Методическая статья

Флуоресцентный прижизненный подход к визуализации для изучения индуцированной нагрузкой сигнальной динамики кальция в остеоцитах мышей

DOI:

10.3791/64366

⸱

24 февраля 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Sibley School of Mechanical and Aerospace Engineering, Cornell University, 3Department of Biomedical Engineering, The City College of New York, 4Department of Neuroscience, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Orthopaedic Surgery, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящей статье описывается применение прижизненной визуализации для наблюдения за механически индуцированной кальциевой сигнализацией встроенных остеоцитов in vivo в режиме реального времени в ответ на механическую нагрузку третьей плюсневой кости мыши на тканевом уровне.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Костная ткань чрезвычайно чувствительна к перепадам величины механической нагрузки. Остеоциты, дендритные клетки, образующие синцитий по всей кости, отвечают за механосенсорную функцию костной ткани. Исследования с использованием гистологии, математического моделирования, клеточных культур и культур костных органов ex vivo значительно продвинули понимание механобиологии остеоцитов. Тем не менее, фундаментальный вопрос о том, как остеоциты реагируют на механическую информацию и кодируют ее на молекулярном уровне in vivo , не совсем понятен. Внутриклеточные колебания концентрации кальция в остеоцитах представляют собой полезную мишень для изучения механизмов острой механотрансдукции костей. В данной работе мы представляем метод изучения механобиологии остеоцитов in vivo, сочетающий линию мышей с флуоресцентно генетически кодируемым индикатором кальция, экспрессируемым в остеоцитах, с системой загрузки и визуализации in vivo для прямого определения уровня кальция в остеоцитах во время нагрузки. Это достигается с помощью устройства с трехточечным изгибом, которое может доставлять четко определенные механические нагрузки на третью плюсневую кость живых мышей при одновременном мониторинге флуоресцентно показанных кальциевых реакций остеоцитов с помощью двухфотонной микроскопии. Этот метод позволяет напрямую in vivo наблюдать за сигнальными событиями кальция в остеоцитах в ответ на нагрузку всей кости и полезен в стремлении выявить механизмы механобиологии остеоцитов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Костный матрикс организован в соответствии с механическими требованиями 1,2 и может динамически изменяться с учетом изменяющихся механических требований 3,4,5. Основополагающая работа по механосенсорному механизму в кости была опубликована в виде моделирующей статьи около 30 лет назад 6,7,8, где было высказано предположение, что остеоциты, встроенные в костную ткань, вызывают механическую деформацию через движение жидкости в их локальной среде. Эта модель была проверена экспериментально в экспериментах in vitro и ex vivo, где было ясно показано, что остеоциты довольно механочувствительны 1,2,3,4,5,6 и также экспрессируют цитокины, которые управляют поведением костеобразующих остеобластов7 и остеокластов 8,9,10. 11,12.

Кальциевая сигнализация является вездесущим вторым посредником, который был установлен в качестве центральной фигуры и надежной экспериментальной мишени в механобиологии остеоцитов 13,14,15,16. Кальциевая сигнализация имеет преимущество в том, что она широко изучается в клеточной биологии17, а это означает, что многое известно о ее побочных эффектах и соответствующих флуоресцентных инструментах, доступных для экспериментального наблюдения. В анализах in vitro передача сигналов кальция использовалась в качестве средства идентификации механической активации остеоцитов и характеристики динамического сигнального поведения 5,18,19. Следует отметить, что наблюдение за передачей сигналов кальция в клеточной линии остеоцитов предоставило убедительные доказательства того, что активация жидкости в интегриновых соединениях вдоль клеточного процесса, вероятно, является основнойформой активации потока жидкости. Это исследование является одним из многих, которые демонстрируют полезность кальциевой сигнализации. Он надежно индуцируется механической активацией остеоцитов и, таким образом, служит мощной мишенью для исследования механобиологии остеоцитов.

