Высокопроизводительный метод скрининга интегрин-ингибирующих препаратов на основе проточной цитометрии

Summary

Этот протокол описывает высокопроизводительный скрининговый метод на основе проточной цитометрии для выявления низкомолекулярных препаратов, которые ингибируют активацию β2-интегрина на нейтрофилах человека.

Abstract

Этот протокол направлен на создание метода идентификации низкомолекулярных антагонистов активации β2-интегрина с использованием антител, сообщающих о конформационных изменениях, и высокопроизводительной проточной цитометрии. Этот метод также может служить руководством для других высокопроизводительных методов скрининга на основе антител. β2-интегрины — это лейкоцит-специфические молекулы адгезии, которые имеют решающее значение в иммунных реакциях. Нейтрофилы полагаются на активацию интегрина для выхода из кровотока не только для борьбы с инфекциями, но и для участия во многих воспалительных заболеваниях. Контроль активации β2-интегрина представляет собой жизнеспособный подход к лечению воспалительных заболеваний, ассоциированных с нейтрофилами. В этом протоколе моноклональное антитело mAb24, которое специфически связывается с высокоаффинным головным мозгом β2-интегринов, используется для количественной оценки активации β2-интегрина на изолированных первичных нейтрофилах человека. N-формилметионил-лейцилфенилаланин (fMLP) используется в качестве стимула для активации нейтрофильных β2-интегринов. В данном исследовании был использован высокопроизводительный проточный цитометр, способный автоматически обрабатывать 384-луночные планшетные пробы. Влияние 320 химических веществ на ингибирование β2-интегрина оценивают в течение 3 ч. С помощью этого подхода можно идентифицировать молекулы, которые непосредственно нацелены на β2-интегрины или молекулы-мишени в сигнальном пути активации интегрина, инициируемого рецептором G-белка.

Introduction

Многие воспалительные заболевания характеризуются инфильтрацией нейтрофилов в месте отека^{или травмы1}. Чтобы проникнуть в эти ткани, нейтрофилы должны завершить каскад рекрутирования нейтрофилов, который включает остановку эндотелия, экстравазацию через стенку сосуда и рекрутирование в ткань². Циркулирующие нейтрофилы нуждаются в активации β2-интегрина, чтобы завершить этот каскад, особенно для фазы ареста. Таким образом, интегрин-ингибирующие препараты, которые снижают адгезию, экстравазацию и рекрутирование нейтрофилов, могут эффективно лечить воспалительные заболевания ^3,4.

β2-интегрины и раньше использовались для лечения воспалительных заболеваний. Для лечения псориаза⁵ типа было разработано моноклональное антитело Efalizumab, непосредственно нацеленное на интегрин αLβ2. Однако эфализумаб был отменен из-за его летального побочного эффекта - прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопатии, возникающей в результате реактивации вируса ЮК ^6,7. Новые противовоспалительные препараты на основе интегрина должны учитывать сохранение противоинфекционных функций лейкоцитов для минимизации побочных эффектов. Побочные эффекты эфализумаба могут быть связаны с длительной циркуляцией моноклональных антител в кровотоке, которые могут подавлять иммунные функции в долгосрочной перспективе⁸. Недавнее исследование показывает, что эфализумаб опосредует сшивание αLβ2 и нежелательную интернализацию интегринов α4, обеспечивая альтернативное объяснение^{побочных эффектов}. Таким образом, короткоживущие низкомолекулярные антагонисты могут избежать этой проблемы.

Представлен высокопроизводительный метод скрининга низкомолекулярных антагонистов β2-интегрина с использованием нейтрофилов человека. Активация β2-интегрина требует конформационных изменений эктодомена интегрина, чтобы получить доступ к лиганду и увеличить его сродство к связыванию. В канонической модели выкидного ножа изогнуто-замкнутый эктодомен интегрина сначала расширяется до расширенно-замкнутой конформации, а затем открывает свой головной состав до полностью активированной расширенно-открытой конформации^10,11,12,13. Существует также альтернативный путь, который начинается от согнутого-закрытого к согнутому-открытому и расширенному-открытому, в конечном итоге 14,15,16,17,18,19. Конформационно-специфическое антитело mAb24 связывается с эпитопом в β2-I-подобном домене человека, когда головной убор эктодомена открыт^20,21,22,23.

