Метод изучения токсичности и агрегации α-синуклеина с использованием гуманизированной дрожжевой модели

Summary

Физиологическая модель in vivo α-синуклеина необходима для изучения и понимания патогенеза болезни Паркинсона. Описан метод мониторинга цитотоксичности и агрегатного образования α-синуклеина с использованием гуманизированной дрожжевой модели.

Abstract

Болезнь Паркинсона является вторым наиболее распространенным нейродегенеративным расстройством и характеризуется прогрессирующей гибелью клеток, вызванной образованием клеток Леви, содержащих неправильно свернутые и агрегированные α-синуклеин. α-синуклеин является обильным пресинаптическим белком, который регулирует торговлю синаптическими пузырьками, но накопление его белковых включений приводит к нейротоксичности. Недавние исследования показали, что различные генетические факторы, включая бактериальные шапероны, могут уменьшить образование α-синуклеиновых агрегатов in vitro. Тем не менее, также важно контролировать антиагрегационный эффект в клетке, чтобы применять его в качестве потенциального лечения для пациентов. Было бы идеально использовать нейронные клетки, но с этими клетками трудно обращаться и требуется много времени, чтобы продемонстрировать фенотип антиагрегации. Поэтому для дальнейшей оценки антиагрегационной активности in vivo требуется быстрый и эффективный инструмент in vivo . Описанный здесь метод использовался для мониторинга и анализа антиагрегационного фенотипа в гуманизированных дрожжах Saccharomyces cerevisiae, которые экспрессировали человеческий α-синуклеин. Этот протокол демонстрирует инструменты in vivo , которые могут быть использованы для мониторинга клеточной токсичности, вызванной α-синуклеином, а также образования агрегатов α-синуклеина в клетках.

Introduction

Болезнь Паркинсона (БП) является серьезной проблемой для стареющих обществ во всем мире. Агрегация α-синуклеина тесно связана с БП, а белковые агрегаты α-синуклеина широко используются в качестве молекулярного биомаркера для диагностики заболевания¹. α-синуклеин представляет собой небольшой кислый белок (140 аминокислот в длину) с тремя доменами, а именно N-концевым липидсвязывающим α-спирали, амилоид-связывающим центральным доменом (NAC) и С-концевым кислотным хвостом². Неправильное сворачивание α-синуклеина может происходить спонтанно и в конечном итоге приводит к образованию амилоидных агрегатов,....

Protocol

1. Подготовка носителей и решений

1. Подготовка СМИ
   1. Для приготовления среды YPD растворите 50 г порошка YPD в dH_2O, чтобы получить конечный объем 1 л. Автоклав для стерилизации. Хранить при комнатной температуре (RT).
   2. Чтобы сделать агар YPD средой, растворите 50 г порошка YPD и 20 г агара в 1 л dH₂O. Автоклав для стерилизации. После остывания вылейте на чашку Петри. Хранить при температуре 4 °C.
   3. Для получения СК с рафинозной (SRd)-Ura средой растворяют 6,7 г азотистого основания дрожжей с сульфатом аммония и без аминокислот в 795 мл dH₂O. Автоклав для стерилизации. Добавьте 100 мл 20....

Results

Известно, что высокая экспрессия α-синуклеина связана с гибелью нейрональных клеток и БП в модельных системах БП. В данном исследовании описаны три метода мониторинга цитотоксичности α-синуклеина и образования очагов агрегированного α-синуклеина в дрожжах. Здесь α-синуклеин был чрезмерно экспрессирован в дрожжах, и были исследованы фенотипы α-синуклеина дикого типа и трех вариантов α-синуклеина, известных как семейные мутанты БП (рисунок 1 и Таблица материалов).

Discussion

Учитывая сложность различных клеточных систем у человека, выгодно использовать дрожжи в качестве модели для изучения нейродегенеративных заболеваний человека. Хотя почти невозможно исследовать сложные клеточные взаимодействия человеческого мозга с использованием дрожжей, с точки зрения одноклеточных клеток дрожжевые клетки имеют высокий уровень сходства с клетками человека с точки зрения гомологии геномной последовательности и фундаментальных эукариотических клеточных процессов ^8,13

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 луночная пластина	SPL	30096
Agarose	TAESHIN	0158
Bacto Agar	BD Difco	214010
Breathe-easy	диверсифицированная биотехнологическая	BEM-1	Газопроницаемая уплотнительная мембрана для микротитровальных пластин
крышка стекла	Marienfeld		24 x 60 мм
		40014
Cuvette	ratiolab	2712120
D-(+)-Галактозе	сигма	G0625
D-(+)-глюкоза	сигма	G8270
D-(+)-Рафинозный пентагидрат	Daejung	6638-4105
Инкубатор (встряхивание)	Модель лабтрона		: SHI1
Инкубатор (статический)	Зрение научное		модель: VS-1203PV-O
LiAc	sigma	L6883
Микропланшетный считыватель	Tecan	30050303 01	Модель: Infinite 200 pro
многоканальный пипетка 20-200 &; L	gilson	FA10011
многоканальный дозатор 2-20 &; Л.	Гилсон	FA10009
микроскоп	Olympus	Olympus IX-53
PEG	sigma	P4338	средний моль 3,350
Petridish	SPL	10090
pRS426			Кристиансон, Т. В., Сикорски, Р. С., Данте, М., Шеро, Д. Х. & Хитер,. Многофункциональные челночные векторы дрожжей с высоким числом копий. Ген. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 промотор &альфа;-синуклеин A30P			Outeiro, T. F. & Линдквист, С. Дрожжевые клетки дают представление о биологии альфа-синуклеина и патобиологии. Наука. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 промотор α-синуклеин A53T			Outeiro, T. F. & Линдквист, С. Дрожжевые клетки дают представление о биологии альфа-синуклеина и патобиологии. Наука. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 -промотор &альфа;-синуклеин E46K			Outeiro, T. F. & Линдквист, С. Дрожжевые клетки дают представление о биологии альфа-синуклеина и патобиологии. Наука. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 -промотор &альфа;-синуклеин WT			Outeiro, T. F. & Линдквист, С. Дрожжевые клетки дают представление о биологии альфа-синуклеина и патобиологии. Наука. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
Резервуар	SPL	23050
Спектрофотометр	eppendorf	6131 05560
W303a			Присутствует от Джеймса Бардуэлла
Дрожжевая азотная основа без аминокислот	Difco	291940
Дрожжи синтетическая среда для выпадения добавок без урацила	сигма	Y1501
YPD	Condalab	1547.00