Механотрансдукция остеоцитов in vivo сильно зависит от их непосредственного микроокружения. Матрикс-связывающие белки (например, протеогликаны, интегрины) обеспечивают функциональные прикрепления между мембранами остеоцитарных клеток в структуре, которая имеет решающее значение для активации жидкости в клетке21,22. Несмотря на то, что двумерный (2D) анализ in vitro полезен, он ограничен тем, что не включает в себя эти критически важные трехмерные (3D) особенности. Препараты ex vivo для передачи сигналов кальция остеоцитов с использованием конфокальной микроскопии пролили свет на то, как остеоциты реагируют, сохраняя окружающий матрикс нетронутым13,16. Тем не менее, считается, что удаление кровоснабжения из костей изменяет питательные вещества и динамику жидкости в лакуноканаликулярной системе. Исследование механобиологии остеоцитов требует исследования in vivo индуцированной нагрузкой передачи сигналов остеоцитов.

Исследование in vivo встроенных клеток в кости в значительной степени затруднено ограничениями традиционных методов визуализации, таких как светлое поле и конфокальная микроскопия. Остеоциты расположены в минерализованном матриксе23 , состоящем из гидроксиапатита, коллагена типа 1 и других неколлагеновых белков, которые ограничивают оптическую доступность24 и делают исследование in vivo технически сложным. Тем не менее, последние достижения в области нелинейной флуоресцентной визуализации и генетически кодируемых кальциевых репортеров дают возможность преодолеть эти проблемы.

В данной работе мы сообщаем о новом подходе, позволяющем визуализировать остеоциты in vivo для измерения передачи сигналов кальция с разрешением на клеточном уровне25. Это достигается за счет использования динамического флуоресцентного маркера с использованием генетически кодируемого индикатора кальция впервые в остеоцитах мыши. Мыши с DMP1-Cre-управляемой остеоцитами экспрессией GCaMP6f демонстрируют видимую флуоресценцию в остеоцитах по всей диафизарной коре плюсневых костей мышей 17,26. Мы используем трехточечную систему изгиба для приложения физиологических уровней величины деформации в диапазоне от 250 до 2 000 με27. Этот метод позволяет in vivo визуализировать динамику кальциевой сигнализации остеоцитов во время механической нагрузки на всю кость и может быть полезен всем, кто хочет понять механобиологию остеоцитов. Этот метод будет подходящим для исследователей, стремящихся расширить свою работу от анализа in vitro до приложений in vivo, особенно при сохранении функционального молекулярного анализа (т.е. изучения клеточной активности через передачу сигналов кальция) в отличие от широкомасштабных исследований фенотипирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Корнельском университете.

1. Подготовка материалов и оборудования

  1. Спроектируйте и изготовьте устройство для загрузки плюсневых костей для использования с накладным многофотонным микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о технических характеристиках компонентов и работе устройства описана в дополнительной документации к предыдущемуисследованию25. Вкратце, основные компоненты состоят из последовательного привода с тензодатчиком и нагрузочным кронштейном, водяной бани и штифта точки опоры. Привод и тензодатчик могут быть приобретены в продаже и должны выдерживать нагрузку до 300 g. Водяная баня, штифт опоры и нагрузочный кронштейн должны быть изготовлены из титана или нержавеющей стали. Они могут быть изготовлены на месте или коммерчески с помощью 3D-печати металлом.
  2. Заранее откалибруйте значения величины деформации в соответствии со смещением привода для отдельных групп мышей (т.е. пол, лечение, генотип). Это делается с использованием картирования поверхностной деформации в процедуре, описанной в предыдущем исследовании25.
  3. Используйте мышей с фоном C57BL/6 в возрасте 16-18 недель, которые экспрессируют флуоресцентные конструкции индикатора кальция в остеоцитах. Целевая экспрессия остеоцитов достигается путем скрещивания активированных флоксом мышей GCaMP6f и Dmp1-Cre. Детали стратегий разведения и поставщиков мышей-основателей описаны в ранее опубликованном исследовании25.
  4. Стерилизуйте все хирургические инструменты, загрузочный кронштейн, водяную баню и штифт с помощью автоклава (57,2 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, 3-4 минуты). Продезинфицируйте объективы микроскопа 100% этанолом.
  5. Включите электронные компоненты, включая лазерный источник, микроскоп, тензодатчик и привод. Дайте 15-20 минут, чтобы каждый компонент прогрелся перед прижизненной визуализацией.
    1. Убедитесь, что привод и компоненты тензодатчика подключены и активированы в устройстве управления. Создавайте управляющее программное обеспечение с помощью различных платформ, включая Matlab, LabView и Python, в соответствии с предпочтениями пользователя. Основной код Matlab, используемый в этом исследовании, называется Actuator_Control_Software_withLoadCell.m (в папке Supplementary File 1 Software.zip MT3 Loading Device Control).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство коммерчески доступных двухфотонных микроскопов поставляются с надежным программным обеспечением для визуализации. Ключевыми особенностями, необходимыми для этого метода, являются возможность настройки лазера на соответствующее возбуждение для GCaMP6f (920 нм), возможность регулировки интенсивности мощности лазера и сбор временных рядов с частотой не менее 6 Гц. Перед началом эксперимента необходимо подтвердить подключение лазера к программному обеспечению для визуализации и соответствующее расположение светового тракта для двухфотонной визуализации. Это подтверждается по-разному в зависимости от настройки изображения. Как правило, есть световой индикатор.

