$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Процедуры написаны в соответствии с национальными стандартами по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Научного центра здравоохранения Университета Теннесси (UTHSC).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поросята в экспериментальной группе подвергаются перевязке и пункции слепой кишки, в то время как фиктивная группа подвергается только вскрытию брюшка без перевязки слепой кишки или пункции. Поросят в обеих группах держат под наркозом в течение 12 часов после процедуры, чтобы дать достаточно времени для сепсиса и острого повреждения почек (ОКИ) в экспериментальной группе. Трансдермальное измерение СКФ будет проводиться через 8 ч после процедуры в общей сложности 12 ч.
1. Снабжение и содержание поросят
- Определите местную свиноферму, которая может обеспечить неонатальных поросят в возрасте 3-5 дней. Запланируйте роды в начале недели, чтобы завершить эксперименты до того, как поросят станут старше 7 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поставщик предоставил от трех до пяти поросят по понедельникам для этого эксперимента; к пятнице поросята должны были пройти эксперимент. Использование того же пола и близкого к схожему возрасту имеет важное значение, чтобы избежать смешанных факторов.
- По прибытии поросенка убедитесь, что у него есть индивидуальная идентификация (например, ушная бирка и запись, которая включает вес и возраст).
- Разместите поросят в лабораторном отделении по уходу за животными (LACU) под присмотром лицензированного ветеринара. Животные размещаются группой в просторном загоне с твердым бетонным полом, который легко мыть водой для поддержания хорошей санитарии.
- Добавьте предмет мебели, такой как тяжелый шар, чтобы обеспечить обогащение и стимуляцию окружающей среды.
- Убедитесь, что LACU обеспечивает оптимальные условия окружающей среды, включая следующие ключевые элементы: санитария, питание, контроль температуры, вентиляция и цикл день-ночь путем управления освещением.
- Попросите ветеринара ежедневно проверять поросенка, включая измерение веса, чтобы сообщить исследователю, если какой-либо поросенок окажется больным, что может потребовать исключения из эксперимента.
- Оставьте поросят как минимум на 1 день, чтобы акклиматизироваться к окружающей среде, что помогает минимизировать стресс.
2. Предоперационная подготовка
- Подготовьте хирургическую станцию перед началом эксперимента. Это включает в себя грелку, катетеры, вентилятор, эндотрахеальную трубку, гепаринизированный физиологический раствор и мешок с жидкостью лактата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поросята имеют плохую терморегуляторную емкость и склонны к переохлаждению, которое изменяет гемодинамику22,23. Поэтому важно дать достаточно времени для прогрева грелки.
- Приготовьте 10 мг/мл α-хлоралозы, смешав ее с физиологическим раствором при 60 °C до тех пор, пока смесь не станет прозрачной. Не перегревайте раствор, чтобы избежать кристаллизации лекарства при охлаждении. Фильтровать шприцевым фильтром (размер 0,22 мкм) перед введением поросят.
- Составляйте обезболивающий препарат на основе веса животного - кетамин: 20 мг/кг и ксилазин: 2,2 мг/кг. Используйте α хлоралозу (5 мл/кг) для поддержания анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: α-хлоралоза используется из-за простоты внутривенного введения по сравнению с ингаляционным
анестетики, поскольку последние требуют анестезирующей машины и соответствующей системы очистки, которые должны быть доставлены через эндотрахеальную трубку.
3. Анестезия
- Выполните индукцию анестезии в загоне для свиней, среде, знакомой для поросят, чтобы избежать чрезмерного стресса.
- Осторожно подберите поросенка за задние ноги и введите кетамин: 20 мг / кг и ксилазин: 2,2 мг / кг в заднюю ногу в полумембранозной / полутендинозной мышце, используя иглу 23 г 3/4.
- Дайте несколько минут, чтобы лекарства вступили в силу. Проверьте адекватный уровень анестезии, убедившись, что животное достаточно расслаблено, чтобы быть неподвижным, с потерей пальпебрального рефлекса и тонуса челюсти, чтобы обеспечить легкость и безопасную транспортировку на хирургическую станцию. Оцените пальпебральный рефлекс, коснувшись внутреннего уголка глаза; отсутствие моргания свидетельствует об адекватной анестезии.
