом перекиси, они производят флуоресцентный выход, который можно измерить на различных приборах. Другие распространенные субстраты могут быть заменены для получения цветного продукта для визуального обнаружения. EXPAR и пероксидазная активность его продуктов амплификации действуют как 2-ступенчатый усилитель сигнала, повышая чувствительность к более высоким уровням по сравнению с традиционными стратегиями 7,8.

Обнаружение теофиллина по сравнению с кофеином используется в качестве примера специфичности этой платформы обнаружения, поскольку они различаются только одной метильной группой (рис. 2). Эта демонстрация системы дает колориметрический выход для визуального обнаружения теофиллина не менее 500 нМ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

См. Дополнительную таблицу 1 (таблица настройки реакции) для подготовки пробирки, включая конкретные объемы и концентрации компонентов реакции. В демонстрируемом здесь протоколе используется предварительно собранный комплект платформы обнаружения, как описано в таблице материалов. Все компоненты должны храниться на льду, если не указано иное.

1. Приготовление рибозима

ПРИМЕЧАНИЕ: Основным компонентом обнаружения является аллостерический (регулируемый аптамером) рибозим, распознающий теофиллин (см. Дополнительную таблицу 2).

  1. Соберите 5 ЕД Т4-полинуклеотидкиназы (0,5 мкл, см. Таблицу материалов) в ПЦР-пробирку, которая будет использоваться для активации продуктов расщепления рибозима.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот компонент добавляется первым, чтобы пользователь мог видеть правильное дозирование фермента.
  2. Добавьте 1 мкл предварительно подготовленного 5-кратного рибозимного буфера (см. Таблицу материалов) в каждую пробирку для образца (пробирку для ПЦР).
  3. В целях визуальной демонстрации специфичности добавьте 1,5 мкл 2 мМ теофиллина (мишень) или 2 мМ кофеина (контроль) (см. Таблицу материалов) в каждую пробирку для образца в качестве испытуемых образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для построения стандартной кривой рекомендуется начинать с 3,125 мМ аналита и тестировать пятикратные разведения до 0,001 мМ.
  4. Тщательно перемешайте каждую пробирку с образцом, пипетируя 5-10 раз.
  5. Добавьте 2 мкл 600 нМ РНК, содержащей аптамерный домен, специфичный для мишени (см. Таблицу материалов), в каждую пробирку с образцом, чтобы получить конечную концентрацию 240 нМ в 5 мкл тестового раствора, затем быстро перемешайте пипеткой и поместите на холодный блок, чтобы свести к минимуму фоновый сигнал.
    ПРИМЕЧАНИЕ: важно изначально подготовить все реакции без рибозима, так как реакция саморасщепления начнется сразу же, когда рибозим соединится с рибозимным буфером, и может привести к значительному фону.
  6. После того, как все реакционные пробирки подготовлены, инкубируйте каждый образец (5 мкл) при комнатной температуре (23 ° C) в течение ровно 3 минут с помощью таймера. Немедленно верните пробирки с образцами в лед (4 °C) после инкубации.

2. GQ-EXPAR

  1. Добавьте 3,5 мкл смеси фермента никаза-полимеразы (см. Таблицу материалов) в каждую пробирку для образца и хорошо перемешайте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемые концентрации ферментов зависят от последовательностей распознавания, типов ферментов и температур реакции, комбинация которых была определена эмпирически.
  2. Добавьте 31,5 мкл реакционной смеси EXPAR, содержащей матрицу, нуклеотиды и реакционный буфер (см. Таблицу материалов), в каждую пробирку для образца и пипетку для смешивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации компонентов оптимизируются на основе ферментов и последовательностей полимеразных продуктов.
  3. После того, как все образцы подготовлены, инкубируйте каждый подготовленный образец (40 мкл) при 55 ° C в течение ровно 5 минут с помощью таймера. Если есть возможность, инкубируйте на термоциклере, хотя нагретая крышка не нужна.
  4. Немедленно верните пробирки с образцом в лед (4 °C) после этапа инкубации.