Здесь mAb24-APC используется для определения того, активированы ли интегрины β2. Для активации нейтрофилов и интегрина в качестве стимула в этом протоколе используется N-формилметионил-лейцил-фенилаланин (fMLP), короткий хемотаксический пептид бактериального происхождения, который может активировать нейтрофилы β2 интегрины²⁴. Когда fMLP связывается с Fpr1 на нейтрофилах, активируются нисходящие сигнальные каскады, включающие G-белки, фосфолипазу Cβ и фосфоинозитид-3-киназную γ. Эти сигнальные события в конечном итоге приводят к активации интегрина через сигнальный путь^18,25. Помимо низкомолекулярных антагонистов, которые непосредственно связываются с β2-интегринами и предотвращают конформационные изменения активации интегрина²⁶, с помощью этого метода также могут быть обнаружены соединения, которые могут ингибировать компоненты сигнального пути активации β2-интегрина изнутри-наружу. Автоматизированные проточные цитометры обеспечивают высокопроизводительный скрининг. Идентификация новых антагонистов может не только углубить наше понимание физиологии интегрина, но и дать трансляционное представление о противовоспалительной терапии на основе интегрина.

Protocol

Гепаринизированные образцы цельной крови были получены от обезличенных здоровых доноров после получения информированного согласия, одобренного Институциональным наблюдательным советом UConn Health в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. Информированное согласие было получено от всех доноров. Критерии включения/исключения в данное исследование были тщательно разработаны для обеспечения пригодности участников и минимизации потенциальных рисков. К участию допускались участники в возрасте от 18 до 65 лет, любой этнической принадлежности, свободно владеющие английским языком и способные дать информированное согласие. Среди исключенных участников были те, кто не мог предоставить информированное согласие для себя, например, те, кому требуется законный представитель, лица моложе 18 лет или старше 65 лет, лица, находящиеся в заключении, и беременные женщины. Кроме того, участники должны были быть свободны от использования противовоспалительных препаратов и воспалительных заболеваний. Текущие инфекции или продолжающиеся хронические или острые воспалительные заболевания также были критериями исключения. Наконец, лица с текущим или недавним анамнезом инфекции COVID-19 не соответствовали критериям для участия в исследовании. Эти критерии были разработаны для обеспечения безопасности и пригодности участников, а также для минимизации потенциальных искажающих факторов, которые могут повлиять на результаты исследования.

1. Приготовление реагентов

1. Нейтрофильная среда: Приготовьте нейтрофильную среду, добавив 2% сывороточного альбумина человека к RPMI-1640 без фенольного красного (см. таблицу материалов).
2. Раствор fMLP: Приготовьте раствор fMLP, разбавив его в 100 раз из 10 мМ раствора для хранения диметилсульфоксида (DMSO) (см. Таблицу материалов) RPMI 1640 без фенольного красного, в результате чего получится 100 мкМ раствор fMLP.
3. Раствор антител: Развести 120 мкл аллофикоцианина (APC)-конъюгированного моноклонального антитела mAb24 (mAb24-APC) (см. таблицу материалов), в котором сообщается о высокоаффинной конформации β2-интегрина, в 10 мл нейтрофильной среды, создав раствор mAb24-APC в концентрации 1,2 мкг/мл.
4. Библиотека соединений: Разбавьте исходную библиотеку соединений концентрацией от 10 мМ до 1 мМ, добавив 5 мкл из библиотеки 10 мМ (см. таблицу материалов) к 45 мкл ДМСО в 384-луночных планшетах с помощью манипулятора жидкостью. Затем переносят 5 мкл на лунку из библиотеки соединений объемом 1 мМ на пустую 384-луночную пластину с помощью манипулятора жидкостью.
5. Как показано на рисунке 1, четыре столбца (1, 2, 23, 24) содержали только ДМСО, но не содержали соединений, что служило положительным и отрицательным контролем в скрининге. Далее разбавляют каждую лунку, добавляя 45 мкл RPMI-1640 без фенольного красного, в результате чего конечная концентрация составляет 100 мкМ для всех соединений.