4. Трахеостомия
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот эксперимент не является выживаемым, поэтому трахеотомия выполняется для установления дыхательных путей для механической вентиляции. Трахеостомия является быстрой и простой процедурой, в отличие от эндотрахеальной интубации, которая является сложной задачей у поросят, учитывая их анатомию головы и верхних дыхательных путей24,25. Кроме того, ларингоспазм обычно сообщается во время интубации, что приводит к длительному периоду гипоксии и гиперкарбии, которые могутпоставить под угрозу результаты 26.
- Расположите поросенка в спинном лежачем состоянии. Определите крикотиреоидный хрящ, пальпируя протуберанец щитовидного хряща, который чувствует себя твердым. Стерилизуют область, используя повидон-йод и 70% этанол перед нанесением стерильной драпировки.
- Используя хирургический клинок, сделайте 2-3 см вентральный разрез средней линии, уступающий каудальному концу щитовидного хряща.
- Используя изогнутый гемостат комара, тупо рассекают вышележащие подкожные ткани и мышцы (sternohyoideus и кожную палочку) до тех пор, пока не визуализируются крикотиреоидная оболочка и первые несколько колец трахеи. При рассечении будьте осторожны, чтобы избежать повреждения кровеносных сосудов.
- Получите четкое представление о крикотиреоидной мембране и трахеальных кольцах24, затем используйте пару длинных миксеров под прямым углом щипцов для поднятия структур.
- С помощью небольших ножниц сделайте небольшой разрез на крикотиреоидной мембране или первом трахеальном кольце. Вытяните разрез горизонтально до ~0,5 см, чтобы пройти эндотрахеальную трубку толщиной 3,0 мм.
- Вставьте трубку на отметку 5 см. Обеспечьте двустороннее расширение грудной клетки и звуки дыхания перед закреплением трубки.
- Пропустите пуповинную ленту вокруг трахеи, чтобы закрепить ее на месте. Дополнительная лента используется для крепления трубки к основанию челюсти.
- Включите вентилятор, подключите эндотрахеальную трубку и сверните определенные ручки (например. Ручки SIMV, ручки PEEP и т. Д.), Чтобы выбрать следующие базовые настройки. Режим контроля давления: синхронизированная прерывистая механическая вентиляция (SIMV); пиковое давление вдоха (ПИП) - 15; положительное давление конечного выдоха (PEEP) - 5; Ставка - 20; I-время - 0,6. После первого анализа газов крови отрегулируйте настройки вентилятора в соответствии с результатами анализа газов крови с целью поддержания адекватной оксигенации и вентиляции.
5. Канюляция бедренного сосуда
- Установите дыхательные пути и вентиляцию, прежде чем переключить внимание на бедренные сосуды для венозного доступа и инвазивного мониторинга артериального давления. Бедренная артерия идентифицируется по ощущению пульса в бороздке между мышцами сарториуса и грацилиса, а вена может быть найдена только медиальной к артерии.
- Пока поросенок лежит в спинном лежачем положении, стерилизуйте область паха с помощью повидона-йода и этанола и нанесите драпировку соответствующего размера.
- Используйте хирургический клинок для создания продольного разреза 3-4 см, начинающегося в паховой складке и распространяющегося дистально вдоль бедренного канала.
- Применяют тупое и острое рассечение, используя комариные изогнутые щипцы и ножницы, соответственно, для рассечения до уровня бедренного нервно-сосудистого пучка. Пучок можно найти глубоко в теле мышцы грациллы27. По окружности рассекайте бедренную артерию и вену в течение 2-3 см, чтобы обеспечить канюляцию. При необходимости сажайте небольшие боковые ветви.
- Нанесите шелковый галстук 3.0 как на артерию, так и на проксимальный и дистальный концы вены, чтобы применить тракцию. Завяжите дистальный шелковый шов как на вене, так и на артерии, перевязав сосуды.
- Начиная с бедренной вены, поддерживайте дистальное и проксимальное вытяжение на шелковых стяжках, а затем используйте пару микроножек для создания венотомии.
- Затем используйте венозный катетер для вскрытия сосуда, вставляя предварительно измеренный полиуретановый катетер с внутренним диаметром х наружным диаметром 0,86 мм х 1,32 мм. После введения завяжите проксимальный шелковый шов 3.0, чтобы закрепить катетер. Промыть катетер 3 мл гепаринизированного солевого раствора (1 Ед/мл). Этот раствор может быть получен путем добавления 0,5 мл гепарина к 50 мл обычного физиологического раствора.