3. Проявка цвета

  1. Добавьте 2 мкл раствора гемина (25 мкМ, см. Таблицу материалов) в каждую пробирку для образца и хорошо перемешайте.
  2. Добавьте 58 мкл коммерчески доступного раствора ТМБ (см. Таблицу материалов) в каждую пробирку для образца и хорошо перемешайте.
  3. Инкубируют реакцию развития цвета (100 мкл) при комнатной температуре в течение не менее 3 мин и до 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (Необязательно) Развитие цвета можно остановить, добавив 20 мкл 2 М серной кислоты.
  4. Качественно считайте образцы на глаз или количественно оцените результаты с помощью считывателя абсорбционных пластин на длине волны 450 нм, если реакции развития цвета остановлены с помощью серной кислоты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Платформа обнаружения, изображенная на рисунке 1 , преобразует распознавание аптамерных мишеней в визуально отчетливые различия между препаратами образца (мишенью и немишенью, рис. 2) за короткий промежуток времени. Аллостерический рибозим, идентифицированный Soukup et al.5 , послужил отправной точкой для создания менее шумной последовательности с реакцией на мишень по контрольным и отрицательным образцам. Оптимизированная конструкция был...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный здесь способ использует преимущества перехода между первоначально неупорядоченной вторичной структурой в аллостерическом рибозиме и дополнительной стабильностью, обеспечиваемой связыванием мишени с аптамерным доменом для активации цис-расщепляющего молоткоголового рибозима. Стабильность рибозима была скорректирована, чтобы свести к минимуму каталитическую активность в отсутствие мишени, позволяя связыванию мишени восстанавливать активную структуру. Кроме того, необходимо позаботиться о том, чтобы сбалансир...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ООО «Аптекен» производит и продает демонстрационный комплект GQ-EXPAR для тех, кто хочет непосредственно познакомиться с системой обнаружения на основе аптамеров.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано финансированием исследований и разработок от Aptagen LLC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3,3',5,5'-раствор тетраметилбензидина дигидрохлорида (TMB) с H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"PerkinElmerFOOD-1806-1000Реагент для проявления цвета. Сведите к минимуму воздействие света и атмосферы. Ранее номер по каталогу BIOO Scientific 1806.
Поставлялся в демонстрационном комплекте Apta-beacon в виде трубки 3-2.
5'- TCC CTC CCT CCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC CCC CCC CCA GA-Biotin-3'Integrated DNA Technologies (IDT)Специальнооптимизированный шаблон ДНК QtQ47 для EXPAR для производства G-квадруплекса, праймированного G-квадруплексом. Это используется для «экспоненциальной» части EXPAR, чтобы быстро увеличить количество ДНКфермента, используемого для развития цвета Шага 3. Шаблон включает в себя 3'-биотин для предотвращения непреднамеренного удлинения Bst 2.0 ДНК-полимеразой во время EXPAR.
Часть демонстрационного набора Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5'-GGG AAC UAU ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3'Integrated DNA Technologies (IDT)Пользовательскаяаллостерическая последовательность рибозима, распознающая теофиллин (саморасщепляющийся рибозим, регулируемый РНК-аптамерным доменом для теофиллина), модифицированная из Soukup et al.
Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632.
Поставляется в демонстрационном наборе Apta-beacon в виде пробирки 1-3.
5'-TCC CTC CCT CCC CCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3'Integrated DNA Technologies (IDT)Специальнооптимизированный шаблон ДНК P3tQ49 для EXPAR для производства G-квадруплекса, праймированного продуктом расщепления P3. Он используется на этапе 2 для перевода продукта расщепления в ДНКфермент, используемый для развития цвета на этапе 3. Шаблон включает в себя 3'-биотин для предотвращения непреднамеренного удлинения Bst 2.0 ДНК-полимеразой во время EXPAR.
Часть демонстрационного набора Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme BufferAptagen, LLCN/A5x состав: 600 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 150 мМ MgCl2, 25 mM DTT. Используется в шаге 1.
поставляется в демонстрационном комплекте Apta-beacon в виде трубки 1-4.
Демонстрационный набор Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Aptagen, LLCGQ-EXPAR-TMBДемонстрационный набор демонстрирует специфичность колориметрического анализа путем обнаружения сложных низкомолекулярных мишеней, теофиллина в сравнении с кофеином, которые отличаются только одной метильной группой.