2. Хирургия

  1. Подготовьте операционный этап и простерилизуйте поверхность с помощью 70% этанола. Убедитесь, что асептические методы используются на протяжении всех хирургических процедур. Поддерживайте уровень чистоты, необходимый для этого протокола, так как это терминальная процедура.
  2. Обезболивайте мышь испаренным изофлураном, смешанным с воздухом или кислородом медицинского назначения со скоростью потока 1 л/мин. Первичную анестезию проводят в индукционной камере грызунов с 3%-5% изофлураном. Поддерживайте анестезию на уровне 1%-2,5% изофлурана в носовом конусе для хирургических и прижизненных процедур визуализации.
  3. Поместите нагревательное устройство под мышью или рядом с ней, чтобы поддерживать гомеостатическую температуру тела. Следите за температурой тела мыши, частотой сердечных сокращений и насыщением кислородом на протяжении всей операции. Поддерживайте частоту дыхания в пределах 60-80 вдохов в минуту и поддерживайте ее, регулируя дозировку изофлурана.
  4. Поместите мышь в положение лежа на спине. Подтвердите глубину анестезии перед разрезом, зажав палец ноги. Определите расположение между второй и третьей плюсневыми костями. Сделайте скальпельный разрез через дерму между второй и третьей плюсневыми костями, начиная с дистального конца и продвигаясь проксимально по длине костей (~5 мм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плюсневые кости находятся дистальнее костей лодыжки на лапе и следуют прямо проксимальнее дистальных фаланг. Они состоят из (медиальной и латеральной) плюсневых костей I, II, III, IV и V. Третья плюсневая кость расположена в центре ладонной стороны задней лапы.
  5. С помощью щипцов откройте операционное место, подтягивая кожу к медиальному/латеральному краям. Резецируйте сухожилия разгибателей с помощью прямых ножниц Ваннаса, чтобы обнажить третью плюсневую кость.
  6. Вставьте центральный штифт точки опоры устройства для загрузки плюсневых костей под третью плюсневую кость.
    1. Первоначально вставьте штифт в небольшое пространство на дистальном конце, где третья плюсневая кость встречается с проксимальной фалангой, а затем переместите штифт проксимально, пока он не упрется в середину ствола третьей плюсневой кости.
    2. Обратите особое внимание на то, чтобы гарантировать прямое соприкосновение между костью и штифтом, исключая любые мышцы и лицевую поверхность. Это имеет решающее значение для стабильной визуализации во время протоколов загрузки.
  7. Удерживайте лодыжку щипцами и поместите стопу в водяную баню, наполненную фосфатно-солевым буфером (DPBS) Дульбекко (8-10 мл). Закрепите лапу на месте с помощью загрузочного кронштейна и подсоедините кронштейн к приводу/тензодатчику. Завершенная хирургическая подготовка и расположение внутри устройства показаны на рисунке 1.

3. Визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Полная двухфотонная микроскопическая установка, используемая в этом протоколе, включает два пакета программного обеспечения: Chameleon Discovery GUI V2.0.6 для лазера (рисунок 2) и ThorImageLS4.0 для микроскопа (рисунок 3). Чтобы получить изображение на двухфотонном экране, нажмите кнопку Live (рис. 3, синяя кнопка воспроизведения). При проведении эксперимента по созданию изображений и сохранению данных нажмите кнопку Capture (рисунок 3, вкладка вверху, рядом с Capture Setup). Они специфичны для оборудования и поставщиков, используемых в этом эксперименте, но многие альтернативы с необходимыми спецификациями, найденными в этом протоколе (длины волн возбуждения, размер видимого окна, скорость захвата изображения и т. д.), также могут подойти.

  1. Очень аккуратно поднимите настройку загрузочного устройства с помощью мыши и поместите ее на платформу микроскопа.
  2. Начните с объектива с малым увеличением в режиме эпифлуоресценции (рис. 3, выпадающее меню вверху с выборами «Мультифотон» или «Настройка флуоресценции»), чтобы найти и центрировать среднюю часть диафиза кости.
  3. После того, как интересующая область будет найдена, переключитесь на большее увеличение объектива с погружением в воду (20x-40x) и переключите оптику на двухфотонную (рис. 3, выпадающее меню вверху с выборами Multiphoton или Fluorescence Setup).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый размер поля зрения составляет не менее 250 мкм x 250 мкм для клеточной активности и может быть достигнут с помощью оптического или цифрового зума в зависимости от системы визуализации.
    1. Подходящая минимальная плотность пикселей составляет 512 x 512 пикселей. Чтобы задать плотность пикселей, используйте настройки Galvo/Resonance Area Control (Рисунок 3).
    2. При определении ROI избегайте фотообесцвечивания, уменьшив мощность с помощью опции Power Control (Рисунок 3) и увеличив усиление PMT в настройках Galvo/Resonance Scanner Control (Рисунок 3).
    3. Определите поверхность кости в двухфотонном режиме, найдя автофлуоресценцию фиброзной надкостницы в зеленом канале, в котором используется полосовой фильтр с центром 525 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Автофлуоресценция наиболее заметна при длине волны возбуждения на длине волны 1000 нм, но также доступна при возбуждении 920 нм (рис. 3, Управление многофотонным лазером). Этот ориентир важен для определения относительной глубины ROI в кору плюсневых костей при наблюдении за остеоцитами. Следует отметить, что во время экспериментов с временными рядами точная глубина изображенной плоскости не регистрируется, хотя она имеет тенденцию колебаться в пределах 15-30 мкм. Если требуется точное измерение глубины, то необходимо сделать z-стек.
  4. Проведите тестовый нагрузочный бой, чтобы убедиться, что хирургическая подготовка и позиционирование внутри нагрузочного устройства эффективны для достижения стабильного поля ROI (т. е. без смещения z-плоскости). Вкратце, запустите цикл нагрузки, чтобы оценить стабильность хирургического препарата. Выполните загрузку, запустив раздел Switch on Servo и Move в коде Matlab.
    1. Приложите небольшую тарную нагрузку. Убедитесь, что соответствующие протоколы нагрузки на волны гаверсинуса подготовлены заранее. Введите соответствующие параметры нагрузки, полученные при калибровке, в разделе 1.2. Выполните загрузку, запустив раздел Switch on Servo и Move в коде Matlab.