2. Выделение нейтрофилов из крови человека

1. С помощью серологической пипетки осторожно нанесите 4 мл крови на 8 мл имеющейся в продаже среды с градиентом плотности (см. таблицу материалов) в центрифужную пробирку объемом 15 мл (Рисунок 2A).
2. Центрифугируют кровь при 550 × г в течение 30-50 мин при 20 °С. Постепенно замедляйте ротор (коэффициент замедления 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное отделение нейтрофилов (полоса 2 на рисунке 2B) от эритроцитов может варьироваться у разных доноров. Для большинства доноров достаточно 30-минутного центрифугирования. Однако некоторым донорам может потребоваться дополнительное центрифугирование в течение 10-30 минут, если разделение не увенчалось успехом (рис. 2C).
3. Осторожно удалите плазму (желтая жидкость сверху) и мононуклеарные клетки (верхняя мутная полоса; PBMC на рисунке 2B) с помощью пипетки объемом 1 мл.
4. Соберите нейтрофилы из нижней мутной полосы (полоса нейтрофилов на рисунке 2B) и примерно на 3-4 мл ниже прозрачной жидкости в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Аккуратно перемешайте суспензию нейтрофилов, перевернув ее 2-3 раза.
5. Центрифугу суспензии при 400 × г в течение 10 мин при 20 °С, а затем осторожно удаляют надосадочную жидкость путем сцеживания.
6. Осторожно ресуспендируйте гранулу с 5 мл PBS и центрифугируйте ее при 300 × г в течение 5 минут при 20 °C.
7. Удалите надосадочную жидкость путем декантации и осторожно удалите остатки надосадочной жидкости вокруг устья трубки и на стенках трубки с помощью вакуумного отсасывания. Ресуспендировать гранулу в 1 мл нейтрофильной среды.
8. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. Как правило, от 1 до 4 × 10⁷ нейтрофилов получали из 8 мл крови человека.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В суспензии нейтрофилов может быть загрязнение эритроцитами. Эритроциты не оказывают существенного влияния на большинство анализов и могут препятствовать активации/праймингу нейтрофилов²⁷. Эритроциты необходимо лизировать перед подсчетом, чтобы получить точную концентрацию нейтрофилов. Добавьте 10 мкл клеточной суспензии к 891 мкл деионизированной воды в течение 10-30 с для лизиса эритроцитов, затем добавьте 99 мкл 10× PBS, чтобы сбалансировать осмотическое давление, предотвращая лизис нейтрофилов.
9. Отрегулируйте плотность клеток до 6,25 × 10,5 клеток/мл, добавив нейтрофильную среду.

3. Подготовка 384-луночной пластины

1. В центрифужной пробирке объемом 1,5 мл соедините 1 мл раствора антител (1,2 мкг/мл mAb24-APC) с 0,2 мл нейтрофильной среды для получения раствора mAb24-APC объемом 1 мкг/мл. Затем добавьте 25 мкл этой смеси к отрицательным контрольным лункам в 384-луночной планшете (синие лунки на рисунке 1).
2. В центрифужной пробирке объемом 15 мл смешают 9 мл раствора антител с 21,6 мкл раствора fMLP (100 мкМ) и 1,7784 мл среды нейтрофилов для получения раствора, содержащего 1 мкг/мл mAb24-APC и 200 нМ fMLP. Затем добавьте 25 мкл этой смеси к положительным контрольным и испытательным лункам в 384-луночном планшете (красная и синяя лунки на рисунке 1).
3. Перенесите 5 мкл 100 мкМ растворов соединений с библиотечной планшета на 384-луночный планшет с помощью многоканальной пипетки.
4. Центрифугируют жидкость в течение 1 мин при температуре 500 × г при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для центрифугирования плит требуется ротор с поворотным ковшом и ковши с пластинами.

4. Обработка клеток

1. Добавьте 20 мкл суспензии нейтрофилов в каждую лунку с помощью 16-канальной пипетки (диапазон 5-50 мкл, для каждой колонки 384-луночного планшета). Аккуратно перемешайте 5–10 раз с помощью пипетки, соблюдая постоянный интервал времени между каждым пипетированием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конечные концентрации в лунках следующие: нейтрофилы 2,5 × 10,5 кл/мл (все лунки); mAb24-APC 0,5 мкг/мл (все лунки); fMLP 100 нМ (положительные контрольные и испытательные скважины); соединения 10 мкМ (испытательные лунки).
2. Инкубируйте планшет в шейкере при 300 об/мин, при комнатной температуре (RT), в течение 10 мин.
3. Зафиксируйте ячейки, добавив 3 мкл 16% параформальдегида (PFA) в каждую лунку с помощью 16-канальной пипетки (конечная концентрация PFA ~0,91%). Затем инкубируйте на льду в течение 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется поддерживать постоянный интервал времени между различными колонками при добавлении нейтрофилов и PFA. Это гарантирует, что нейтрофилы в каждой лунке будут иметь одинаковое время инкубации с fMLP и mAb24-APC.