- Вставьте инвазивный катетер артериального давления, используя тот же подход, что и выше, чтобы создать артериотомию и передать катетер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание дистального и проксимального вытяжения имеет важное значение для минимизации кровопотери при доступе к артерии.
- После того, как катетеры закреплены, накройте участок пропитанной физиологическим раствором марлей, и при необходимости кожу можно зашить с помощью шелкового шва 3.0 для предотвращения инфекции.
6. Поддержание анестезии, жидкости и газов крови
- Контролируйте глубину анестезии на протяжении всего эксперимента, используя тонус челюсти и пальпебральный рефлекс, и вводите α-хлоралозу внутривенно, по мере необходимости для поддержания животного под глубоким наркозом. Используйте начальную нагрузочную дозу 50 мг/кг и 20 мг/кг для дальнейших болюсов.
- Вводят лактат рингера со скоростью 4 мл/кг/ч на протяжении всего эксперимента в качестве поддерживающей жидкости. Например, если вес поросенка составляет 3 кг, то скорость инфузии жидкости составляет 12 мл/ч.
- Для анализа прикроватного газа возьмите образец артериальной крови в гепаринизированном газовом шприце крови и представьте образец анализатору. Выберите вариант газообразной артериальной крови и подождите ~ 2-3 с, пока анализатор представит иглу для забора крови.
- Осторожно вставьте иглу в конец шприца, содержащего образец крови. Подождите, пока анализатор аспирирует необходимый образец и вытащит шприц. Позвольте машине проанализировать газ крови и представить результаты.
- Основываясь на результатах, отрегулируйте вентилятор для поддержания рН между 7,35--7,45, парциальное давление углекислого газа (PCO2) между 35-45 мм рт.ст. и парциальное давление кислорода (PaO2) между 80-150 мм рт.ст. Настройки различаются в зависимости от типа вентилятора, но в значительной степени включают увеличение или снижение частоты дыхания с использованием соответствующих ручек для компенсации гипоксии и / или гиперкапнии.
- Втяните 3 мл крови в светло-зеленую трубку (литий-гепарин). Центрифугируют образец при 2000 хг в течение 15 мин, выдерживают при 4 °C для извлечения плазмы. После завершения плазма может быть немедленно проанализирована на уровень креатинина в сыворотке крови с помощью прикроватного химического анализатора или сохранена при -80 °C для последующего анализа.
- Непрерывно контролируйте температуру с помощью ректального зондового термометра и регулируйте температуру грелки для поддержания температуры поросят от 101 до 103 ° F.
7. Экспериментальная группа; перевязка и перфорация слепой кишки (CLP) 25,28,29
ПРИМЕЧАНИЕ: Для поросят в экспериментальной группе выполните CLP, чтобы вызвать полимикробный сепсис28 и наблюдайте за животным в течение 12 часов после операции, чтобы дать достаточно времени для тяжелого сепсиса. Трансдермальная запись СКФ начинается через 8 ч после перевязки цекаля, чтобы обеспечить 4 ч записи.
- Используйте хирургическое лезвие для создания 5-6 см левого парамедианного вертикального разреза, так как слепая кишка у свиней лежит в левой паралюмбальной ямке30. Рассекайте слои брюшной стенки, избегая травмирования поверхностных эпигастральных сосудов.
- Как только брюшиный слой разрезан, используйте втягивающее устройство для улучшения доступа к внутрибрюшным структурам.
- Определите спиральную толстую кишку в верхнем левом квадранте живота. Проследите спиральную толстую кишку, каудально и дорсально, чтобы найти слепую кишку. Подвздошная кишка соединяется со спиральной толстой кишкой у основания слепой кишки.
- Вживите слепую кишку только дистальнее илеоцекального соединения (рисунок 1).
- Используя иглу 18 г, сделайте семь проколов в слепой кишке и выдавите кал в область брюшины.
- Закройте живот слоями шелковым швом 3,0, используя либо простые прерванные, либо непрерывные швы. Степлер также может быть использован для закрытия слоя кожи, если таковой имеется.
8. Фиктивная группа
- Выполните действия 7.2-7.4, как описано выше. После идентификации слепой кишки поместите ее обратно нетронутой и аналогичным образом закройте брюшную стенку.
- Контролируйте поросят в фиктивной группе в течение 12 ч, чтобы устранить любую путаницу, связанную с длительным воздействием анестезии.
9. Настройка трансдермального устройства СКФ
- После 8 ч перевязки слепой кишки приготовьтесь начать трансдермальное измерение СКФ.