    2. Если на экране есть видимое движение клеток, которое происходит в результате микродвижения кости в ответ на нагрузку или дыхание, выберите другой ROI вдоль направления y или z, чтобы убедиться, что он находится прямо над центральным штифтом точки опоры. Если движение не прекращается, отрегулируйте хирургическое положение штифта вручную под третьей плюсневой костью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая область интереса (ROI) — это та, в которой ячейки не перемещаются внутрь и из плоскости/фокуса. Движение по осям X и Y можно настроить для постобработки с помощью плагина сопоставления шаблонов в ImageJ.
  5. Проведение визуализации z-stack или t-серии с нагрузкой в соответствии с экспериментальным дизайном для регистрации морфометрических или динамических сигнальных событий, вызванных нагрузкой, соответственно.
    1. Установите длину волны возбуждения для флуоресцентного индикатора (например, 920 нм для GCaMP6f). Для z-стека используйте достаточно низкое разрешение, чтобы захватить особенности остеоцитов, такие как шаг 0,25-1 мкм. Для серии t используйте настройки для выборки как минимум в 6 раз больше скорости загрузки. При скорости загрузки 1 Гц изображение с частотой 6 кадров в секунду (FPS) представляет собой минимально подходящую скорость захвата (рис. 3, Управление гальво/резонансным сканером).
    2. Для загрузки и визуализации в реальном времени собирайте незагруженные исходные данные после каждого боя. В данном исследовании предпочтение отдается 60 с визуализации без нагрузки с последующей нагрузкой и визуализацией в течение 60 с. Разработайте соответствующие протоколы загрузки и визуализации. Чтобы собрать данные, нажмите кнопку Capture (рисунок 3, вкладка вверху, рядом с Capture Setup).
      1. Рефрактерный период для полного сигнального ответа кальция в костных клетках оценивается примерно в 15 минут28 минут. Подождите как минимум столько времени между последовательными загрузками при сборе данных динамической сигнализации.
      2. На протяжении всего эксперимента не оставляйте животное без присмотра, чтобы оно неожиданно не проснулось от наркоза или не испытало дистресс без возможности вмешательства.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эвтаназия в конце процедуры должна быть выполнена путем вывиха шейки матки или других соответствующих мер в соответствии с методами, одобренными IACUC. Это протокол, не связанный с выживанием, что означает, что все животные усыпляются после визуализации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье мы представляем методологию изучения кальциевой сигнализации во встроенных остеоцитах in vivo с использованием острой хирургической подготовки и многофотонной флуоресцентной визуализации. Зеленый флуоресцентный сигнал можно наблюдать по генетически закодированным показателям кальция в остеоцитах через экспрессию DMP1-Cre. На рисунке 4 представлено изображение встроенных остеоцитов в одной плоскости. Обратите внимание, что все клетки помечены и выражают базов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальное изучение остеоцитов затруднено из-за их встроенного положения в матриксе твердых тканей, до которого они быстро разрушаются или дедифференцируются при удалении этой ниши. Исследование остеоцитов потребовало огромной изобретательности в течение последних трех десятилетий, таких как создание остеоцитоподобных линий29,30,31, создание протоколов для выделения первичных остеоцитов