5. Проточная цитометрия

1. Включите проточный цитометр (см. Таблицу материалов) и убедитесь, что компьютер, подключенный к прибору, также включен.
2. Убедитесь, что контейнер для жидкости в оболочке заполнен, а контейнер для отходов пуст и правильно подключен к инструменту.
3. Загрузите 384-луночный планшет в загрузчик образцов проточного цитометра. Убедитесь, что углубление A1 пластины совмещено с меткой A1 на погрузчике.
4. Откройте программу и создайте новый эксперимент. Выберите 384 скважины и выберите нужные флуорофоры. Затем нажмите « Настройка пластины», перетащите ее, чтобы выбрать все лунки, а затем нажмите « Образец». Включите переключатель «Высокая пропускная способность» и выберите « Высокая » под панелью «Скорость».
   1. В поле громкости введите 50. Выберите образцы в нечетных столбцах, а затем активируйте переключатель «Перемешивание». Наконец, назовите образцы на правой панели.
5. Нажмите на Участок и ворота. Затем нажмите кнопку «Применить » (две стрелки на зеленом круге), а затем нажмите кнопку воспроизведения (в форме треугольника). Подождите несколько секунд, чтобы понаблюдать за некоторыми ячейками из первой лунки, а затем нажмите на кнопку паузы .
   1. Отрегулируйте напряжения FSC и SSC, чтобы обеспечить надлежащую визуализацию ячеек на графике. Нажмите « Сбор», а затем нажмите кнопку воспроизведения (треугольная форма), чтобы начать анализ.
6. Проточный цитометр последовательно отбирает ~50 мкл 1000-3000 нейтрофилов из каждой лунки. Для завершения работы всей 384-луночной плиты потребуется примерно 3 часа.
7. После завершения всех примеров экспортируйте файлы .fcs для следующего шага.

6. Анализ данных

1. Откройте программное обеспечение для анализа данных проточной цитометрии (см. Таблицу материалов). Выберите и перетащите папку, содержащую все файлы .fcs, в окно программного обеспечения, затем отпустите, чтобы импортировать данные в программное обеспечение.
2. Дважды щелкните по одному образцу, затворите одиночные нейтрофилы на основе FSC и SSC^28,29,30 во всплывающем окне^, как показано на рисунке 3. Выберите строки с защитой и перетащите их в папку, а затем отпустите, чтобы применить стробирование ко всем образцам в этой папке.
3. Рассчитайте и экспортируйте медианную интенсивность флуоресценции (MFI) нейтрофилов из каждой лунки с помощью функции редактора таблиц программного обеспечения. Нажмите « Добавить столбец » на вкладке «Редактировать ». Выберите Медиана на вкладке Статистика , выберите нейтрофилы закрытой популяции и выберите APC в качестве параметра. Нажмите на кнопку ОК .
4. Вернитесь на вкладку «Редактор таблицы», выберите «Все выборки » во вкладке «Группа» и нажмите кнопку «Создать таблицу ». Появится новое окно, отображающее созданную таблицу. Сохраните его в виде текста, CSV или файла Excel.
5. Откройте экспортированную таблицу, рассчитайте среднее значение и стандартное отклонение МФО АСУ для положительной и отрицательной контрольных выборок (рис. 4).
6. Рассчитайте Z'-фактор (Z') пластины, используя уравнение:
   Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μ_p - μ_n),
   где σ p и σ n — стандартные отклонения положительного и отрицательного контроля соответственно, а μ_p и μ_n — средние значения положительного и отрицательного контроля, соответственно³¹.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Z'-фактор указывает на разделение положительного и отрицательного распределений управления. Z', равное 0, означает отсутствие разделения, в то время как Z', равное 0,5, указывает на равное разделение. Как упоминалось в предыдущем исследовании³¹, Z' > 0,5 указывает на отличный анализ для скрининга соединений. Z' в диапазоне от 0,5 до 0 является приемлемым, но он может выявить только сильные попадания в анализ, что потребует дальнейшей проверки во вторичных анализах.
7. Рассматривайте соединения как «попадания» для скрининга, когда МФО АПК нейтрофилов, обработанных соединением, более чем в три раза превышает стандартное отклонение положительного контрольного МФИ, вычитаемого из положительного контрольного МФИ (P = 0,0013, представлено пунктирной линией на рисунке 4).