- Используйте программное обеспечение службы MB версии 3.0 для настройки частоты дискретизации на устройстве GFR. Вкратце, подключите трансдермальное устройство GFR к программному обеспечению компьютера с помощью разъема USB. Откройте программное обеспечение, нажмите кнопку «Подключить» и установите время на 4000 мс. Нажмите кнопку Записать , чтобы сохранить настройки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это дает до 6 ч общего времени выборки. У свиней трансдермальная СКФ завершается через 4 ч. Для экспериментов, требующих отбора проб продолжительностью до 12 ч, выберите параметр 8000 мс.
- Прикрепите к устройству двухсторонние клеевые пластыри с прозрачным окном. Прикрепите устройство к одной стороне, гарантируя, что светодиод перекрывает прозрачное окно, чтобы обеспечить обнаружение индикатора.
- Сбрить область, покрывающую боковую грудную стенку. Прикрепите батарею к устройству и немедленно приклейте клейкий пластырь к устройству на месте и убедитесь, что оно хорошо закреплено (рисунок 2). Поскольку поросята глубоко обезболены, лента может быть ненужной для удержания устройства на месте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одного клеевого пластыря достаточно для закрепления. Тем не менее, в процедурах, где животное будет манипулироваться, становиться активным или где анестезия может быть нарушена, может быть важно применить ленту. Повязка также может быть альтернативным подходом31.
- Базовая запись за 3-5 мин требуется перед введением FITC-синистрина.
10. FitC-синистрин препарат и инъекции
- Приготовьте смесь FITC-синистрина с физиологическим раствором до конечной концентрации 50 мг/мл. Доза, вводимая поросенку, составляет 20 мг/кг. FITC-синистрин поставляется в виде порошка.
ПРИМЕЧАНИЕ: FITC-синистрин также может вводиться через периферический венозный катетер, вставленный в ушную вену. Важно достичь высокого пикового уровня путем введения FITC-синистрина в виде толчкового болюса через венозный катетер бедренной вены.
- Прикрепите шприц с лекарством к одной стороне трехстороннего стоп-петуха и солевым смывом с другой стороны стоп-петуха. Нажмите FITC-синистрин и сразу же нанесите болюс из 5 мл физиологического раствора, прежде чем закрыть трехсторонний стоп-петух к вене поросенка.
11. Трансдермальная запись СКФ
- Держите устройство прикрепленным к поросенку в течение 4 ч. В течение этого времени держите поросенка под наркозом, используя прерывистые дозы α-хлоралозы в концентрации 20 мг / кг, чтобы избежать каких-либо артефактов движения.
- По истечении 4 часов извлеките устройство и немедленно отсоедините аккумулятор.
12. Измерение СКФ
- Подключите трансдермальное устройство GFR к компьютеру с помощью разъема USB, предоставленного поставщиком.
- Откройте программное обеспечение для чтения, чтобы получить данные с устройства. Сохраните необработанные данные, щелкнув последовательность: подключение, чтение, переименование и сохранение. В соответствии с инструкциями в руководстве, обработайте и оцените сохраненные данные в программном обеспечении для анализа.
- Вкратце, откройте программное обеспечение версии 3.0 и импортируйте данные. Отрегулируйте смещение, начальную и конечную позиции с помощью автоматических маркеров. При необходимости удалите артефакты и нажмите кнопку «Подгонка». Это дает показания, которые показывают клиренс FITC-синистрина в минутах (t1/2). T1/2 впоследствии используется для расчета ТРК32,33 следующим образом:

ПРИМЕЧАНИЕ: В консультации с производителем коэффициент преобразования, используемый для свиней, составляет 20 (что указывает на то, что 20% массы тела составляет внеклеточное пространство), в отличие от 21,33 у крыс (т СКФ в мл/мин) и 14 616,8 у мышей (тГФ в мкл/мин). Это связано с тем, что СКФ точно измеряется как функция внеклеточной жидкости34,35, которая, в свою очередь, зависит от массы тела36.
13. Эвтаназия поросят
- Собрать 3 мл крови через 12 ч CLP для дальнейшего биохимического анализа.
- Усыпляют поросенка путем введения 0,2 мл/кг предварительно смешанной смеси 20% пентобарбитала натрия и фенитоина натрия внутривенно.
- Заготовьте правую почку для гистопатологического исследования, прежде чем отвезти поросенка в морг.