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#3 Ручка скальпеляЭлектронная микроскопия Науки72040-03Хирургические принадлежности
20x Цель погружения в водуOlympusXLUMPLFLN20XWЭто цель 20x, но 40x также можно использовать для этого протокола. Мы рекомендуем погружение в воду, потому что ее необходимо погружать в ванну во время визуализации, поэтому объектив под открытым небом может вызвать аберрации
A.M. Bickford Omnicon F/AIRAM Bickford80120Разумное решение проблем с газами для анестезии в операционной, фильтр для анестезии F/AIR был специально разработан для удаления отработанных газов анестезии, таких как изофлуран, Халотан, Энфлуран и т.д. из операционной комнаты.
A.M. Bickford Omnicon F/AIR Kit AM Bickford80000Полный комплект с трубкой и адаптерами для подключения F/AIR к установке
B6J. Cg-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/MwarJЛаборатория Джексона28865GCaMP6f мышей для скрещивания с мышами Dmp1-Cre
B6N. FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJЛаборатория Джексона23047Dmp1-Cre мышей для скрещивания с мышами GCaMP6f 
Компрессионный тензодатчикFUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.905898LCM100 , 1000 g , Субминиатюрный тензодатчик растяжения и сжатия (миниатюрный/с линейной резьбой) , RoHS без свинца, Материал - 17-4 PH S.S. , M3x0.5-резьба , 34 Awg 4-жильный плетеный полиэфирный кабель, 5 футов Long
Corning 500 мл DPBS (фосфатный буферный раствор Дульбекко), 1x [+] кальций, магнийVWR International21-030-CVИонно-сбалансированная ванна, содержащая кальций, погружает плюсневую кость во время визуализации
Стоматологический инструментЭлектронная микроскопия НаукиХирургические принадлежности
Этиловый спирт чистый 200-градусный реактив ACS >99,5%Sigma AldrichSIAL-459844-500MLСтерилизация
Точка опорыFathomN/AИзготовлен путем прямого 3D-лазерного спекания нержавеющей стали (сплав PH1) из файлов 3D SolidWorks STL. Первоначальным поставщиком был GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, в настоящее время приобретенная компанией FATHOM, спецификации представлены в ранее опубликованном документе
Высокое разрешение и скорость выходного комплекта USB220FUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.717435Используется для подключения тензодатчика к ноутбуку
ImageJ 1.53t с Java 1.8.0_172 (для Windows 64-bit)NIHN/AУстановите здесь https://imagej.nih.gov/ij/
IsofluranePiramal Critical Care66794-013-25100% ингаляционная жидкость для паровой жидкости
Загрузочный кронштейнFathomN/AИзготовлен методом прямого 3D лазерного спекания нержавеющей стали (сплав PH1) из файлов 3D SolidWorks STL. Первоначальным поставщиком был GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, в настоящее время приобретенная FATHOM, спецификации представлены в ранее опубликованном документе
MATLAB R2019aMathWorksДля запуска загрузочного устройства
Matrx VIP 3000 испаритель хорошо заполняет изофлуранButler Schein Animal Health14309Испаритель для анестетика
Нонин пульсоксиметр модель 2500A Vet2500A Vet
Piezo servo контроллерPI-СШАE-625Электронный компонент рекомендован компанией для использования с приводом
PiezoMove Высокожесткий линейный пьезоприводPI-СШАP-602.5SLПривод для заряжающего устройства
Скальпельные лезвия, No10 для ручки No3, упаковка 100Электронная микроскопия Sciences72044-10Хирургические принадлежности
Пинцет из нержавеющей стали с острыми, тонкими наконечниками. Длина: 120 ммЭлектронная микроскопия Науки78326-42Хирургические принадлежности
Thorlabs Bergamo многофотонный микроскопThorLabsN/AЭто только система визуализации и не имеет в комплекте лазера, хотя у ThorLabs есть варианты лазеров при желании
Титан-сапфировый хамелеон Discovery NX с Total Power Control (TPC)КогерентныйН/ДТехнически эта система имеет два лазера, как перестраиваемый, так и неподвижный. Однако для протокола нужен только настраиваемый. 
Пружинные ножницы Vannas - режущая кромка 4 ммFine Science Tools15018-10Хирургические принадлежности
Водяная баняFathomN/AИзготовлены путем прямого 3D лазерного спекания нержавеющей стали (сплав PH1) из файлов 3D SolidWorks STL. Первоначальным поставщиком был GPI Prototype & Компания Manufacturing Services, Inc, в настоящее время приобретенная FATHOM, спецификации представлены в ранее опубликованном документе