Results

Данные репрезентативного скрининга 384-луночных планшетов (рис. 4) показали, что отрицательный контроль имел MFI mAb24-APC 3236 ± 110, в то время как положительный контроль имел MFI mAb24-APC 7588 ± 858. Z'-фактор для этой пластины составляет приблизительно 0,33, что находится в допустимом диапазоне³¹. Тем не менее, Z' требует дополнительной валидации во вторичных анализах.

Чтобы нормализовать данные, все значения были масштабированы таким образом, чтобы присвоить максимальное значение 1 положительному среднему и минимальное значение 0 отрицательному среднему. Z'-фактор будет проходить более строгую валидацию во вторичных анализах. Пороговое значение для этой пластины установлено на уровне 0,41, что означает, что образцы с относительным MFI ниже 0,41 будут рассматриваться как удары, ингибирующие fMLP-индуцированную активацию β2-интегрина в нейтрофилах человека. Попаданий с этой пластины не выявлено.

Для подтверждения эффективности протокола использовали Nexinhib20, который ингибирует активацию β2-интегрина антагонизирующей функцией Rac-1, и лифитеграст, который антагонизирует интегрин αLβ2 непосредственно^32,33. Тем не менее, время инкубации было скорректировано до одного часа для Nexinhib20 и получаса для лифитеграста. Полученные данные этих экспериментов были нормализованы с помощью того же метода масштабирования, что и выше. Затем эти данные были объединены с результатами, полученными на планшетах, и проанализированы в совокупности (рис. 4).

Иллюстрация 1: Схема расположения пластин для комплексного просеивания. Принципиальная схема, иллюстрирующая расположение просеивающих соединений и элементов управления в 384-луночном планшете. Отрицательные контрольные скважины изображены синим цветом (столбцы 1 и 23), а положительные – красным (столбцы 2 и 24). Испытательные скважины представлены бежевым цветом (графы с 3 по 22). Стрелками указана последовательность считывания таблички. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Разделение нейтрофилов с использованием среды градиента плотности. Репрезентативные фотографии, демонстрирующие успешное и неудачное разделение нейтрофилов с использованием градиентной среды плотности. (А) Первоначально 4 мл крови наносится на 8 мл среды с градиентом плотности. (Б) После центрифугирования должны быть видны две мутные полосы: верхняя полоса, содержащая в основном мононуклеарные клетки периферической крови (МПКМ), и нижняя полоса, содержащая в основном нейтрофилы с некоторым количеством эритроцитов (эритроцитов). Большинство эритроцитов находятся на дне. (C) Неудачное разделение, при котором эритроциты не гранулируются и полоса нейтрофилов не наблюдается. Для отделения нейтрофильной ленты потребуется дополнительное центрифугирование (10-30 мин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Стробирование нейтрофилов с использованием графиков FSC/SSC. Репрезентативные графики прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC), иллюстрирующие стратегию стробирования для идентификации нейтрофилов. (A) Нейтрофилы стробируются на основе площади прямого рассеяния (FSC-A) и бокового рассеяния (SSC-A), регистрируемого проточным цитометром. (B) Одиночные ячейки дополнительно стробируются на основе ширины (FSC-W) и высоты (FSC-H) прямого рассеяния, и (C) ширины (SSC-W) и высоты (SSC-H) бокового рассеяния. Цветовая шкала представляет плотность клеток, переходя от красного к желтому, зеленому и синему по мере уменьшения плотности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Результаты скрининга в репрезентативной 384-луночной планшете. Результаты скрининга получены с помощью репрезентативной 384-луночной планшета, демонстрирующей Z'-фактор 0,3. Отрицательный и положительный контроль обозначаются синими и красными точками соответственно. Испытуемые образцы, обработанные различными составами, представлены в виде бежевых точек. Пунктирная линия представляет собой отсечку средней интенсивности флуоресценции (MFI) для идентификации попаданий. Ни одно из исследованных соединений не было идентифицировано как антагонисты β2-интегрина, так как все испытуемые соединения показали значения MFI выше линии отсечения. Результаты независимых экспериментов по тестированию известных антагонистов β2-интегрина с различным временем инкубации (Нексинингиб20 в течение 1 ч, лифитеграст в течение получаса) объединены для представления на этом рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Начало и окончание стимуляции и окрашивания нейтрофилов определяется добавлением нейтрофилов и фиксирующего ПФА. Поэтому очень важно обеспечить одинаковый интервал времени между пипетированием нейтрофилов или PFA в каждую колонку. Это гарантирует, что время стимуляции и окрашивания нейтрофилов из каждой лунки остается постоянным. Из-за короткого срока жизни нейтрофилов весь эксперимент, от забора крови у доноров до завершения проточной цитометрии, должен проводиться в один день. Нейтрофилы очень чувствительны к изменениям температуры и могут активироваться при воздействии быстрого повышения температуры, например, при переходе от 4 °C к комнатной температуре или от комнатной температуры к 37 °C. Кроме того, основываясь на нашем предыдущем опыте, fMLP-индуцированная активация интегрина нейтрофилов β2 не происходит при хранении клеток на льду или при температуре 4 °C (данные не показаны). Поэтому перед фиксацией цельную кровь и нейтрофилы следует держать при комнатной температуре или 20 °С (на этапе выделения центрифугирования). Не кладите цельную кровь и нейтрофилы на лед.