Bst 2.0 ДНК-полимеразаNew England BiolabsM0537SИзотермическая амплификационная полимераза с активностью смещения цепи. Часть никезно-полимеразной смеси, приготовленной при 9,375 Ед/мкл.<бр/> Часть Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Буфер 3.1New England BiolabsB6003SVIALв сочетании с 2 мкл 10-кратного изотермического амплификационного буфера и 27,5 мкл воды, не содержащей нуклеаз, для получения 1,11-кратного буфера EXPAR в смеси EXPAR. Этот продукт заменяет ранее использованный B7203SVIAL, который был частью первоначальной разработки системы (тот же состав, за исключением нерекомбинантного BSA).
Часть демонстрационного комплекта Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Контрмишень Aptamer CaffeineSigma-AldrichC0750-100G(контроль), приготовленная из воды, не содержащей нуклеаз.
Поставляется в демонстрационном наборе Apta-beacon в виде пробирки 1-1.
dNTPsNew England BiolabsN0447SЧасть реакционной смеси EXPAR.
Часть демонстрационного набора Apta-beacon Tube 2-2.
Реакционная смесь EXPARAptagen, LLCN/A0,44 мМ дНТП, 0,38 мкм; M P3tQ49, 0,38 μ M QtQ47, 44,44 мМ Tris-HCl (pH 8,4), 63,5 мМ NaCl, 31,5 мМ KCl, 6,35 мМ MgCl2, 1,27 мМ MgSO4, 6,35 мМ (NH4)2SO4, 63,5 μ г/мл BSA, 0,0635 % Твин 20,<бр/> Входит в состав демонстрационного набора Apta-beacon Tube 2-2.
HeminSigma-AldrichH9039Ресуспендирован в ДМФА до конечной концентрации 25 мкМ.<бр/> Поставляется в демонстрационном комплекте Apta-beacon в виде трубки 3-1.
Изотермический амплификационный буферNew England BiolabsB0537SVIALв сочетании с 2 мкл 10x Buffer 3.1 и 27.5 &микро; Л воды, не содержащей нуклеаз, для производства 1,11x буфера EXPAR в смеси EXPAR Mix.
Часть демонстрационного набора Apta-beacon Tube 2-2.
MgCl2Amresco (VWR)E525-500MLКофактор рибозима Hammerhead, необходимый для саморасщепления.
Часть демонстрационного набора Apta-beacon Tube 1-3.
Термоамплификатор MJ PTC-100MJ Research, Inc.PTC-100для контроля температуры инкубации. Можно использовать любой амплификатор или горячий блок.
N, N-диметилформамид (DMF)Sigma-Aldrich227056-100MLИспользуется для ресуспендирования гемина и увеличения срока хранения в морозильной камере.
Часть демонстрационного набора Apta-beacon Tube 3-1.
Никаза-полимеразный миксАптаген, ОООН/НТ.БСТНБИ (9.375 ед./мкм; L) и Bst 2.0 ДНК-полимераза (0,5 ед/&м; l).
поставляется в демонстрационном комплекте Apta-beacon в виде трубки 2-1.
Nt.BstNBINew England BiolabsR0607SФермент Никинга для обеспечения непрерывной изотермической амплификации. Входит в состав никезо-полимеразной смеси, приготовленной в концентрации 0,5 ЕД/мкл<бр/> Входит в состав демонстрационного набора Apta-beacon Tube 2-1.
T4 Kinase BufferNew England BiolabsB0201SVIALБуфер для фермента, необходимого для удаления циклического фосфата.
Часть демонстрационного набора Apta-beacon Tube 1-4.
T4 полинуклеотидкиназаNew England BiolabsM0201SУдаляет циклический фосфат после расщепления, позволяя продукту расщепления начать реакцию изотермической амплификации.
Поставляется в демонстрационном наборе Apta-beacon в виде пробирок для ПЦР.
Tecan GENios FLTecanGenios-FL TWTПланшетный считыватель для измерения сигнала поглощения по результатам Шага 3.
ТеофиллинSigma-AldrichT1633-50GАптамерная мишень, приготовленная из воды, не содержащей нуклеаз.
Поставляется в демонстрационном наборе Apta-beacon в виде пробирки 1-2.
Tris-HClAmerican BioanalyticalAB14043-01000Aptamer binding buffer.
Часть демонстрационного набора Apta-beacon Tube 1-4.
Термоамплификатор

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  2. Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
  3. Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
  4. Liao, A. M., et al. A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy. Biochemistry. 57 (34), 5117-5126 (2018).
  5. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., Breaker, R. R. Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection. Journal of Molecular Biology. 298 (4), 623-632 (2000).
  6. Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
  7. Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening. Biochemistry. 48 (33), 7817-7823 (2009).
  8. Nie, J., et al. Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing. Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).
  9. Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
  10. Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

G

Похожие статьи