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, X. L., Huo, B., Park, M., Guo, X. E. Calcium response in osteocytic networks under steady and oscillatory fluid. Bone. 51 (3), 466-473 (2012).
  2. Wu, D., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. Matrix-dependent adhesion mediates network responses to physiological stimulation of the osteocyte cell process. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12096-12101 (2013).
  3. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Fluid flow in the osteocyte mechanical environment: A fluid-structure interaction approach. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (1), 85-97 (2013).
  4. Genetos, D. C., Kephart, C. J., Zhang, Y., Yellowley, C. E., Donahue, H. J. Oscillating fluid flow activation of gap junction hemichannels induces atp release from MLO-Y4 osteocytes. Journal of Cellular Physiology. 212 (1), 207-214 (2007).
  5. Lu, X. L., Huo, B., Chiang, V., Guo, X. E. Osteocytic network is more responsive in calcium signaling than osteoblastic network under fluid flow. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (3), 563-574 (2012).
  6. Schaffler, M. B., Kennedy, O. D. Osteocyte signaling in bone. Current Osteoporosis Reports. 10 (2), 118-125 (2012).
  7. Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/ -Catenin signaling is required for normal bone homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
  8. Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
  9. Kennedy, O. D., et al. Activation of resorption in fatigue-loaded bone involves both apoptosis and active pro-osteoclastogenic signaling by distinct osteocyte populations. Bone. 50 (5), 1115-1122 (2012).
  10. Rawlinson, S. C. F., Wheeler-Jones, C. P. D., Lanyon, L. E. Arachidonic acid for loading induced prostacyclin and prostaglandin E2 release from osteoblasts and osteocytes is derived from the activities of different forms of phospholipase A2. Bone. 27 (2), 241-247 (2000).
  11. David, V., et al. Ex vivo bone formation in bovine trabecular bone cultured in a dynamic 3D bioreactor is enhanced by compressive mechanical strain. Tissue Engineering Part A. 14 (1), 117-126 (2008).
  12. Davies, C. M., et al. Mechanically loaded ex vivo bone culture system "Zetos": systems and culture preparation. European Cell & Materials. 11, 57-75 (2006).
  13. Adachi, T., et al. Osteocyte calcium signaling response to bone matrix deformation. Journal of Biomechanics. 42 (15), 2507-2512 (2009).
  14. Huo, B., Lu, X. L., Guo, X. E. Intercellular calcium wave propagation in linear and circuit-like bone cell networks. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 368 (1912), 617-633 (2010).
  15. Morrell, A. E., et al. Mechanically induced Ca2+ oscillations in osteocytes release extracellular vesicles and enhance bone formation. Bone Research. 6, 6(2018).
  16. Jing, D., et al. In situ intracellular calcium oscillations in osteocytes in intact mouse long bones under dynamic mechanical loading. FASEB Journal. 28 (4), 1582-1592 (2014).
  17. Chen, T. -W., Wardill, T. J., Sun, Y., Pulver, S. R., Renninger, S. L. Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  18. Jacobs, C. R., Temiyasathit, S., Castillo, A. B. Osteocyte mechanobiology and pericellular mechanics. Annual Review of Biomedical Engineering. 12, 369-400 (2010).
  19. Jing, D., et al. Spatiotemporal properties of intracellular calcium signaling in osteocytic and osteoblastic cell networks under fluid. Bone. 53 (2), 531-540 (2013).
  20. Thi, M. M., Suadicani, S. O., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. Mechanosensory responses of osteocytes to physiological forces occur along processes and not cell body and require αVβ3 integrin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21012-21017 (2013).
  21. Wang, Y., McNamara, L. M., Schaffler, M. B., Weinbaum, S. A model for the role of integrins in flow induced mechanotransduction in osteyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15941-15946 (2007).
  22. McNamara, L. M., Majeska, R. J., Weinbaum, S., Friedrich, V., Schaffler, M. B. Attachment of osteocyte cell processes to the bone matrix. The Anatomical Record. 292 (3), 355-363 (2009).
  23. Franz-Odendaal, T. A., Hall, B. K., Witten, P. E. Buried alive: How osteoblasts become osteocytes. Developmental Dynamics. 235 (1), 176-190 (2005).
  24. Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
  25. Lewis, K. J., et al. Osteocyte calcium signals encode strain magnitude and loading frequency in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11775-11780 (2017).
  26. Lu, Y., et al. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. Journal of Dental Research. 86 (4), 320-325 (2007).
  27. Rubin, C. T., Lanyon, L. E. Dynamic strain similarity in vertebrates; an alternative to allometric limb bone scaling. Journal of Theoretical Biology. 107 (2), 321-327 (1984).
  28. Jacobs, C. R., et al. Differential effect of steady versus oscillating flow on bone cells. Journal of Biomechanics. 31 (11), 969-976 (1998).
  29. Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
  30. Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
  31. Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
  32. vander Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. Journal of Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).
  33. Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
  34. Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vivo

Похожие статьи