Окрашивание mAb24 в отрицательных контрольных группах должно давать очень низкие результаты. Если в эксперименте наблюдается высокий уровень окрашивания mAb24, проверьте следующее: (1) было ли значительное изменение температуры во время эксперимента перед фиксацией; (2) наличие контаминации fMLP или эндотоксинами в среде нейтрофилов; (3) было ли обращение с образцами слишком агрессивным, например, образование пузырьков во время пипетирования и смешивания.

Текущий протокол использует mAb24 для сообщения об открытии интегрин-головного устройства β2. Теоретически моноклональное антитело KIM127, сообщающее о расширении β2-интегринов 34,35^, может быть использовано в сочетании с mAb24 для комплексной оценки конформации β2-интегрина. Однако отношение сигнал/шум при окрашивании KIM127 (от 1,5 до 2 раз) не столь благоприятно, как у mAb24 (от 5 до 10 раз), что, как правило, не обеспечивает удовлетворительного Z'-фактора при анализе на 384-луночном планшете. При анализе на 96-луночных планшетах образцы могут быть промыты перед выполнением проточной цитометрии, что снижает количество растворимых фоновых сигналов, полученных из антител. Таким образом, анализ на основе KIM127 может быть проведен на 96-луночном планшетном анализе, который имеет меньшую пропускную способность по сравнению с 384-луночным планшетным анализом.

Поскольку этот метод использует интенсивность флуоресценции в качестве считывания для оценки интегринового ингибирующего действия лекарств, некоторые флуоресцентные препараты могут влиять на результаты. Кроме того, токсичные препараты, которые вызывают гибель нейтрофилов в течение 10-минутного периода стимуляции, также сообщают об ингибировании интегрина. Препараты, ингибирующие дегрануляцию нейтрофилов, подавляют общую экспрессию β2-интегрина. Эти ингибиторы дегрануляции также будут выявлены в ходе нашего скрининга. Поэтому необходим вторичный скрининг с другими контрольными группами для подтверждения ингибирующих эффектов попаданий. Вторичные экраны используются как средство проверки и определения механизма действия обращений. В дополнение к повторению тестов mAb24 будет оцениваться общая экспрессия CD18 на поверхности клетки с помощью пан-антител к CD18. Уровень активированного β2-интегрина, измеренный по мAb24, будет нормализован по общей экспрессии CD18. Это позволит нам определить, включает ли механизм действия препарата антагонизацию активации интегрина и/или ингибирование экспрессии CD18 на поверхности клетки. Анализ жизнеспособности также должен быть проведен на вторичном скрининге, чтобы исключить любые токсические эффекты ударов.

Этот протокол имеет ограничения. Во-первых, mAb24 способен обнаруживать β2 I-подобный домен только в тех случаях, когда интегрин находится в высокоаффинном состоянии. Таким образом, он не может идентифицировать α/β I-подобных аллостерических антагонистов, таких как лифитеграст, путем снижения связывания mAb24. Лифитеграст индуцирует больше связывания мАт24³² и показывает аномально повышенное значение MFI с мАт24 (рис. 4). Для таких аномальных значений могут потребоваться другие анализы, чтобы проверить, являются ли эти удары α/β I-подобными аллостерическими антагонистами, такими как лифитеграст. Во-вторых, Z'-фактор для этого анализа является неоптимальным и потенциально может быть улучшен за счет использования автоматического пипетирования и перемешивания. К сожалению, в нашей лаборатории отсутствует необходимое оборудование для проверки этой гипотезы. Дублирование или утроение анализов будет полезно для выявления ложноположительных и отрицательных результатов в случае, если Z'-фактор не может быть дополнительно улучшен с помощью описанных выше методов. Кроме того, может быть полезно увеличить инкубационный период для выявления большего количества попаданий, как это наблюдается в случае с известным ингибитором активации интегрина β2 Nexinhib20, которому требуется час инкубации для получения ингибирующего эффекта. Это исследование было сосредоточено на выявлении быстродействующих агентов. Исследователи должны отметить, что они могут изменять время инкубации в соответствии со своими конкретными потребностями.

Насколько нам известно, это первый высокопроизводительный метод скрининга антагонистов β2-интегрина. Этот подход может быть использован для идентификации низкомолекулярных соединений, которые непосредственно связываются с β2-интегринами и предотвращают конформационные изменения, приводящие к промежуточным/высокоаффинным состояниям интегринов, подобно антагонистам без «агонистических» свойств, недавно описанным для интегринов αIIbβ3 и α4β1²⁶. Нейтрофилы имеют решающее значение при многих воспалительных заболеваниях, таких как ишемически-реперфузионное повреждение миокарда 36, сепсис³⁷ и аутоиммунные заболевания^38,39. Низкомолекулярные препараты могут обеспечить большую гибкость в лечении этих заболеваний по сравнению с препаратами на основе антител. Просмотры с нашего экрана могут обеспечить потенциальное лечение воспалительных заболеваний.

В настоящее время метод представляет собой высокопроизводительный скрининг на основе флуоресцентных антител. Поскольку активационные репортерные антитела также доступны для β1 40,41,42,43,44, αIIbβ3 45,46 и αL интегринов^47,48,49,50, этот метод может быть расширен до выявления антагонистов для других интегринов. Конформационно-чувствительное антитело, такое как HUTS-21, которое связывается с гибридным доменом β1 51,52,53, было использовано в высокопроизводительном скрининге для идентификации аллостерических антагонистов очень позднего антигена-4 (VLA-4^, интегрин α4β1) ⁵⁴. Существующий метод скрининга также может быть модифицирован и расширен для поиска препаратов, которые ингибируют или стимулируют экспрессию других поверхностных рецепторов, таких как соединения, которые увеличивают поверхностную экспрессию трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза (CFTR) на клетках муковисцидоза (CF). При муковисцидозе множественные мутации приводят к неправильному сворачиванию CFTR, что приводит к отсутствию экспрессии CFTR на клеточной мембране⁵⁵. Было показано, что низкомолекулярные препараты восстанавливают экспрессию CFTR⁵⁶. Для модификации протокола необходимо увеличить время инкубации препаратов до нескольких часов, чтобы дать возможность произойти изменениям экспрессии белка.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16-канальные пипетки	Thermo	4661090N	Instrument
384-луночный планшет	Greiner	784201	Материалы
APC античеловеческие CD11a/CD18 (LFA-1) Антитела Клон: m24	BioLegend	363410	Реагенты
Bravo  Автоматизированная платформа для работы с жидкостями	Agilent	16050-102	384 многоканальная
центрифуга	Eppendorf	Модель 5810R
Instrument FlowJo	Becton, Dickinson & Компания	NA	Software
Раствор альбумина в сыворотке крови человека (25%)	GeminiBio	800-120	Реагенты
Lifitegrast	Thermofisher	50-208-2121	Реактивы
Nexinhib20	Tocris	6089	Реактивы
N-formyl-met-Leu-Phe (fMLP)	Sigma	F3506	Реактивы
Параформальдегид 16% раствор	Электронная микроскопия Sciences	15710
Реактивы Пластина Ведра	Eppendorf	UL155	Вспомогательная
пластина шейкер	Fisher	88-861-023	Instrument
PolymorphPrep	PROGEN	1895 (предыдущее 1114683)	Реагенты
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)	Prestwick Chemical Libraries	Ver19_384	1520 малых молекул, 98% одобренных на рынке одобренных лекарств (одобрено FDA, EMA, JAN и другими агентствами)
RPMI 1640 Medium, без фенола красного	Gibco	11-835-030	Реагенты
Ротор с поворотным ковшом	Eppendorf	A-4-62	Роторный
клеток ZE5	Bio-Rad Laboratories	Модель ZE5	Instrument